TEMA 2. Microscopia y tinciones.
un microscopio, es un instrumento óptico destinado a la observación de objetos muy
pequeños que no pueden observarse a simple vista. Los microscopios nos pueden aportar
información muy diversa:
- Morfología: microscopio óptico o microscopio electrónico de barrido (SEM).
- Estructura: microscopia óptica o microscopio electrónico de transmisión (TEM).
- Composición: por SEM o TEM de espectroscopia de Rayos X.
Para obtener una buena imagen dependemos del aumento, del contraste y de la resolución.
- Aumento: se da por lentes convexas más gruesas por el medio que por los extremos y
desvían ondas luminosas que llegan a el objetivo y atraviesan la muestra debido a la
refracción, es un fenómeno por el cual una onda luminosa modifica tanto la velocidad
como la dirección cuando atraviesa el vidrio con diferente índice de refracción mayor,
originando un punto focal (donde inciden todos los haces luminosos). A menor
distancia focal (de lente a punto focal) más aumento de la imagen.
Oculares con aumento de 10x o 15x y objetivos con aumentos de 10,40,100x con lo
cual como máximo obtendremos 1500 aumentos.
- Contraste: diferencias de intensidad de la luz, que nos permite apreciar que una onda
de la imagen es diferente de otra. La mayoría de los organismos carecen de color. Hay
2 formas de aumentar el contraste, por uso de colorantes o por modificaciones en el
microscopio.
- Resolución: el poder de resolución de un microscopio a la menor distancia de 2 puntos
adyacentes que pueden ser percibidos por separados uno de otro. Este depende del
tamaño de la lente de aumento, la longitud de onda de la luz y el índice de refracción
del material. Este viene determinado por la apertura numérica por n senx, n es el
índice de refracción que cambiará según el medio y x es la mitad del ángulo del cono
de luz que entra en el objetivo.
Preparaciones y tinciones de las muestras:
Los colorantes son componentes químicos que van a unirse a estructuras por enlaces
iónicos, covalentes o hidrofóbicos. Hay colorantes básicos, que están cargados
positivamente y se unen a estructura cargadas negativamente (azul de metileno, fucsina
básica, safranina, verde malaquita) y con los colorantes ácidos es a la inversa (eosina, rosa
de bengala, fucsina acida).
Existen 3 grandes grupos de tinciones:
- Simples
- Diferenciales
- Especificas
La fijación de la muestra tiene como objetivo conservar la morfología de la muestra y su
adhesión al portaobjetos mediante un frotis/ calor o agentes químicos, tales como
aldehídos o etanol entre otros.
- Tinción simple: uso de un único colorante. Se lleva a cabo la expansión sobre un
portaobjetos, se seca al aire y se lleva a cabo la fijación ya sea por medio de un frotis o
por agentes químicos. Posteriormente se añadirá el colorante y se deja actuar durante
