¡Descarga tema 1 microbiología y más Apuntes en PDF de Microbiología solo en Docsity!
TEMA 4: Cultivo de los microorganismos en el laboratorio La nutrición es el proceso por el que los microorganismos toman del medio donde habitan las sustancias químicas que necesitan para creces. Dichas sustancias se denominan nutrientes y son necesarios para conseguir energía y realizar los procesos de biosíntesis. La nutrición microbiana consiste en aportar a las células los compuestos químicos que necesitan para la síntesis de monómeros, que son los componentes de las macromoléculas, que a su vez construyen las estructuras celulares. Los nutrientes se pueden clasificar según las cantidades en que son requeridos como macronutrientes (C, N, O, H, P…) y micronutrientes o elementos traza (Cr, Co, Cu, Mn…). En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados formando parte de sustancias orgánicas o inorgánicas. Algunos de los nutrientes serán incorporados para construir macromoléculas y estructuras celulares; otros solo sirven para la producción de energía y no se incorporan directamente como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles. La fuente de energía utilizada (lumínica o química) y los factores de crecimiento (vitaminas, purina y pirimidinas, aminoácidos…) también son nutrientes Las células están compuestas por: Macromoléculas: polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos y proteínas Agua, que es el solvente ideas para los organismos vivos debido a su polaridad y a su cohesión. Agua: desde el punto de vista de sus posibles papeles, el agua es el principal componente del protoplasma bacteriano, el medio donde suceden las reacciones químicas y un reactante en exceso (producto resultante de algunas reacciones bioquímicas) Los microorganismos necesitan grandes cantidades de agua, ya que requieren cierto grado de humedad para crecer. La disponibilidad se mide por un parámetro denominado actividad de agua (aw) o potencial de agua, que es la relación entre la presión de vapos de agua del sustrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del agua pura (Po). Los valores normales oscilan entre 0,9-0,
aw
P
P 0
Carbono: es el elemento más abundante en las macromoléculas. Constituye el 50% del peso seco de las células. Según cuál sea la fuente de carbono, podemos distinguir entre dos tipos de organismos procariotas: Muchos son heterótrofos, es decir, que necesitan algún tipo de compuesto orgánico como fuente de carbono para hacer nuevo material celular. Los aminoácidos, los ácidos grasos, los ácidos orgánicos, los azúcares, las bases nitrogenadas, los compuestos aromáticos y otros, pueden ser utilizados por las bacterias Algunos son autótrofos, es decir, capaces de construir todas sus estructuras orgánicas a partir del CO 2 con la energía obtenida de la luz o de compuestos inorgánicos Fósforo: elemento que se usa para síntesis de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos, pero aparece también en coenzimas y proteínas. Suele requerirse en forma de
fosfatos, que pueden ser orgánicos o inorgánicos. Las bacterias que pueden usar los fosfatos orgánicos (poseen fosfatasas) no dependen absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos. Los fosfatos orgánicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o, en las gram-negativas, periplásmicas Nitrógeno y Azufre: estos elementos son requeridos por todos los seres vivos. Se encuentran en la célula en estado reducido: o El radical –NH 2 forma parte de los aminoácidos y de las bases nitrogenadas o El radical –SN interviene en determinados aminoácidos y en coenzimas como la CoA La mayoría de las bacterias fotosintéticas y muchas heterótrofas asimilan estos elementos en forma combinada inorgánica oxidada como (NO 3 o SO 4 ). Muchas bacterias heterótrofas pueden usar alguna forma reducida de N orgánico (NH 4 +), de S inorgánico (S2-, SH-), de N orgánico (aminoácidos, péptidos) o de S orgánico (cisteína). Algunas bacterias pueden usar N 2 de la atmósfera mediante la fijación biológica del N Sales minerales: son la fuente de aniones y cationes para célula. Los siguientes cationes se necesitan en cantidades relativamente grandes: K+, Mg++, Ca ++, Fe ++ o El ión potasio interviene en la activación de una variedad de enzimas, incluyendo las que participan en la síntesis de proteínas. En gram-positivas está asociado a los ácidos teicoicos de la pared o El ión magnesio estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucéicos, actúa como cofactor en muchas reacciones, especialmente en las que implican transferencia de grupos fosfato. Participa con las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintéticas. o El ión calcio es un cofactor de ciertas enzimas, como las proteinasas Hierro: Forma parte de muchas moléculas implicadas en procesos de respiración, como citocromos y ferroproteínas no hémicas (proteínas con Fe-S), además, interviene como cofactor en ciertas enzimas. El hierro (prinicpalmente como ión ferroso) suele estar acomplejado en la naturaleza, formando sales insolubles. Las bacterias disponen de una serie de moléculas, denominadas sideróforos, capaces de captar ese hierro Micronutrientes o elementos traza: las bacterias necesitan minúsculas cantidades de otros elementos o El manganeso (Mn) es un cofactor de ciertas enzimas, y a veces puede sustituir al ión Mg o El cobalto (Co) se requiere casi exclusivamente para la vitamina B o El zinc (ZN) interviene en la estabilización de complejos enzimáticos como las ADN y ARN-polimerasas o El molibdeno (Mo) participa en las llamadas molibdoflavoproteínas, implicadas en la asimilación de nitratos. También participa como cofactor en el complejo nitrogenasa o El níque (Ni) participa en hidrogenasas, enzimas que captan o liberan H 2 Factores de crecimiento: son moléculas orgánicas específicas que, en pequeñas cantidades, algunas bacterias necesitan para crecer. Son vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas…
- Según la naturaleza de sus constituyentes o Medios naturales o complejos (indefinidos): Están constituidos por hidrolizados de proteínas y otras sustancias muy nutritivas pero no definidas químicamente que se pesan y se añaden a un volumen conocido de agua. No se conoce la composición exacta del medio complejo. o Medios sintéticos (químicamente definidos): Se preparan añadiendo cantidades precisas de compuestos orgánicos e inorgánicos químicamente puros a un volumen conocido de agua destilada. y por lo tanto, se puede conocer exactamente su composición cualitativa y cuantitativa. Por su alto costo sólo se emplean en procedimientos especiales. - Según su propósito de uso en el laboratorio o Medios generales o Medios de enriquecimiento: es un cultivo que contiene sustancias que favorecen el crecimiento del microorganismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento de los otros tipos de microorganismos presentes. La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está determinada únicamente por la composición química, sino que puede ser variada significativamente modificando otros factores tales como: temperatura, pH, fuerza iónica, iluminación, aireación etc. o Medios selectivos o inhibitorios: medios que contienen, además de los nutrientes, ciertas sustancias que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos permitiendo el crecimiento de otros o cuya composición permite el desarrollo de un grupo determinado. Se diferencian de los enriquecidos porque están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. Ejemplo: agar-antibióticos o Medios diferenciales: Son medios destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Contienen indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los microorganismos sobre algunos de los componentes del medio. Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar fermentación de carbohidratos Aislamiento de cultivos puros de microorganismos (transferencia aséptica, siembra en placa por extensión; en estrías; y en profundidad, morfología y crecimiento de las colonias) Es importante cultivar microorganismos ya que nos permiten obtener cultivos puros, realizar un análisis morfológico, fisiológico, genético u observar otras características, contar las colonias o para producir un tipo determinado de bacterias. Existen otros métodos especiales de cultivo: siembra en superficie sobre medio sólido, siembra en profundidad (vertido en placa) y las diluciones
Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población mixta. En habitats naturales, raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro. Existen dos tipos de aislamiento:
- Aislamiento directo: se logra a partir de una muestra cuando el o los microorganismos están en una proporción adecuada, se realiza por estrías (agotamiento) con o sin dilución previa de la muestra (suelo, alimentos), en medio sólido
- Aislamiento por enriquecimiento: Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en la muestra, se incluye una primera etapa que consiste en sembrar la muestra en medio líquido. Luego de varios pases se aisla por la técnica de agotamiento en estría. Transferencia aséptica: Consiste en una serie de procedimientos que evitan la contaminación durante la manipulación de los cultivos y de los medios de cultivo estériles. Es uno de los primeros métodos que tiene que dominar un microbiólogo. El método para ello es: o Se calienta el asa de siembra hasta incandescencia y se deja enfriar o El tubo se destapa o Se pasa el extremo del tubo por la llama o Se extrae la muestra con el asa esterilizada o Se vuelve a flamear la boca del tubo y la muestra se deposita en un medio estéril o Se vuelve a tapar el tubo y se calienta el asa de nuevo al final Siembra en estrías: Gracias a este procedimiento se consiguen una crecimiento de colonias confluentes de la siembra por estría y unas colonias aisladas al final de la siembra por estría o Se esteriliza el asa y luego se toma una muestra del tubo o Se realiza una siembra por estría en una placa de agar con medio estéril. Después de una estría inicial se hacen estrías en ángulo Dilución y siembra por extensión en superficie y en profundidad Cultivo puro de colonias: Las colonias se describen por examen macroscópico en función del tamaño, la forma, el borde, la elevación, la transparencia y el color. Esto resulta a veces muy útil en la identificación. A partir de colonias aisladas en medio de cultivo se realiza un examen microscópico que debe mostrar células razonablemente semejantes respecto al Gram y a la morfología. Las colonias aisladas deben aislarse nuevamente en medio no selectivo por el método de estrías. Esto se conoce como reaislamiento. Las colonias son masas visibles de células que se forman por división de una o varias células. El desarrollo de colonias sobre superficies de agar permite al microbiólogo identificar las bacterias porque las especies forman a menudo colonias con una forma y aspecto característico. El tamaño, forma, textura y color de una colonia es propio de cada organismo. La morfología de la colonia de una bacteria puede variar según el medio en que crezca la bacteria.
