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TEMA 9: EL CRECIMIENTO MICROBIANO
9.1. El crecimiento microbiano
En Microbiología la medida del tamaño celular no tiene casi importancia, no así la medida del tamaño de la población celular. Podremos hablar del crecimiento individual de cada célula microbiana pero también de un crecimiento poblacional. En este tema abordamos el crecimiento microbiano refiriéndonos a la población global, es decir, al aumento del número de células.
Una de las ventajas del pequeño tamaño de los microorganismos es su elevada relación S/V. Cuando las células crecen su relación S/V disminuye haciendo menos eficientes ciertos procesos como el transporte de nutrientes, la excreción de productos de desecho y por ello la velocidad de su metabolismo. Esto obliga a las células a dividirse. La división de una célula microbiana puede realizarse de diversas maneras pero, en general, puede resumirse en dos: Bipartición (incluida gemación) y crecimiento apical.
Bipartición
Crecimiento apical
Gemación
Yema
Cicatriz de gemación
En Microbiología la expresión del crecimiento celular se puede realizar de 2 formas: ► Densidad microbiana : Biomasa celular / Volumen celular ► Concentración celular : Biomasa celular / Volumen de la suspensión celular
En base a estos dos parámetros se distingue entre: ►► Crecimiento equilibrado: Debido a que existen todos los nutrientes y factores de crecimiento necesarios se produce: -Aumento de biomasa celular. -Síntesis de todos los componentes celulares. -División celular (el ciclo celular se completa). Entonces la densidad microbiana es constante y la concentración celular aumenta.
►► Crecimiento desequilibrado: Debido a la falta de algún compuesto esencial necesario para la célula se produce: -Aumento de biomasa celular. -Algunos componentes celulares no se sintetizan. -No hay división celular (el ciclo celular se interrumpe en algún punto). Entonces el volumen celular aumenta pero la concentración celular es constante y la densidad celular disminuye.
v (^) v (^) v
v v^ v^ v/^2
v
v
c) Recuento de viables en placa: Consiste en diluir la muestra mediante un banco de diluciones y sembrar un volumen determinado en placas Petri con el medio de cultivo apropiado. Tras la incubación se procede a contar el número de colonias presentes. El recuento se expresará en Nº de UFC/ml.
d) Recuento del Número Más Probable : Consiste en la siembra de diferentes cantidades de inóculo en tubos con medio de cultivo líquido. Tras incubar, se cuenta el número de tubos que presentan crecimiento. Con esos datos se recurre a las tablas de NMP (ANEXO) y estas indican el número más probable de microorganismos viables en la muestra de partida con un intervalo de confianza (método estadístico).
e) Cell Counter : Consiste en un electrodo que presenta un poro (tamaño calibrable), a través del cual se hace pasar la suspensión microbiana. El paso de un microorganismo por el poro provoca un cambio en la diferencia de potencial establecida entre los dos polos del electrodo. Este cambio es interpretado como el paso de un microorganismo y es registrado.
f) Medida de la turbidez (densidad óptica). Las células microbianas, al ser partículas en suspensión, son capaces de dispersar la luz. A más número de células mayor es la dispersión. Por tanto, haciendo uso de un colorímetro podremos evaluar el crecimiento de la población. Las longitudes de onda usadas están comprendidas entre 500 y 600 nm.
g) Valoración de nitrógeno proteico. La proporción de nitrógeno proteico en la biomasa es muy constante. Si hidrolizamos un cultivo con ácido clorhídrico se produce una reacción que libera amonio que puede ser valorado mediante el método de Kjeldahl.
Proteína + HCl → CO 2 + NH 4 +
h) Valoración de ADN. Mediante la obtención del ADN del cultivo y su posterior valoración espectrofoto- métrica a 260 nm.
T=0 T=8h
Kjeldahl
A
260 <<<<<< A
MÉTODOS INDIRECTOS
N=2n·No X=2n·Xo Aplicando log. neperianos Ln X=Ln 2n^ + Ln Xo Ln X= n·Ln 2 + Ln Xo Ln X= (t/tg)·Ln 2 + Ln Xo
Vamos a generalizar la ecuación sustituyendo N (número de células) por X (biomasa/DO…) y la haremos lineal (logaritmos). Posteriormente definiremos una constante que exprese la velocidad de crecimiento por unidad de biomasa que llamaremos TASA ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO (μ).
Ln X – Ln Xo= t· Ln 2 tg
μ = dX dt·X
dX = μ dt X Aplicando integrales^
dX = μ dt ∫ (^) X ∫^ Ln X – Ln Xo= μ · t (^) Ln X = Ln Xo + μ · t
X = Xo eμt
Por otro lado, definimos la TASA ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO ( μ ) como la variación de la biomasa ( dX ) ocurrida en una variación (intervalo) de tiempo ( dt ) en función de la biomasa existente ( X ).
μ= Ln tg
cte. para cada cultivo.
Ecuación general del crecimiento microbiano
t (h) t (h)
X (^) X = Xo eμt Ln X (^) Ln X = Ln Xo + μ · t
Y = a + b· X
Ecuación de una recta
μ
n = t / tg
n, número de generaciones tg, tiempo de generación t, tiempo total
UNIDADES: μ [h-1]
EJEMPLOS:
- Calcular la tasa específica de crecimiento y el tiempo de generación de las bacterias de un cultivo que evoluciona en 120 min desde una DO 550 de 0.1 a 0.78.
- Representa en papel semilogarítmico la evolución de una población de levaduras que se desarrolla en un medio de cultivo durante 17 horas. Se muestran las medidas de DO 600. Calcular μ y tg. (MÉTODO RECOMENDADO)
Ln X = Ln Xo + μ · t
Ln DO
0 1 2 3 4 t (h)
Ln 0.78 = Ln 0.1 + μ · 2 -0.25 = -2.3 + μ · 2
2.05 = μ · 2 μ= 1.025 h- μ= Ln tg
tg= 40.5 min
t(h) DO 0 0. 1 0. 2 0. 3 0. 4 0. 5 0. 6 1. 7 1. 8 1. 9 1. 10 1. 11 1. 12 1.75 (^) 0.
0.7^ 0.
0.9^ 1.
2
3 t(h) DO 13 1. 14 1. 15 1. 16 1. 17 2.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 t (h)
DO
1º Representar 2º Establecer los puntos en fase exp. 3º Calcular la ecuación de la recta (mínimos cuadrados) con los puntos. 4º Con la pendiente calcular μ.
y=-2.7+0.46 t R^2 = 0.
μ=0.46 h-
tg= 1.5 horas
Tiempo
(h)
Biomasa
DO600nm
- En un fermentador tenemos una levadura creciendo exponencialmente
sobre un medio de cultivo. Durante el desarrollo del cultivo se obtienen los
siguientes resultados experimentales de determinación de la biomasa
respecto al tiempo:
a) Representa los datos y calcula los parámetros cinéticos de crecimiento (tasa
específica de crecimiento y tiempo de generación).
b) En base a los parámetros anteriores y a su base biológica ¿Cómo se define y
a qué se debe la cinética que los datos experimentales del problema describen?
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Crecimiento
diáuxico
9.4. La ecuación de Monod
La ecuación anterior relaciona la velocidad de crecimiento en función del tiempo (Ln X = Ln Xo + μ · t). En un medio de cultivo ideal, sin ninguna limitación de nutrientes, la tasa específica de crecimiento alcanzará su valor máximo (μ= μmax) para ese μ.o. en ese medio. Es decir, estaremos en un caso de crecimiento equilibrado y no restringido. En él todos los sistemas de transporte de nutrientes funcionan a su máxima capacidad y el μ.o. crece sin limitaciones.
Sin embargo, existen medios en los cuales existe un nutriente limitante (normalmente relacionado con que los sistemas transportadores de nutrientes trabajan por debajo de su capacidad máxima). En este caso tenemos un crecimiento equilibrado y restringido de modo que el crecimiento real es inferior al máximo (μ< μmax). Esta situación la recoge la ECUACIÓN DE MONOD:
μ = μmax [S] Ks + [S]
[nutriente limitante]
Tasa de crecimiento
[S]: concentración de nutriente limitante Ks : constante de saturación. Es la concentración de nutriente que genera una μ que es la mitad de la μ máxima.
La ecuación de Monod es análoga a la ecuación de Michaelis-Menten de cinética enzimática, indicando que la tasa de crecimiento es una función hiperbólica de la concentración de nutriente limitante. El nutriente limitante puede ser una fuente de carbono y/o energía, una fuente de nitrógeno, fosfato, una vitamina, un factor de crecimiento…Los valores de Ks son muy bajos (Ej: en E. coli, Ks para glucosa es 10-6^ M, para el triptófano es 2·10-7^ M) esta es una razón de adaptación evolutiva a los medios muy diluidos en los que se desarrollan normalmente los microorganismos ya que las permeasas transportadoras de nutrientes de las membranas presentan una afinidad muy elevada por los sustratos que transportan.
μmax/
Crec. no restringido
Crec. restringido
9.6. El rendimiento y la tasa específica de consumo de sustrato
Los microorganismos se desarrollan en los medios de cultivo consumiendo los nutrientes de los mismos. La relación existente entre el aumento de biomasa y el consumo simultaneo de nutrientes lo determina un parámetro denominado FACTOR DE RENDIMIENTO (Y) (Ys) (Yx/s).
Su expresión matemática es: dX -Ys · dS El aumento de la biomasa en un intervalo de tiempo es proporcional a la disminución de sustrato en el mismo intervalo. El factor de proporcionalidad es el rendimiento (Ys).
UNIDADES: dX - Ys (^) → [Ys] : [g biomasa/g sustrato] ó [g/mol] ó [%]
El rendimiento es un parámetro que varía mucho entre microorganismos, en general, podemos decir que depende de factores como:
- La fuente de carbono y energía (algunas son más accesibles que otras, algunas necesitan una hidrólisis previa con gasto de energía, etc.)
- La propia eficiencia metabólica del microorganismo (no es igual de rentable energéticamente una respiración aerobia que una fermentación).
Si tomamos de nuevo la ecuación anterior y la dividimos por la biomasa (X) que exista en un momento concreto:
μ = Y · q ECUACIÓN DE CRECIMIENTO EXPONENCIAL EQUILIBRADO (O BALANCEADO).
UNIDADES: μ [h-1] Y [g biomasa · g-1^ sustrato] Se denomina Ec. de crec. exp. equilibrado porque los parámetros van a q [g sustrato · g-1^ biomasa · h-1] mantenerse constantes durante el crecimiento. Según la ecuación, un μ.o. cualquiera crece en función de dos parámetros independientes: Y , q Por ello, para una misma tasa de consumo, los que crecen rápido (μ↑) lo hacen a costa de un rendimiento alto (Y↑) y al contrario (μ - Y).
dt dt
dS
dt dt
dX -Ys · dS dt X dt X
dX 1 -Ys · dS 1
μ q (tasa específica de consumo de sustrato)
Yx/s = 85%
t (h)
X
[Sc]
Ejemplos: Crecimiento exponencial equilibrado Crecimiento exponencial desequilibrado
Ejemplos:
- Industrialmente, para producir biomasa de levadura de panadería las condiciones de cultivo requeridas favorecen que la levadura respire para así obtener mayor rendimiento y un consumo reducido. (Yx/s↑) ↔ (q).
- De forma contraria, para obtener etanol , las condiciones de cultivo favorecen la fermentación de la levadura, que es un metabolismo menos rentable y supone un consumo elevado. (Yx/s) ↔ (q↑).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 t (h)
0.7^ 0.
0.9^ 1.
2
X^3 [Sc]
Sustrato consumido
Biomasa producida
μ q
La existencia de una energía de mantenimiento ha sido demostrada, aunque no llega a explicar al 100% el desacoplamiento observado entre la producción de biomasa y la energía (ATP).
La existencia de una energía de mantenimiento se demostró de manera sencilla: se inoculó una cantidad de biomasa en un medio mínimo (sin glucosa) al que se le añadieron cantidades crecientes de glucosa. Se pudo observar que:
a. A concentraciones extremadamente bajas las células morían. b. Según se aumentaba la concentración de glucosa las células tardaban más en morir. c. A cierta concentración umbral de glucosa las células ni morían ni crecían d. Por encima de la concentración umbral las células comenzaban a crecer.
Así se llegó a conocer la energía de mantenimiento necesaria para que las células ni mueran ni crezcan sólo se mantengan. La ecuación matemática que considera esta energía se denomina ECUACIÓN DE PIRT:
(^1) = qm (^) · 1 Yg μ
Yg= rendimiento para cada concentración de glucosa qm= Energía de mantenimiento μ= Tasa espec. de crec. para cada conc. de glucosa
FIN TEMA 9
Ej: Energía de mantenimiento de S. cerevisiae sin NaCl y NaCl1M:
Crecimiento anaerobio sin NaCl: qm=0,036 g g-1^ h-
Crec. anaerobio + NaCl 1M: qm=0,36 g g-1^ h-
