¡Descarga Toxicologia y más Apuntes en PDF de Ciencias Ambientales solo en Docsity!
Toxicologia Ambiental
En aquesta assignatura treballarem la ciència que estudia els efectes tòxics en el medi ambient.
Aquesta va començar a sorgir a partir de l'ús massiu de pesticides en els cultius. D'aquí sorgeix
la necessitat d'estudiar les causes d'una sèrie de fets que succeïren a partir de llavors.
L'avaluació serà a partir de l'examen final, el qual representa un 60% de la nota final, a més a
més dels exercicis sobre les pràctiques, que seran el 40% restant.
Bibliografia
WALKER CH, HOPKIN SP, SIBLY RM & PEAKALL DB (2012). Principles of ecotoxicology. Taylor & Francis,
London 353pp
ÍNDEX
Bloc 1: Principis Generals ......................................................................................................... 1
TEMA 1: Introducció a la Toxicologia Ambiental ................................................................... 1 TEMA 2: Fenomen Tòxic ....................................................................................................... 4 TEMA 3: Toxicocinètica I. Distribució i Excreció de Tòxics .................................................... 10 TEMA 4: Toxicocinètica II. Biotransformació de Substàncies Tòxiques ................................. 14 TEMA 5: Mecanismes d'Acció dels Tòxics ............................................................................ 16
Bloc 2: Avaluació del Risc Toxicològic ....................................................................................... 2
TEMA 6: Introducció als Estudis Epidemiològics .................................................................... 2 TEMA 7: Avaluació del Risc Toxicològic ................................................................................. 4 TEMA 8: Mètodes Experimentals d'Ecotoxicitat i Avaluació de Risc Ambiental .................... 17 TEMA 9: Mètodes de Camp ................................................................................................ 17
Bloc 3: Principals Contaminants Ambientals ........................................................................... 18
TEMA 10: Contaminants atmosfèrics .................................................................................. 18 TEMA 11: Els metalls .......................................................................................................... 21 TEMA 12: La radioactivitat .................................................................................................... 1 TEMA 13: El petroli ............................................................................................................... 6 TEMA 14: Els compostos organohalogenats .......................................................................... 8 TEMA 15: Altres contaminants ........................................................................................... 19
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
Bloc 1: Principis Generals
TEMA 1: Introducció a la Toxicologia Ambiental
1. Toxicologia Ambiental i Ecotoxicologia
Primer de tot començarem amb una cosa força essencial, que són les definicions de certs conceptes que a partir d'ara utilitzarem amb força regularitat, i si no els tenim clars, es pot donar lloc a certa confusió!
Contaminant : Substància sintètica (xenobiòtica) o natural que provoca una alteració en els factors ambientals degut a que es troba a concentracions molt superiors a les normals.
El mercuri és una substància natural, però degut a l’activitat humana aquest compost pot tenir una major concentració en el medi.
El pollutant , traduït com a tòxic, són les substàncies que tenen un efecte nociu o tòxic.
L'any 1972 l'ONU organitza la Conferència sobre el Medi Ambient, també coneguda com Conferència d'Estocolm, on molts països representa que es van posar d'acord per intentar regular la disbauxa de pesticides que s'abocaven constantment al medi.
Els recursos naturals de la Terra, inclosos l'aire, l'aigua, la terra, la flora i la fauna i, en especial, les mostres representatives dels ecosistemes naturals, cal que estiguin protegits en benefici de les generacions presents i futures per mitjà d'una planificació o gestió acurada.
És llavors quan apareix la toxicologia ambiental , la qual estudia els danys causats als organismes per la exposició als tòxics que es troben en el medi ambient. Per altra banda, la ecotoxicologia se centrarà sobretot en els efectes ecològics dels contaminants (en individus, poblacions i ecosistemes). És una ciència nova ja que fa relativament poc que s’aboquen elements produïts pels humans, que fins després de la Segona Guerra Mundial no van prendre força. El seu caràcter interdisciplinari inclou coneixements sobre toxicologia, química ambiental i ecologia.
- La química ambiental realitza el monitoratge de l'exposició, és a dir, la especiació química, la transformació, transport, absorció-desorbció i les taxes d'exposició.
- La toxicologia monitoritza els efectes a partir de la toxicocinètica, biotransformació, mecanismes de toxicitat, anàlisi de danys i riscos, bioacumulació i biomagnificació.
- Finalment, la ecologia ens ajudarà a protegir els ecosistemes d'aquestes emissions ja que es realitzaran estudis de distribució, abundància i dinàmica poblacional, interaccions, estructura i diversitat d'espècies en l'ecosistema, a més d'analitzar les funcions en les comunitats (producció primària, cicle de nutrients, descomposició, funcions reguladores…)
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
Existència dels efectes indirectes. El mercuri afecta a l’activitat fotosintètica de les algues i no creixen suficient. Els microorganismes que s’alimentaven d’aquestes no poden menjar i es produeix un efecte en cadena.
3. Els contaminants
A l’any 1995 la quantitat de substàncies químiques que s’abocaven es va multiplicar per mil des del
- El 1999 es van alliberar uns 3,5 milions de tones de substàncies tòxiques – 12 quilos per persona– al medi ambient, només als EUA.
Segons la Comissió Europea en el seu Llibre blanc sobre substàncies químiques, "hi ha un desconeixement general de les propietats i els usos de les substàncies existents. El procés d'avaluació de risc és lent, requereix nombrosos recursos i impedeix que el sistema funcioni de forma eficaç i rendible”. Més de 1.500 substàncies i compostos son considerats molt perillosos.
Els contaminants: POP ( Persistent Organic Pollutants )
Al 2001, 127 governs van aprovar la Convenció d'Estocolm sobre Contaminants Orgànics Persistents per intentar posar fi a la producció de dotze dels contaminants més perillosos, els anomenats ’12 bruts’. El 2004 va entrar en vigor el reglament 850/2004 a la Unió Europea sobre contaminants orgànics persistents per tal de coordinar l'aplicació del Conveni d'Estocolm entre tots els estats membres (Espanya 2007).
COP (nom de l'ingredient actiu)
Núm. CAS Usos
Aldrín 209-00-2 Insecticida agrícola formulat per a protegir les llavors i ésser usatcontra plagues de terra en conreus de blat, cotó i patata. Clordà 57-74-9 Insecticida àmpliament utilitzat en conreus, jardineria i boscos.
DDT 50-29-
Insecticida utilitzat en el passat per al control de mosquits transmissors de paludisme i que actualment en alguns països es continua utilitzant amb fins de control de vectors. També es pot generar de manera intencionada en determinats processos Dieldrín 60-57-1 Insecticida agrícola utilitzat en fruiters, plagues de terra en conreu deblat, patata i cotó; control d'ectoparàsits en bestiar.
Endrina 72-20-8 Raticida i insecticida usat en conreus de cotó, arròs i blat, i per alcontrol d'ectoparàsits en bestiar.
Heptaclor 76-44-6 Fungicida,producció d'altres plaguicides i compostos clorats.^ també^ és^ un^ subproducte^ contaminant^ resultat^ de^ la
Mirex 2385-85-5 Insecticida utilitzat en diversos conreus agrícoles contra formigues itermites
Toxafè 8001-35-2 Insecticida agrícola utilitzat en el passat, principalment en conreus decotó, blat, cereals i hortalisses.
PCBs 1336-36-
Tipus d'oli utilitzat principalment per la indústria elèctrica per al funcionament de condensadors i transformadors elèctrics. També es poden generar de manera no intencionada en determinats processos.
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
Hexacloro- benzè 118-74-
Utilitzat com a plaguicida i com intermediari o additiu en la producció industrial. És un COP que també es forma de manera no intencionada en determinats processos
Dioxines i furans
No tenen utilitat i es produeixen de manera involuntària a partir de processos tèrmics que comprenen MO i substàncies de clor com a resultat d'una combustió incompleta o de complexes reaccions químiques
La Convenció diu que els estats han de fer uns esforços decidits:
- abans del 2025: identificar, etiquetar i retirar l'equipament que contingui PCB.
- abans del 2028: gestionar tots aquests residus d'una manera ambientalment sana.
TEMA 2: Fenomen Tòxic Tòxic: substància estranya per l’organisme i l’afecta d’alguna manera.Contaminant que quan ingressa a l’organisme altera els elements bioquímics fonamentals per la vida.
Toxicitat: capacitat d’una substància per produir efectes perjudicials per l’organisme.
Intoxicació: conjunt de trastorns que deriven de la presencia en el organisme de un tòxic.
Fases del fenomen tòxic
Factors que afecten la toxicitat
a) Nivell d'exposició a. Dosi. A dosis altes, més facilitat hi haurà de que puguin entrar en algun òrgan diana. Qualsevol substància pot ser verí segons la dosi que es proporcioni. L’efectivitat només depèn de la dosi.
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
solubilitat, lipofibilitat (Kow), estructura tridimensional, presència de determinats grups químics, interacció entre contaminants... És molt important la polaritat. La molècula polar està desigualment carregada (H2O) mentre que el CO2 és apolar perquè la càrrega està distribuïda homogèniament. Quan una molècula és més polar és més soluble. Les no polar no es poden dissoldre en aigua però sí en lípids i per tant travessen molt bé les membranes i els teixits dels òrgans (com els POPs) i doncs tenen més facilitat d’arribar al teixit diana. La lipofibilitat es mesura com el coeficient següent: [ ] [ ] És un quocient que quan sigui més alt vol dir que el contaminant es dissolt més. Quan una molècula és més polar és més soluble. A més, que un compost tingui una pressió de vapor molt alta serà més fàcil de vaporitzar-se. Les membranes plasmàtiques tenen fosfolípids i proteïnes. Totes les substàncies lipòfiles penetren directament a la cèl·lula, així com els gasos que també entren per difusió simple. Les petites molècules sense càrrega passen, però les molècules grans necessiten proteïnes transportadores.
Paràmetres de toxicitat
Relació Dosis-Resposta (RDR)
Es calcula amb uns paràmetres totalment controlats. Normal mentés una corba sigmoidea. L’ingestió ha de ser sempre pel mateix mètode. Els efectes han de ser únics del contaminant. Sempre hi ha un llindar sota del qual la dosis no presenta efectes.
A mesura que van augmentant la dosis hi ha uns pocs individus que comencen a presentar efectes (hipersensibles). Els més resistents moren a dosis més altes.
Per la Daphnia es van utilitzar uns blancs i es fiquen a diferents peixeres 10 individus. Es mira el que passa amb els animals al cap del temps. Observem que al control no moren i als altres si i d’aquesta manera es pot fer la corba dosi-resposta.
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
També hi ha corbes amb forma de “U”. Això passa quan els tòxics només ho són a un cert nivell perquè són micronutrients.
En els tòxics hi ha un llindar Umbral que és el límit fins on els tòxics no fan efecte.
Una altre forma de representar la corba és de forma poblacional, que sovint es mostra una corba de distribució normal.
Reacció d’una població davant d’un tòxic. En cada concentració ens mostra els individus que moren.
Dosi letal 50
L’índex de toxicitat més utilitzat és el de la dosi efectiva 50 que expressa la quantitat de substància, en mg/Kg, que en determinades condicions experimentals produeix efectes en el 50% d’una espècie animal determinada. Quan l’efecte buscat es la mort es parla de dosi letal mitja. És útil en ecotoxicologia per a:
- Comparar sensibilitats entre diferents espècies per a un mateix tòxic.
- Comparar toxicitat de varis compostos per a una mateixa espècie.
- Dos tòxics calculats sobre la mateixa espècie. Pendents més pronunciats sobre la corba i més estrets suggereix que el tòxic tarda menys en carregar-se la meitat de la població.
- El B respecte el A és menys tòxic.
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
Factor pendent: tenim una corba on tenim la probabilitat de que un tòxic produeixi càncer. Es fa una recta que neix a l’origen i talla amb la mínima dosi que produeix càncer:
Efectes biològics
Bioconcentració: absorció i retenció d’un contaminant per part d’un organisme respecte al medi on viu, sense que intervinguin les rutes d’exposició. Generalment aplicat a organismes aquàtics.
[ ] [ ]
Bioacumulació: absorció i retenció d’un contaminant per part d’un organisme respecte els aliments. És el mateix però en comptes de fer-ho en relació al medi ho fem en relació als aliments. Augmenta al llarg dels anys. Hi ha tòxics que es concentren i s’acumulen i altres no.
Quan un tòxic sigui més lipofílic, més es bioconcentra a l’organisme ja que s’adhereix als lípids. Presenten una constant. Pels metalls que no són lipòfils en la seva forma orgànica o es coneix bé i dependrà del seu mecanisme de resposta.
Factor de bioconcentració (BCF: ens ajuda a predir la taxa de bioconcentració per a contaminants orgànics en organismes aquàtics i terrestres.
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
La bioacumulació de metalls en organismes dependrà dels seus mecanismes de resposta, que en ser molt variables no permeten fer generalitzacions sobre la seva bioacumulació en diferents espècies.
Biomagnificació : increment de les concentracions amb el nivell tròfic, degut a la transferència a través de la xarxa tròfica.
- El compost químic ha de ser persistent, el metabolisme en essers vius ha de ser baixa o negligible.
- Les pèrdues per excreció i en la transferència a través de la cadena alimentària ha de ser baixa o negligible.
- El compost químic s’ha de trobar adaptat en el lloc d’emmagatzematge del organisme.
TEMA 3: Toxicocinètica I. Distribució i Excreció de Tòxics
Primer hi ha una intoxicació que es dona per contacte amb el tòxic, després hi ha una absorció, tot i que no sempre perquè pot haver-hi un efecte tòxic local. Després es distribueix per la sang generalment i d’allà als òrgans, sobretot a l’òrgan diana que és l’òrgan sobre el qual afecta.
La relació entre la dosi d’exposició i la dosi efectiva depèn dels diferents processos de la fase toxicocinètica. Els individus i les espècies poden ser molt diferents entre sí,especialment en la capacitat per biotransformar el tòxic.
Vies d’entrada dels tòxics
- Digestiva: l’entrada és lenta i al passar pel fetge es pot eliminar.
- Pulmonar: important pels contaminants de l’aire. És molt més eficient i ràpid, per exemple la cocaïna.
- Parenteral.
- Cutània: pot haver una exposició dèrmica a un contaminant; com per exemple la cloració de l’aigua es generen productes residuals tòxics.
Les substàncies han de travessar membranes. Les substàncies
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
- Amatòxia (bolets).
- Cd2+. El cadmi entra a les cadenes tròfiques per mitjà dels aliments, sobretot els musclos. Acostuma a tenir efectes per toxicitat crònica. Al fetge tenim una proteïna, la metal·lotioneina, que presenta moltes proteïnes Cys i capta el Cd (aprofita el sistema natural del Zn); el complex Cd-MT va a la sang, tot i que una part va al fetge, fins arribar als ronyons que l’eliminaria per mitjà dels glomèruls que els filtra i van a l’orina. A l’orina es recapta la MT i s’allibera el Cd2+ degut a que l’orina es capten les proteïnes. S’ha demostrat que en toxicitat crònica el Cd s’acumula i produeix insuficiència renal.
Una substància liposoluble no va dissolta en el plasma (com els DDT) i s’enganxa a les proteïnes del plasma per on es transporta. Les substàncies liposolubles normalment estan unides a proteïnes grosses que dificulten la filtració pels glomèruls. Si la substància es liposoluble, després de la filtració, són difícils d’eliminar perquè l’orina es produeix un traspàs a la sang per gradient de concentració (augmenta molt la concentració a les cèl·lules renals). La solució desenvolupades pels organismes és metabolitzar aquestes substàncies liposolubles en substàncies més polars que es puguin dissoldre en el aigua. Si les
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
substàncies són de mida molecular petita (com la majoria de tòxics d’interès) filtraran al glomèrul (si no circulen unides a proteïnes).
Però si són liposolubles, són reabsorbides a mesura que es va concentrant la orina al túbul renal.
Hi ha substàncies que poden ser difícils d’eliminar com els cianohalogenats que són liposolubles i els organismes no tenen mecanismes eficients per metabolitzar enllaços C-Cl degut a que en l’evolució els organismes no ens hem exposat a aquests compostos. Exemples d’organoclorats són els PCBs, dioxines, DDT, hexaclorobenzè. El Pb i el Cd no són liposolubles però també s’acumulen degut a que hi ha una substitució pel Ca2+ dels ossos, no causa lesió en aquests però pot produir osteoporosis i mobilitzar-se.
Si la taxa d’eliminació és inferior a la taxa d’entrada es produeix una acumulació l’organisme degut a una exposició crònica, Hi ha substàncies que arriben a un estat estacionari, altres no són com els PCBs. La bioacumulació en els organismes pot acabar produint la biomagnificació.
Hi ha altres factors, apart de a liposolubilitat, que fan que s’acumulin tòxics. Segons el tipus de teixit, s’acumulen uns teixits o uns altres. Exemples:
- Ronyó: Cd i Hg, No són liposolubles però s’acumulen.
- Teixit ossi: Pb. Substitueix al Ca. Si l’ós es renova o hi ha alguna malaltia (osteoporosi) s’allibera i pot provocar toxicitat. No és perillós, tampoc és liposoluble.
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
No sempre funciona al 100% i per tant el producte no es metabolitza completament i es produeixen radicals lliures que posseeixen electrons desaparellats que poden reaccionar amb proteïnes, àcids nucleics... i això pot ser dolent per la cèl·lula.
Reaccions Fase II
Fase destoxificadora, conjuga els metabòlits restants de la fase I amb productors del metabolisme com el glutació (GST). Els catalitzen les transferases. El nom de transferasa va en funció de que transfereix. Ho fan les cèl·lules de qualsevol organisme.
L’exposició crònica del benzè en humans pot ser mortal, la medul·la òssia deixa de funcionar.
Dues substàncies que s’assemblen molt en quant a estructura química podran tenir un efecte molt diferent de toxicitat.
Quan l’organisme conjuga pot passar que al conjugar un tòxic l’organisme no tingui disponible el compost transferit. Això però no acostuma a passar al medi ambient.
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
Bioactivació
No sempre és positiu metabolitzar, perquè pot passar que el metabòlit sigui més tòxic que el parental. Es coneix com a bioactivació. Un exemple massa amb els insecticides organofosfats: es produeix una inhibició de les colinesterases que són uns enzims que poden eliminar, en bones condicions, els neurotransmissors (missatgers) anomenats acetilcolines i que si segueixen presents és dolent. Abans que sigui capaç d’inhibir, però, s’ha de bioactivar per mitjà de la metabolització dels organofosfats. Com que s’ha d’activar, la toxicitat és una mica mé baixa que si estigues directament com a metabòlit.
Un altre exemple és el benzopirè, que és un compost de combustió incompleta (hidrocarbur policíclic aromàtic).
El paracetamol es conjuga correctament però si es pren molt es produeix un producte electròfil degut a la saturació, que s’elimina per l’orina, però si la dosi és molt forta pot degradar les cèl·lules hepàtiques.
Estem exposats a moltes substàncies que interaccionen. Els HPA augmenta l’activitat 1A1. Hi ha substàncies inhibidores i altres inductores. No és la mateixa activitat metabòlica en un humà que en una rata o altres.
TEMA 5: Mecanismes d'Acció dels Tòxics
Els tòxics actuen sobre un òrgan diana produint una lesió molecular que pot reparar-se de nou. Abans d’arribar a l’òrgan diana han de passar un mecanisme de protecció. Un tòxic per arribar a un efecte clínic ha de passar per moltes etapes.
Es gasta un esforç en els mecanismes de protecció i defensa, per tant es paga un preu per a la seva supervivència.
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
Atac a radicals lliures. Substàncies amb 1e-^ desaparellat que produeixen un elevada reactivitat i ataquen als lípids i a les proteïnes. El paraquat (herbicida) es redueix amb NADPH i es torna a oxidar per O produint un radical superòxid que és molt agressiu.
Dianes moleculars
- Efectes a nivell de proteïnes
Un tòxic s’apropa a una proteïna de manera que per contacte canvia la seva conformació o estructura espacial. Existeixen al·lèrgies per causes ambientals i això es deu al canvi de conformació que produeix una resposta immunològica. El tòxic modifica l’estructura de la proteïna, produint alteracions:
- Inhibició enzimàtica.
- Agonisme en receptors. Substàncies capaces d’unir-se a un receptor cel·lular i provocar una resposta en la cèl·lula.
- Antagonisme en receptors. Substàncies que s’uneixen a un receptor cel·lular però no provoca una resposta biològica, el bloqueja.
- Alteració de proteïnes transportadores.
- Alteració del recanvi metabòlic.
- Activitat immunogènica.
El Pb2+^ és un metall pesant que té una característica molt general i és que actua d’una forma molt inespecífica amb moltes proteïnes; s’uneixen a moltes proteïnes. Això provoca que hi hagi una toxicitat molt variable. Tenim una ruta bioquímica per sintetitzar el grup hemo i el Pb2+ és inhibidor de 3 enzims. La intoxicació per Pb2+ crònica provoca anèmia, El Pb2+ té múltiples dianes moleculars.
Hi ha tòxics que actuen sobre els receptors com són les dioxines, Les dioxines són substàncies que s’originen en processos de combustió, són compostos halogenats clorats que es biomagnifiquen. Algunes de les dioxines són els compostos més tòxics, produeix càncer i altres malalties a baixes concentracions. Una proteïna rep a la dioxina perquè té la capacitat d’aferrar-se, entra a la cèl·lula i incrementa la transcripció de gens a les cèl·lules. Un dels gens que augmenta la seva transcripció és el CYP1A1.
També pot passar que actuïn sobre les proteïnes transportadores com la hemoglobina que pot passar de Fe2+^ a Fe3+^ produint metahemoglobina que provoca la metahemoglobina, sobretot en els nens. Es coneix com la “síndrome del nen blau”, produït per l’oxidació del NO 3 -^ a NO 2. El monòxid de carboni (CO) és un altre exemple.
Curs 2013 – 2014 Berna Dolz
Una diana important també és el ADN amb enllaços covalents. Un exemple és el benzopirè, per això tenim moltes reparacions de l’ADN per mitjà de sistemes. Si aquesta cèl·lula es divideix abans de reparar-se poden induir un error en la polimerasa. El problema està si es produeix en cèl·lules genitals o somàtiques. Una substància que afecti a l’ADN és probablement un agent cancerigen.
- Efectes a nivell de lípids
Una altre diana molecular són els lípids, que pot de rebot afectar a les membranes, i, doncs, a les cèl·lules. Els tòxics poden generar radicals lliures que afecten als lípids. Amb un radical es suficient com per a que es donin “n” voltes per oxidació dels lípids. Es generen peròxids de lípids que són tòxics.
- Efectes a nivell cel·lular
Els mecanismes d’acció a nivell cel·lular poden ser directes, si acaba directament a la cèl·lula, o indirectes, ja que si afecta al fetge potser afecta a nivell d’hormones. Hi ha tòxics que poden afectar a les respostes sinàptiques com els insecticides organofosfonats, que inhibeixen l’acetilcolinaterassa, que elimina els neurotransmissors i es produeix un excés de colitestanasa.
A la cèl·lula diana pot passar:
- Mort cel·lular degut a l’alteració vital de la cèl·lula.
- Altera funcions fisiològiques.
- Alteració de la divisió i diferenciació cel·lular de forma incorrecta (càncers i lesions letals).
Efectes a nivell fisiològic
S’elaboren quadres d’efectes. A partir del mecanisme d’acció es pot explicar tots els imptoes. No es po fer amb tots, ja que amb alguns és molt difícil ja que les manifestacions clíniques poden ser variables en funció de:
- Dosi, factors toxicocinètics i toxicodinàmics.
- Precocitat i eficàcia del tractament.
- Complicacions.
Tema 5. II Carcinogènesi
Les substàncies químiques produeixen càncer. Els tòxics poden alterar els processos de divisió i diferenciació actuant directament sobre el material genètic cel·lular (genotòxics) o indirectament. Les conseqüències poden ser molt variables, entre elles el desenvolupament de tumors (carcinogènesi).
El primer senyor que ho va afirmar va ser P. Pott (Pepot? Jiiji), que va relacionar el sutge (hollín = All in) de les xemeneies amb el càncer d’escrot, i posteriorment es va descobrir que eren els HAPs. Per què ho produeixen? Fa molts anys s’intentava experimentar amb el càncer de pell amb rates, que eren pintades amb benzopirè i ester de forbol durant un període de dos anys. Si es pintava l’animal cada dia en petites dosis produïa càncer; si era puntual no. Els èsters de de forbol no li produïa càncer pintant cada dia. Per tant la cancirogènesi suposa dos fenòmens:
- Iniciació (com el benzopirè). Són un procés amb memòria a la cèl·lula, al genoma.
