Terapia cel y gen, Apuntes de Ingeniería Biomédica

¡Descarga Terapia cel y gen y más Apuntes en PDF de Ingeniería Biomédica solo en Docsity!

Primer parcial

BIOLOGIA CEL·LULAR

Tema 1. Introducció i conceptes bàsics

La AEMPS (Agencia Espanyola de Medicament i Productes Sanitaris) és un organisme autònom les funcions principals del qual són:

• Concedir l’autorització de comercialització dels medicaments d’ús humà fabricats industrialment, revisió i adequacions als ja comercialitzats.
• Avaluar i autoritzar els assaigs clínics i els productes en fase d’investigació clínica. Fins que un medicament tingui una repercussió clínica poden passar uns 10-12 anys i té un cost d’uns 50 milions d’€. La legislació ho té difícil per regular-ho ja que passa molt de temps. Així, es va crear la AEMPS. La AEMPS legisla tot el que té a veure amb la teràpia avançada, la qual utilitza cèl·lules. Per poder obtenir cèl·lules mare embrionàries (ESC) es necessiten uns requisits molt estrictes:

1. S’ha d’avisar al CRO (organitzador de recerca) que en altres paraules és el grup d’investigació associat a un hospital i entregar un informe. Si és un hospital públic serà més fàcil que un de privat.
2. L’informe ha d’estar revisat i segellat pel CEIC. El CEIC és el comitè ètic d’investigació clínica ( ~ hospital legislat per sanitat).
3. Després, el CIC ho envia als AEMPS (Madrid). Dins d’aquest, el CRD s’encarrega de recollir les dades (quadern de recollida de dades  gent que treballa, número de pacients, aprovació del consentiment del donants, etc.)
4. Si l’AEMPS ho aprova, es pot recollir. *Un CEIC a Catalunya està molt més controlat que un CEIC a Andalusia.

CRO + informe

• La persona

avisa al CRO

amb un

l'informe

que ha de

ser aprovat

CEIC

• El CIC revisa

informe i

posa segell

AEMPS

• CRD
• Aprova

recollida de

cèl.

Les cèl·lules utilitzades comunament són:

• iPS: encara en assaig biològic.
• Hematopoètiques : cèl·lules de la medul·la òssia que s’exposen a un immunopanel (Ab que reconeixen les cèl·lules tumorals), s’irradia, i es tornen a col·locar netes al pacient. S’utilitzen des de fa molt, està legislat i es tarda 1-2anys
• Mesenquimals : per a ós, tendó, cartílag...

Si es tracta d’un francès resident a Francia i vol utilitzar cèl·lules de bcn, si hi ha un CRO que acolli el francès ho podrà fer. El que solen fer és acumular els expedients si venen d’altres països i no se’ls acaba permetent. En un cas, es va utilitzar teixit embrionari fetal abortiu per tractar el Parkinson (uns 8 fetus per pacient) fent transplantaments a un pacient immunodeprimit. Va funcionar més o menys. Aquesta pràctica en Espanya NO es pot dur a terme. El nostre gran problema és la financiació. El nostre govern no inverteix en ciència. Si volem pluripotència buscarem obtenir una línia de iPS ja que tenen la mateixa pluripotencialitat que les cèl·lules embrionàries. Amb una cèl·lula mesenquimal, per exemple, no podríem generar bé una neurona. En Espanya no es treballa amb iPS. Es poden diferenciar a ectoderm, mesoderm o endoderm.

expressió, etc.). és a dir, es donarà lloc a una cèl·lula filla igual a ella responsable de perpetuar el llinatge i a una altra cèl·lula que ja està més diferenciada o predeterminada. En una placa de cultiu el que ens interessa és que es mantingui la línia: autorenovació. Moltes vegades el que fem es bloquejar la diferenciació, la divisió asimètrica. Quant de temps podem mantenir una cèl·lula amb divisions simètriques? El grau d’autorenovació que podem aconseguir amb aquesta cèl·lula (embrionària) és molt gran. En canvi, una cèl·lula mesenquimal d’adult tindrà una capacitat de renovació in vitro molt més limitada que una embrionària ja que es troba en una altra etapa. Amb 20 divisions ja no aguanten (altres articles diuen que a les 12 divisions). Això depèn dels clons. Una embrionària la podem aguantar fins i tot un any. Podem controlar molt més la capacitat de autorenovació amb una embrionària. Amb una mesenquimal trobem que perd en gran part aquesta capacitat. A més, són pluripotents. La pluripotència és l’habilitat per donar lloc a tipus cel·lulars diferenciats que són derivats de les tres capes germinals primàries que es formen durant la gastrulació (endoderm, mesoderm i ectoderm) de l’embrió. El grau de pluripotència és el que tractarem en aquest tema. La persona de l’article, al obtenir una cèl·lula ja sigui embrionària, mesenquimal o iPS, formarà una sèrie de clons ja que ningú es creuria els resultats amb una sola cèl·lula. Mai dues preparacions són iguals. En el moment en què agafem les cèl·lules amb pluripotència i les posem en una placa de cultiu les estem posant en un ambient que no és el seu. Per les ESC, nosaltres en fem que siguin cèl·lules mare perquè de normal elles no ho són. Tenim N clons i hem de demostrar a la persona que estem davant d’una cèl·lula pluripotent. Hi ha una sèrie de probes: immunocitoquímica, repressors, transcriptoma, cariotip, fosfatasa, marcadors de diferenciació... que sempre s’han de fer i que sortiran repetides en cada article. Sense aquesta làmina, ningú es creurà que estem davant d’una cèl·lula pluripotent. En el cas de les ESC ens interessarà l’estadi de blastòcit. Aquest no està adherit o unit al que seria una matriu, ja que aquest procés d’unió faria que comences a desenvolupar- se, a canviar la seva organització interna, etc. Ens centrarem en unes 200 cèl·lules del blastòcit que conformen la MCI, la massa cel·lular interna. Tenim una coberta que es el trofoblast i a partir d’aquí es formaran les 3 capes germinals embrionàries (ectoderm, mesoderm, endoderm). Entre l’estadi de blastòcit i en el que es forma l’endoderm, es quan les hem d’obtenir per tal de no haver de purificar per la possible mostra amb cèl·lules endodèrmiques. Als 5 dies post gestació es quan normalment s’agafen. Aquesta MCI s’ha multiplicat per autorenovació i si no en fem res a l’estadi 6- 7 comencen a diferenciar-se de forma natural i perdran la capacitat d’autorenovació. En aquest cas, la MCI donarà un organisme i deixarà de ser una stem cell. Als 12 dies en un ratolí aquesta MCI no es veurà. Nosaltres en farem que es comporti com una stem cell quan l’obtenim, purificant-la i canviant-li les propietats.

No tots els clons embrionaris generen cèl·lules de la línia germinal. A partir de les ESC no es poden crear, per exemple. Per què? Perquè farem cultius diferents que es mantenen de forma diferent. Encara que les haguem obtingut de la mateixa manera les cultivarem de forma diferent. No obstant, a partir de les ESC podem obtenir gairebé tots els teixits. Donen lloc a cèl·lules amb capacitat de diferenciar-se i formar tots els òrgans i teixits de l’organisme a excepció de la línia germinal. Per això es pluripotent. ➢ Una vesio del desenvolupament embrionari Endoderm : tim, tiroides i paratiroides, tràquea, pulmons, laringe, vesícula urinària, vagina, urèter, òrgans gastrointestinals, tracte GI i revestiment del tracte GI i respiratori. Mesoderm : medul·la ossia (sang), còrtex adrenal, teixit limfàtic, musculatura (esquelètica, llisa i cardíaca), tracte urogenital, cor i sistema vascular. Ectoderm : pell, teixit neural, medul·la adrenal, glàndula pituïtària, teixit connectiu de la cara i cap, ulls i oïda. Si ens fixem en les neural stem cells veiem que al cap d’un any aprox. Tindrem una massa cel·lular similar a un glioma (creixement descontrolat). Per això quan es realitzen cultius s’intenta que només proliferin aquelles cèl·lules que es divideixen de forma simètrica. Son el que anomenem cultius de selecció, que ens permeten potenciar i seleccionar les cèl·lules que ens interessen.

• Multipotents (ASCs) o Especialitzades en originar únicament determinats tipus cel·lulars de determinats teixits, és a dir només poden donar lloc als tipus cel·lulars que deriven del mateix llinatge d’origen embrionari. o Donen lloc a cèl·lules que tenen una funció especifica. Per exemple, una cèl·lula mare sanguínia. Una línia celular hematopoètica es podrá diferenciar a macròfag, plaquetes, eritròcits… o Totes les obtingudes en adult són multipotents (mesenquimal, hematopoètica, etc.). presents en pràcticament qualssevol teixit adult on s’han buscat. Les cèl·lules de la medul·la òssia , són dues coses juntes: cèl·lules mesenquimals + cèl·lules de la línia hematopoètica. 2.2. Marcadors de pluripotència
• Cariotip : han de presentar estabilitat cromosòmica
• Marcadors nuclears de control de la proliferació
• S’ha de poder diferenciar a derivats cel·lulars de les tres fulles embrionàries o Experiment quimera: Aquest experiment té com a objectiu
• Demostrar que són pluripotents
• És una tècnica molt cara (multiplicada pels N clons)
• Els resultats són significants

Tenim unes ESC i unes Neural Stem Cells derivades d’un animal. Es tracta de modificar les cèl·lules d’aquest perquè expressin un marcador reporter, per exemple β- galactosidasa, amb un determinat color. O quan posem el substrat comercial, la fosfatasa alcalina que presenten constitutivament farà que els llocs on està expressada virn a color blau. Agafem les cèl·lules ESC i NSC de l’animal i les disgreguem mecànicament amb una pipeta. Ens preguntem quina és pluripotent. Agafem un blastòcit pre-implantacional d’un segon individu, punxem i en la MCI del blastòcit col·loquem les ESC i les NSC. Aquesta és la zona que originarà cèl·lules de les diferents fulles embrionàries. Agafem els blastòcits pre-implantacionals i els posem a una mare pseudogestora (que no té gen reporter, per exemple, individu “blanc”). Implantar el blastòcit no és el que es fa en un procés de FIV. Es juga fins a un rang d’unes 8 cèl·lules (oòcit que es divideix fins 8 cèl·lules). I això es multiplica per n clons. Quan el col·loquem a la trompa ens assegurem que un % s’ha enganxat (en un procés de FIV se solen alliberar 2 clons). El primer problema és poder injectar les diferents stem cells al blastòcit i en la implantacio, ja que el grau será petit. En el cas de les ESC , quan agafem un embrió de 10 dies de ratolí, al revelar i veure la fosfatasa alcalina es veu que en tots els teixits hi ha cèl·lules blaves. Les cèl·lules que hem col·locat en un ambient concret (MCI) tindran endògenament una capacitat de ser pluripotents. Les ESC s’han diferenciat a diferent tipus de teixits. En el cas de les NSC , quan agafem l’embrió de 16 dies de ratolí, no tots els teixits presenten marca blava (només epiteli, teixit neural i intestí). La cèl·lula serà multipotent ja que al ser-ho tindrà la capacitat de donar lloc a uns teixits concrets i no a tots. Estaran dirigides a generar un tipus de diferenciació especifica. Només ha generat teixit esperat perla seva capa embrionària. El gran problema de les ESC no és el fet de cultivar-les sinó de controlar la pluripotencialitat. Són tant potents que el control d’aquesta és el problema. Quan alguna cosa és molt pluripotent té la tendència de proliferar en llocs on no li toca. Hem d’aconseguir controlar la proliferació. Les tècniques quimera ja no s’utilitzen.

Amb la purificació que ens permet obtenir les cèl·lules de la massa interna obtenim, generalment, unes 200 cèl·lules. Aquesta massa de cèl·lules no es pura, ja que una part del endoderm proper a la membrana del blastòcit també és absorbit. Haurem de purificar la mostra per eliminar els tipus cel·lulars que hem arrastrat de la massa interna i que no presenten pluripotencialitat. Ho veurem en les tècniques per aïllar ESC. Les ESC es solen obtenir en processos de FIV (fertilització in vitro) a partir d’embrions extranumeraris o en processos de transferència nuclear a partir de cèl·lules somàtiques adultes ( clonació terapèutica ). ESC: derivades d’un grup de cèl·lules anomenades MCI (massa cel·lular interna) que forma part de l’embrió primerenc, 4-5 dies, anomenat blastòcit. Sempre obtenim les ESC en període pre- implantacional (4-5dies). La clonació terapèutica és la generació d’un embrió per obtenir cèl·lules per tal d’administrar-les després en un pacient o bé guardar-les en un tanc amb nitrogen per al futur. La clonació a Espanya no està permesa. Es treu el nucli d’un ovòcit i se li trasplanta el nucli de la cèl·lula somàtica. Rere la fusió s’indueix la cèl·lula perquè es diferenciï a blastòcit. Això ens permet obtenir cèl·lules pluripotents, però “envellides” ja que presenten l’activitat telomerasa pròpia d’una cèl·lula somàtica adulta, per tant estarà disminuïda. Quan es diferencia conté patrons de celula somática adulta. Es va donar per la clonació d’animals (ovella Dolly) i per l’obtenció de cèl·lules embrionàries amb la capacitat de resoldre problemes relacionats amb la salut humana. L'activtat telomerasa marca el fet diferencial entre una ESC i una ASC. Les ESC mantenen bastant bé aquesta activitat in vitro mentre que les ASC la disminueixen. Aquest tipus de tècniques han evolucionat en paral·lel amb les tècniques de FIV.

2.4. Tècnica d’aïllament d’ESC Existeixen dues possibilitats: que les ESC derivin d’humans o siguin de ratolins. El procés de manteniment d’una i altre serà diferent. El procés en si és el mateix però les condicions de cultiu són diferents. Quan obtenim la MCI, la mostra segurament estigui contaminada. Tindrem cèl·lules que no seran de la massa cel·lular interna que hem aspirat del blastòcit. Purifiquem aquesta massa de cèl·lules i traiem les que no presenten la pluripotencialitat d’autorenovació (cèl·lules de l’endoderm i ectoderm que no ens interessa). El que es fa llavors és intentar recrear l’ambient que tenim en el blastòcit en la placa de cultiu. Ho fem volent que es generi la MCI, cèl·lules que es difereixin de la resta de cèl·lules que no ho son. Trobem dos maneres de purificar els cultius cel·lulars. Es poden utilitzar cultius amb fibroblasts que emeten factors de creixement i mimetitzen l’ambient propi d’on s’originen els blastòcits. O hi ha certes línies embrionàries de ratolí que no necessiten la línia de fibroblasts ( feeder layer ) per sobreviure. Son línies ja establertes que han passat pel procés anterior i formen una línia cel·lular estable. Es solen agafar del prepuci del ratolí. Si son humanes es col·loquen sobre una capa de fibroblasts irradiats (suport). Són fibroblasts tractats químicament o mitjançant radiació gamma per tal que no es divideixin, però que siguin capaços d’emetre GF i altres factors tròfics (citocines, etc.). Es succionen les cèl·lules i es col·loquen sobre una capa de fibroblasts. Al posar la MCI en la placa, aquestes celules crexeran molt. Per evitar casos d’isquèmia s’han de replaquejar (9-15 dies). Aquests fribroblasts están irradiats (els fibroblasts es mantenen en conflucnecia 1 setmana) i al pasar-los es moren perque no es podrán enganxar. Així tindrem només cèl·lules derivades de la MCI disociades en una nova capa de fibroblasts.

iPS, el que fan es utilitzar medi de cultiu derivat d’aquests fibroblasts per mantenir grau de pluripotencialitat. La presència o no en marcarà diferencies. Si no en tenim aquesta capa de fibroblasts, què passa? Podem modular el creixement sense la capa de fibroblasts en ratolins. ➢ Cultius de ESC Quan s’estan cultivant les cèl·lules de MCI de blastòcits humans suplementem amb un suport tròfic perquè aquestes cèl·lules es puguin mantenir. Utilitzem línies cel·lulars de fibroblasts irradiats o carregats amb antimitòtics com ARAC (citosina C arabinòsids) per aconseguir una capa confluent. Cada setmana s’ha de fer passos de les cèl·lules cultivades ja que es van desenganxant. S’ha d’anar fent durant aprox. un mes cada setmana. Aquestes cèl·lules s’anomenen cossos embrioides. La neuroesfera és la manera de mantenir les stem cells a nivell neural i presenten també el problema de l’aparició de zones isquèmiques amb processos de diferenciació descontrolada. En el Parkinson part de les tremolors des del punt de vista anatòmic ve donat per un conjunt de neurones en la substancia negra que son dopaminèrgiques i que es van degradant (6 0 - 70% de mort). o Obtenir cèl·lules dopaminèrgiques a partir de stem cells Per caracteritzar una cèl·lula dopaminèrgica s’utilitza tiroxina hidroxilasa , un marcador. Un dels factors que regula la diferenciació cel·lular es la pressió parcial d’oxigen. Baixant la pressió parcial d’oxigen s’aconsegueix una diferenciació de les cèl·lules neuronals TH+. Es regula l’oxigen intern o es desplaça amb nitrogen. Si baixem el percentatge podem dirigir aquesta diferenciació. La regulació d’O 2 és un procés comú. Amb les ESC s’augmenta el procés de diferenciació cel·lular si baixem només un poquet (2%). Utilitzant un cobreobjectes sobre les cèl·lules fem que s’aixafin i baixin i s’indueix una isquèmia semblant. Es una altra manera cutre però efectiva quan no hi havia incubadors. Mai utilitzarem cèl·lules de les zones isquèmiques ja que estaran diferenciades. Una cèl·lula derivada de MCI de ratolí no fa falta que creixi sobre una capa de fibroblasts mentre que les humanes sí. Per què? Aquest tipus de tècniques s’han desenvolupat de manera paral·lela a les tècniques FIV però també han anat apareixent paral·lelament a les tècniques d’Ab monoclonal. En aquest últim cas, quan es vol obtenir Ab monoclonals s’utilitza un factor que potencia la proliferació d’un cultiu. Es va posar LIF sobre les cèl·lules de la MCI de ratolí per veure si es podia mantenir el cultiu i es va veure que sí.

Es a dir, un cop obtingudes les cèl·lules han de mantenir-se per obtenir clons. En funció del clon que es faci (a partir d’un mateix blastòcit es poden obtenir diferents clons) necessitarem un factor que mantingui el clon en la placa durant un cert període de temps. El factor que s’utilitza és el LIF LIF és un factor inhibidor de leucèmia. S’obté en les primers estadis del hibridoma. Un hibridoma és una línia elular hibrida obtinguda mitjançant la fusió d’un limfòcit B productor de l’Ab específic d’interès amb una línia cel·lular de mieloma (limfòcit B cancerós) que no produeix una immunoglobulina pròpia. S’obté així una línia cel·lular immortal capaç de produir l’Ab monoclonal. No tots els tipus cel·lulars el necessiten per poder sobreviure en cultiu, un exemple son les cèl·lules humanes (en el 90% dels casos el LIF no funciona i necessiten fibroblasts). Al utilitzar el LIF sobre unes cèl·lules cultivades derivades de ratolí in vitro , aquest és capaç de mantenir el cultiu proliferant i podem evitar en la majoria de casos, depenent del clon, el creixement sobre la capa de fibroblasts. Manté l’estat de pluripotencialitat dels clons obtinguts. El receptor que uneix a LIF és un dímer unit a la membrana que un s’uneix a LIF: LIFR + receptor gp130. El LIF és un factor que activa una cascada de senyalització que es JACK-STAT. La idea és que l’activació d’aquesta via, concretament de l’STAT3 (FT que dimeritza) que es transloca al nucli, indueixi la seva auto-renovació, la proliferació simètrica. Aquesta senyalització comporta a l’expressió de diferents FT en el nucli íntimament relacionats amb la proliferació de les stem cells, responsables de l’autorenovació. Si volem mantenir una stem cell in vitro, aquesta s’ha d’activar sempre. Una stem cell derivada de MCI per sí sola no es una stem cell. Quan li afegim el LIF fem que es comporti amb una auto-renovació simètrica de forma artificial. Des del punt de vista pràctic a l’utilitzar el LIF, també és possible que enlloc de tenir autorenovació, a través de cascades de senyalització paral·leles s’inhibeixi aquest procés. La principal cascada es la via de les MAPK (ERK1/2). També pot passar que es poden activar vies paral·leles que siguin més fortes que la primera. Unes cascades indueixen la seva diferenciació i la més coneguda és la via de les MAPK en aquests estadis de cultius inicials.

o Regulació transcripcional de ESC self-renewal

o Oct Oct4 (=Oct3/4) no actua sol. Si veiem on s’està expressant abans i després en la zona del blastòcit veiem que s’expressa en unes cèl·lules molt determinades (cèl·lules marcades en vermell a la imatge inferior). El trobem expressat en la MCI del blastòcit , en les fases primeres i tardanes, i després en una zona anomenada epiblast. Just quan es dóna la implantació es generen dues capes i un epiblast que serà font per a més cèl·lules endodèrmiques i ectodèrmiques. La capacitat proliferant de les cèl·lules la dona Oct4. Manté autorenovació basal. Oct4 és essencial durant les primeres fases d’especificació del llinatge embriònic. Aquest s’expressa basalment i permet la divisió constant de les cèl·lules. En un principi permet que es passi de la fase de mòrula a la fase de blastocist primerenc. Apareixen també altres factor importants, podem mantenir Oct4 actiu però si toquem altres podem fer que les cèl·lules de la MCI es diferenciïn: Nanog és un FT sota en control de Oct4. Aquest s’expressa en la part més baixa o central de la MCI i es un factor que el que fa és evitar la formació de l’endoderm. Inhibeix la diferenciació de la cèl·lula. Nanog té la funcio de prevenir la diferenciació de les cèl·lules de la MCI a endoderm. Si s’evita la formació d’alguna cosa, estem potenciant l’estadi inicial. Nanog evita que es diferenciï a endoderm i coopera a la auto-renovació de la MCI. Quan Nanog té un pic i baixa, es comença a generar endoderm i en aquell moment ens trobem en la fase de blastòcit tardà que passarà a ser post-implantacional. Perd efecte i comença la diferenciació. Entre aquestes dues últimes fases s’expressen Sox2 i FoxD3 , que son també FTs. Sox2 amb Oct4 (formen dímer) s’encarrega de dirigir la proliferació en l’epiblast. Sox2 i FoxD3 són essencials pel manteniment d’un epiblast pluripotent. En estadis més tardans entren en processos d’autorenovació de la celula. Sox activa l’expressio de Nanog.