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Prácticas Microbiología MEHU-UPAO
2. MICROSCOPÍA Y COLORACIÓN DE GRAM
MICROSCOPÍA
OBJETIVOS:
Explicar y reconocer las partes, su utilidad, así como funcionamiento y cuidados que se deben tener para el manejo correcto del microscopio óptico compuesto. Identificar diferentes preparados con bacterias, comparar los aumentos utilizados. Valorar la importancia del microscopio óptico compuesto en la microbiología.
INTRODUCCIÓN:
El ojo humano tiene una capacidad limitada, podemos observar dos puntos separados hasta una décima de milímetro, por ello es que la existencia de los microrganismos paso desapercibida durante muchos siglos, el desarrollo de herramientas e instrumentos basados en lentes que aumentaran el tamaño de las cosas fue lo que nos llevó al descubrimiento de estos seres microscópicos. La palabra microscopio, deriva etimológicamente del griego mikrós : pequeño y skoopéo : observación y fue Jean Faber en 1624 quien lo nombró así, aunque se atribuye a Zacarías Jansen en 1590 su invención; pero, el impulsor más significativo de la microscopía fue Anton Van Leeuwenhoek (1632- 1723). Desde el punto de vista de la óptica, existen dos tipos de microscopio, un microscopio simple que consta de un solo lente (una lupa, por ejemplo) y el microscopio compuesto que tiene más de uno, el microscopio propiamente dicho es un ejemplo. Actualmente existen diferentes tipos de microscopios, dentro de los cuales tenemos a los microscopios de luz, los microscopios electrónicos, los microscopios laser y los de efecto túnel; en donde, dependiendo de la fuente de energía ser formarán imágenes de los especímenes a diferentes grados de resolución, es decir, mientras más corta sea la longitud de onda de la fuente de energía (y por consiguiente mayor energía) mayor nivel de detalle se tendrá en la imagen que se obtenga. De manera general, los microscopios ópticos compuestos (funcionan con luz), son los que más se utilizan en los laboratorios de ciencias biológicas y microbiología. Esencialmente están compuestos por un sistema óptico, las lentes, el condensador y el diafragma, así como la fuente lumínica (algunos autores llaman a estas tres últimas partes, sistema de iluminación); un sistema mecánico, el cual es el encargado de soportar y mover todas las piezas del instrumento, por lo tanto, poder dirigir adecuadamente la observación. Un factor importante en cada microscopio, es el límite de resolución, el cual es la mínima distancia a la cual un microscopio puede observar dos puntos separados, así también el poder de resolución, viene a ser la capacidad de observar dos puntos separados a una menor distancia y como vimos anteriormente está influenciada de manera inversamente proporcional por la longitud de onda de luz utilizada.
Figura 2.1. Límites de resolución del ojo humano y los microscopios En los laboratorios de nuestra universidad, cada microscopio tiene 4 objetivos, tres a seco: el panorámico, 4X; el de mediano aumento, 10X; y el de gran aumento 40X; además tenemos el de inmersión, 100X, en el cual se utiliza entre la muestra y su lente frontal, aceite de cedro o aceite de inmersión para evitar distorsión por refracción de las ondas de luz. Figura 2.2. Objetivos a seco (Panorámico)
Figura 2.4. Partes del microscopio
Materiales:
o Microscopio óptico compuesto
o Papel lente (Papel de seda)
o Aceite de inmersión
o Preparados microscópicos
Procedimiento
Explicar y reconocer las partes de un microscopio y seguir las indicaciones del profesor para hacer un enfoque adecuado de las preparaciones. Realizar esquemas de lo observado a diferentes aumentos. Oculares (10X) Cabezal Revólver Objetivos Platina Diafragma Pinza Tornillos que mueven la muestra (carrito) Tornillo macrométrico Tornillo micrométrico
COLORACIÓN DE GRAM
Objetivos:
Aprender a elaborar un preparado en fresco Aprender la técnica correcta para realizar un frotis a partir de un cultivo de microorganismos. Fundamentar los conceptos de colorante y coloración o tinción. Elaborar preparaciones de microorganismos, fijarlas y teñirlas con las técnicas de coloración simple; la coloración de Gram; la coloración de Shaeffer y Fulton; y la coloración de Ziehl Neelsen.
Introducción:
La mayoría de los microorganismos carecen de color, por lo que no es posible observar con claridad su forma o agrupación. Para poder realizar una observación detallada de su forma es necesario teñirlos. A lo largo de la historia se ha utilizado muchas sustancias tanto naturales como sintéticas, para colorear tanto, tejidos como microorganismos, desafortunadamente algunas ocasiones el uso solo de colorantes no dio resultados satisfactorios, por lo que se implementó el uso de sustancias denominadas mordientes, las cuales ayudan a la tinción y la hacen más eficiente. Las tinciones no solo permiten observar células, en ocasiones, nos permiten apreciar estructuras internas, generalmente en eucariotas, en procariotas podemos observar endosporas u corpúsculos metacromáticos. Los colorantes, que son las sustancias que ceden color a las estructuras por colorear, tienen en su estructura molecular generalmente dos partes, una llamada cromóforo que es la que da color y otra llamada auxócromo la cual le ayuda a interaccionar con la superficie a teñir. Un paso fundamental, antes de aplicar cualquier técnica de tinción, es elaborar correctamente la preparación que puede ser de dos tipos: “en fresco”, en donde se coloca la muestra tal y como se obtiene de su fuente original para su observación, o una preparación fija, en la cual la muestra biológica debe sufrir un tratamiento para que conserve sus características morfológicas, a este proceso se le llama fijación; para fijar una muestra se aplican métodos fijos como el calor o la deshidratación, o productos químicos como etanol, ácido acético, formaldehído o glutaraldehído. Una tinción simple es aquella en la que solo se aplica un colorante, por lo general las soluciones de colorantes se hacen acuosas y a baja concentración. Existen además coloraciones diferenciales, tinciones selectivas y tinciones vitales. En el primer caso, se utiliza más de un colorante y permite diferenciar a las células coloreadas por la afinidad de un colorante a alguna estructura específica, de este tipo es la tinción de Gram. La tinción de Gram, fue diseñada por Hans Christian Gram en 1884; y es actualmente una de las principales técnicas que se usan en la bacteriología para poder diferenciar a dos grupos taxonómicos, las bacterias grampositivas y las gramnegativas, se fundamenta básicamente en la estructura de la pared celular de cada una de ellas siendo la de las primeras más simple y reaccionan positivamente al colorante cristal violeta; mientras que la pared celular de las gramnegativas es más compleja pero no logran mantener al colorante principal y han de ser teñidas con un colorante de contraste como es la safranina, como mordiente se utiliza lugol, y como decolorante alcohol acetona. También existe otra tinción llamada de Ziehl-Neelsen que tiene un gran valor para el diagnóstico de la tuberculosis.
Figura 2.6. Formas microbianas más frecuentes
Materiales:
o Microscopio óptico
o Papel lente
o Aceite de inmersión
o Láminas portaobjetos
o Láminas cubreobjetos
o Pipetas Pasteur descartables
o Soluciones de cristal violeta, safranina, lugol, alcohol-acetona, azul de metileno, y verde de
malaquita
o Cultivo de Escherichia coli
o Cultivo de Staphylococcus aureus
o Cultivo de Bacillus megaterium.
o Suspensión de protozoarios
Procedimientos:
Preparado en fresco ✓ Lavar y eliminar las cargas eléctricas del portaobjetos con la flama del mechero. ✓ Colocar en el portaobjetos una gota de agua utilizando el asa bacteriológica. ✓ Esterilice el asa a la flama del mechero, esperar que se enfríe. Tomar una muestra pequeña del crecimiento microbiano y colocarla junto a la gota de agua. ✓ Con movimientos circulares del asa, distribuir uniformemente la muestra de la colonia sobre la superficie del portaobjetos. ✓ Cubrir con un cubreobjetos ✓ Observar al microscopio con objetivos a seco, según indicaciones del profesor.
✓ Si la muestra es una suspensión de protozoarios, colocar una a dos gotas de la suspensión sobre una lámina portaobjetos, cubrir con una lámina cubreobjetos, enfocar y observar al microscopio con objetivos a seco. Figura 2.7. Preparado en fresco Preparación de los frotis ✓ Lavar y eliminar las cargas eléctricas del portaobjetos con la flama del mechero. ✓ Colocar en el portaobjetos una gota de agua utilizando el asa bacteriológica. ✓ Esterilice el asa a la flama del mechero, esperar que se enfríe. Tomar una muestra pequeña del crecimiento microbiano y colocarla junto a la gota de agua. ✓ Con movimientos circulares del asa, distribuir uniformemente la muestra de la colonia sobre la superficie del portaobjetos. ✓ Secar y fijar el frotis a la llama del mechero pasando el portaobjetos repetidamente por este rápidamente, evitar que el portaobjetos se caliente en exceso. ✓ Hasta este momento lo que hemos realizado es obtener un frotis, es decir, una muestra en seco, deshidratada.
Figura 2.9. Técnica de la tinción de Gram Tinción de Shaeffer y Fulton ✓ Cubrir un frotis de Bacillus megaterium con verde de malaquita y calentar suavemente hasta la emisión de vapores durante 5 minutos, adicionar más colorante para evitar que el colorante se seque. ✓ Enjuagar con agua de caño. ✓ Cubrir con safranina y esperar un minuto. ✓ Enjuagar con agua de caño y dejarlos secar al aire, observar al microscopio diagramar. https://www.pinterest.cl/pin/151644712429828085/?lp=true Figura 2.10. Tinción de Shaeffer y Fulton
LUGOL
ALCHOLO-ACETONA
Tinción de Ziehl Neelsen Coloración ✓ Colocar sobre el soporte las láminas fijadas conservando el orden numérico con el extendido hacia arriba y manteniendo una separación de al menos 1 cm entre ellas. ✓ Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada, dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero. ✓ Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. ✓ En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado. ✓ En el término de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisión de vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a sus lípidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal. ✓ Levantar cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo más cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presión, con un frasco o un grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado también la parte posterior. ✓ Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y así evitar diluir los reactivos que se utilizarán a continuación. Decoloración ✓ Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar aproximadamente 3 minutos. ✓ Enjuagar con abundante agua a baja presión. ✓ Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes más gruesas del extendido a lo sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cúmulos rojos o coloración rosada intensa, volver a cubrir con solución decolorante, dejarla actuar entre uno y tres minutos y enjuagar nuevamente. ✓ Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos. Coloración de fondo ✓ Cubrir todo el extendido con solución de azul de metileno. Dejar actuar durante un minuto. ✓ Enjuagar las láminas en ambas caras con agua a baja presión y limpiar la parte inferior con un algodón si ha quedado coloreada. ✓ Observar si las láminas conservan la numeración clara y visible. Si no es así volver a numerarlas. ✓ Dejar secar las láminas a temperatura ambiente, apoyándolas en posición vertical en un soporte sobre un papel absorbente. No apoyar papel absorbente sobre el extendido. ✓ Observar al microscopio
Prescott ML, Harley JP, Klein DA. Microbiología. 5a^ ed. Madrid: McGraw-Hill Interamericana; 2002. Madigan MT, Martinko JM, Bender KS, Buckley DH, Stahl DA. Brock, Biología de los microorganismos. 14 va.^ ed. Madrid: Pearson; 2015.
