Trabajo de microscopía, Apuntes de Biología

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1º LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO

1. Introducción al microscopio.
2. Tipos de microscopía: Microscopía óptica.
   • Definición y fundamento.
   • Tipos de microscopios ópticos:  Fundamento.  Aplicaciones. Microscopía electrónica.
   • Definición y fundamento.
   • Tipos de microscopios electrónicos:  Fundamento.  Aplicaciones.
3. Bibliografía.

INTRODUCCIÓN AL MICROSCOPIO

DEFINICIÓN

Es un tipo de microscopía que se realiza mediante el uso de un microscopio óptico. El microscopio óptico fue el que inauguró la era de la microscopía en el siglo XVII y es el tipo más básico de microscopio. Su funcionamiento está basado en un conjunto de lentes y el uso de luz visible para aumentar la imagen de una muestra.

FUNDAMENTO

En un microscopio óptico podemos distinguir entre el sistema óptico y el sistema mecánico.  El sistema óptico incluye el conjunto de lentes y elementos de manipulación de la luz necesarios para generar una imagen aumentada.  El sistema mecánico proporciona el soporte estructural a los anteriores elementos. Dentro del sistema óptico se incluye un foco (también denominado fuente de luz) que emite rayos de luz dirigidos hacia la muestra. Antes de llegar a la muestra los rayos atraviesan un condensador, la función del cual es concentrar los rayos de luz sobre la preparación a observar. Habitualmente el condensador está acoplado con un diafragma para regular la cantidad de luz incidente. El siguiente elemento óptico es el objetivo. Esta parte del microscopio consiste básicamente en un conjunto de lentes que reciben la luz proveniente de la muestra y permiten aumentar la imagen observada. Por último, el ocular amplía la

imagen proveniente del objetivo y es a través de él que se puede observar finalmente la muestra. En cuanto al sistema mecánico hay en primer lugar una base o pie que permite mantener el microscopio en posición estable. El brazo es la estructura principal del microscopio y conecta la base con el sistema óptico. El sistema mecánico incluye también la platina, es decir, la pieza horizontal donde se coloca la muestra. La platina no está conectada de forma fija con el brazo sino que su posición se puede regular mediante los tornillos macrométrico y micrométrico. El revólver es la parte del microscopio donde están montados los objetivos, normalmente 3 o 4, y que puede girar para seleccionar el objetivo deseado. Finalmente, el tubo conecta los objetivos con el ocular. El principio de funcionamiento de un microscopio óptico se basa en la propiedad de algunos materiales que permiten cambiar la dirección de los rayos de luz. Esto permite fabricar lentes capaces de hacer converger o divergir los rayos de luz. Mediante la combinación de estas lentes se puede generar una imagen aumentada de cualquier objeto. El ejemplo más sencillo sería utilizar una sola lente, como en el caso de una lupa, para producir una imagen aumentada de una muestra. En el caso de un microscopio óptico se genera la imagen aumentada a partir de distintas lentes. Algunas de ellas montadas en el objetivo del microscopio y otras en el ocular. En primer lugar las lentes del objetivo generan una imagen real aumentada de la muestra. Esta imagen real es a continuación ampliada mediante las lentes del ocular dando lugar a una imagen virtual de tamaño superior a la muestra original. El otro elemento esencial para el funcionamiento del microscopio óptico es la luz. Es por este motivo que los microscopios ópticos vienen

En este caso la luz ilumina la muestra y parte de esta es reflejada y dirigida al objetivo. De este modo es necesario iluminar la muestra desde la parte superior de la platina. Este tipo de microscopía es utilizada para examinar materiales opacos como pueden ser estructuras metálicas, materiales cerámicos, etc. Existen microscopios ópticos que permiten los dos tipos de iluminación de modo que es posible observar tanto muestras semitransparentes como opacas. Los microscopios estereoscópicos (permiten observar la muestra en tres dimensiones) son siempre de luz reflejada.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

DEFINICIÓN

Un microscopio electrónico usa electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar amplificaciones mayores antes que los mejores microscopios ópticos, debido a que la longitud de onda de los electrones es bastante menor que la de los fotones. El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1932 , quienes se basaron en los estudios de Louis- Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones.

FUNDAMENTO

Las partes principales de un microscopio electrónico incluyen aquellos elementos utilizados para generar electrones y dirigirlos hacia la muestra. Esto incluye:

• Fuente de electrones: Es equivalente a la fuente de luz en un microscopio óptico. En este caso es necesario disponer de un emisor de electrones. En general se utiliza un filamento de tungsteno. Este filamento es calentado de modo que la energía de sus átomos y electrones aumenta. A partir de un cierto nivel energético los electrones poseen suficiente energía para escapar de sus átomos. Estos electrones libres son a continuación dirigidos hacia la muestra.
• Lentes electromagnéticas: Los microscopios ópticos utilizan lentes convergentes y divergentes para desviar los rayos de luz y aumentar así la imagen de la muestra. Este mismo procedimiento no puede ser aplicado para desviar la trayectoria de los electrones. En lugar de utilizar lentes de vidrio, los microscopios electrónicos utilizan lentes electromagnéticas. Estas lentes generan campos eléctricos y magnéticos de modo que su interacción con los electrones hace que sus trayectorias diverjan o converjan en un punto.

El microscopio electrónico es un tipo de microscopio que funciona mediante un haz de electrones, en lugar de la luz visible, como es el caso del microscopio óptico. En primer lugar el cañón emite un haz de electrones. El microscopio genera dicho haz de electrones mediante un emisor de electrones. Este emisor suele estar formado por un filamento de tungsteno, por el que se hace circular una corriente de alto voltaje que se hace que se caliente. Esto hace que los electrones formen una corriente continua, que se utiliza como haz de luz. Cuando los átomos de este metal son excitados por la energía térmica, los electrones salen del átomo. El haz de electrones emitido atraviesa diferentes tipos de lentes electrónicas que van modificando la trayectoria del mismo. En un punto determinado del microscopio el haz de electrones impacta contra el objeto de muestra. La ampliación de la imagen se consigue gracias a la propiedad que poseen los electrones de ser desviados por campos electrostáticos o magnéticos, en un proceso que es similar al comportamiento de un rayo luminoso que se desvía al atravesar una lente. Las lentes magnéticas permiten enfocarlos sobre la muestra, iluminándola. La fuerza de la lente magnética viene determinada por la corriente que pasa por ella. A mayor flujo de corriente, mayor fuerza del campo magnético. El aumento de los microscopios está directamente relacionado con la longitud de onda del medio con el que se observa. Cuanto menor sea la longitud de onda, mayor será la resolución obtenida. Puesto que la longitud de onda del movimiento del electrón es inversamente proporcional a su velocidad, al acelerar los electrones hasta alcanzar velocidades muy altas, conseguimos longitudes de onda muy cortas. Una vez que el haz de electrones atraviesa la muestra, se produce una amplificación por la acción de las lentes magnéticas que forman una imagen sobre una placa fotográfica o pantalla sensible que envía la información al ordenador para poder visualizarla. Dependiendo del tipo de microscopio electrónico, el haz atravesará la muestra (si se trata de un microscopio electrónico de transmisión) o bien rebotará en la muestra (si se trata de un microscopio electrónico de barrido). A continuación se recogen con ayuda de un detector o pantalla

fluorescente los parámetros del haz de electrones, una vez este ha interactuado con la muestra. En resumen, los electrones acelerados impactan en la muestra de la misma forma que la luz lo haría. Algunos de ellos son reflejados mientras que otros la atraviesan. Gracias a la detección de estos electrones podemos reconstruir la imagen del objeto Finalmente estos datos se envían a un ordenador que los procesa digitalmente y genera imágenes que se puede visualizar en una pantalla. A continuación vamos a explicarte de forma más detallada cada uno de los procesos del fundamento del microscopio electrónico. Pero presenta una serie de limitaciones como:

• La limitada apertura no permite que la información detallada alcance la imagen, limitando de este modo la resolución.
• El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza corpuscular de los electrones) se debe al contraste de difracción, provocado por la pérdida de electrones del rayo. Es un contraste dominante en especímenes gruesos.
• El contraste de fase (que radica en la naturaleza ondulatoria de los electrones) se debe al contraste de interferencia provocado por los desplazamientos en las fases relativas de las porciones del rayo. Es un contraste dominante en especímenes finos.
• Existen también distintas aberraciones producidas por los lentes: astigmática, esférica y cromática.
• El problema de la función de transferencia de contraste (CTF en inglés): la FTC describe la respuesta de un sistema óptico a una imagen descompuesta en ondas cuadráticas. El material biológico presenta dos problemas; el entorno de vacío y la transferencia de energía. Para resolverlos, se utilizan distintas técnicas dependiendo del tamaño de la muestra:
• Para muestras grandes como órganos, tejidos o células, se utilizan tres técnicas:  Fijación química o la criofijación  Inclusión en resinas (criosustitución)  Réplica metálica.
• Para muestras pequeñas como complejos macromoleculares se utilizan las siguientes técnicas:  Tinción negativa; Los agentes de tinción más usados son el molibdato amónico, el fosfotungstato sódico y sales de

atraviesan la muestra y llegan al detector) y zonas más claras (más electrones atraviesan la muestra y llegan al detector). Para utilizar esta técnica es necesario preparar la muestra para que sea muy delgada (espesor inferior a 2000 ángstroms). De lo contrario, demasiado espesor impide que los electrones puedan atravesarla. Esta técnica de microscopía es muy útil para visualizar los detalles internos de una muestra, por ejemplo, estructuras cristalinas. A nivel conceptual esta técnica es similar a realizar una radiografía de la muestra. La principal limitación que tiene esta técnica es que no permite extraer información de la superficie de la muestra. Es decir, no permite observar detalles como la forma o rugosidad de la muestra que se observa. Para observar este tipo de características es necesario utilizar la microscopía electrónica de barrido. Microscopio electrónico de barrido (MEB) En el microscopio electrónico de barrido también es necesario que los electrones impacten contra la muestra. En este caso, los electrones no iluminan toda la muestra simultáneamente sino que se hace un escaneado recorriendo los distintos puntos de la muestra. Cuando los electrones impactan con la muestra estos pierden parte de su energía debido a distintas interacciones. Parte de su energía inicial se transforma en calor o en emisiones de rayos X. Además, se produce también la emisión de electrones que se desprenden de la superficie de la muestra. Estos electrones se conocen como electrones secundarios. El principio de funcionamiento de los microscopios electrónicos de barrido se basa en medir alguna de estas propiedades para extraer información de la muestra observada. Generalmente, esto consiste en medir la cantidad

de electrones secundarios que emite la superficie cuando es bombardeada con electrones. Esta técnica de microscopía es muy útil para observar los detalles de la superficie de microorganismos. Es habitual realizar una preparación de la muestra depositando primero una capa de metal sobre la muestra. De esta forma, existen más electrones secundarios que pueden desprenderse cuando se aplica el haz principal de electrones. Este proceso de preparación es en general más sencillo que el que se debe realizar para la microscopía electrónica de transmisión. El aumento que alcanza este tipo de microscopios es menor que el que se puede obtener con un microscopio electrónico de transmisión. Sin embargo, la información tridimensional que proporciona esta técnica lo convierte en un instrumento muy útil para determinados tipos de muestras.

BIBLIOGRAFÍA

https://www.mundomicroscopio.com/