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Fisiología General (14801)
TRABAJO PRÁCTICO N° 2:
El potencial de membrana y el impulso
nervioso.
Integrantes
● Soriano, Daniel Alejandro (181321) ● Veltri, Melina Denise (180879)
Introducción
Si bien la comunicación intercelular es clave en todos los organismos pluricelulares, en el caso del reino animal cabe pensar que la capacidad de intercambiar mensajes a grandes distancias en poco tiempo haya sido un factor determinante en cuanto al tamaño que estos pudieran alcanzar; con el corolario de las ventajas adaptativas que puede implicar un mayor tamaño. Asimismo, la rápida coordinación de funciones entre órganos distantes permite acelerar procesos fisiológicos y coordinar respuestas al medio. En este sentido la aparición de los mecanismos de comunicación por impulsos eléctricos y el posterior surgimiento del tejido nervioso pueden considerarse un hito en la evolución animal. Estudios recientes sugieren que los primeros indicios, tanto genéticos como moleculares, pueden ser encontrados en representantes del filo Placozoa (Najle y otros, 2023). El desarrollo de estas funciones especializadas no hubiera sido posible sin la preexistencia de las propiedades eléctricas de la membrana de la célula animal, que habilitaron el posterior surgimiento de las células excitables. Galvani y Volta fueron pioneros en el estudio del funcionamiento de estos tejidos excitables, marcando el camino para posteriores investigadores que esclarecieron las propiedades eléctricas de las membranas celulares, su origen y los mecanismos de la conducción de impulsos eléctricos en el sistema nervioso (Randall y otros, 2002, pág. 146). Los conocimientos generados desde ese entonces nos permiten entender diversas características de la fisiología y conducta animal, así como explicar los efectos que generan algunas drogas sobre el sistema nervioso o la etiología de enfermedades que lo afectan. Las propiedades eléctricas de la membrana se desprenden en buena medida de su composición. La naturaleza anfipática de los fosfolípidos, que genera una zona intermedia apolar, hace a la capacitancia de la membrana; esta es su capacidad de separar cargas (iones). A su vez, la permeabilidad diferencial de la membrana a los distintos iones resulta en valores de conductancia (inversa de la resistencia) propios de cada ion; que en conjunto con el accionar de la bomba de Na+/K+^ mantienen concentraciones
Fisiología General (14801) desiguales de estos cationes en ambas caras (intracelular y extracelular) de la membrana. La bomba compensa la difusión pasiva de los iones moviéndolos en contra de su gradiente electroquímico con gasto de energía, lo que resulta en un estado de equilibrio dinámico y el mantenimiento del potencial de membrana en reposo. En la era de la informática, los simuladores como el usado en este trabajo (HHSim), y otros como PhysioEx 10.0, resultan en recursos didácticos valiosos para estudiar el funcionamiento del sistema nervioso sin tener que llevar a cabo experiencias complejas que requieran de materiales e instrumentos que no son de fácil acceso. En el caso del primero, permite evaluar el funcionamiento de una neurona sometida a diversas condiciones experimentales reguladas por el usuario observando en el osciloscopio el potencial de membrana en reposo, la conductividad de los distintos iones y otros parámetros de interés; enfocándose en el fenómeno de potencial de acción (PA) ante la aplicación de distintos estímulos eléctricos. El PA se define como un cambios breves e intensos del potencial de membrana que se propaga a lo largo del axón sin decremento (Randall y otros, 2002, pág. 159). El presente trabajo tiene como objetivo investigar la excitabilidad de la célula para comprender el significado de los parámetros de activación e inactivación responsables del comportamiento electrofisiológico de la neurona mediante el desarrollo de experimentos simulados.
Materiales y métodos
● HHSim (Graphical Hodgkin-Huxley Simulator): Programa de simulación gráfica de una sección de membrana de una neurona excitable utilizando las ecuaciones de Hodgkin-Huxley, desarrollado por la Facultad de Ciencias de la Computación de la Universidad de Carnegie Mellon. ● Computadora HP Pavillion x360 Convertible 14-dy2xxx Para el desarrollo de las distintas experiencias se siguió el protocolo indicado en la guía de trabajos prácticos de la asignatura. Resultados
1. Membrana
Paso 1 Modificando las concentraciones intracelulares de los iones Na+, K+^ y Cl-^ (ver Tabla 1), sin modificar sus concentraciones fuera de la célula, se obtiene un PA espontáneo y repetitivo con una despolarización mayor (aproximadamente 60 mV) que la observada en condiciones estándar (39 mV). Al aplicar el estímulo estándar (10 nA por 1 ms) no se obtiene respuesta.
Fisiología General (14801) Ilustración 2. Captura del osciloscopio luego de establecer los parámetros según la Tabla 2. Paso 3 Modificando la concentración de estos iones dentro y fuera de la célula el potencial de membrana en reposo cambia, siendo aproximadamente - 24 mV. Las conductancias de los iones K+^ y Na+^ se modifican (15,7 pS y 0,82 pS respectivamente). En estas condiciones, la neurona no responde al estímulo predeterminado de 10 mV por 1 ms ni al de - 10 mV por 2 ms. Tabla 3. Concentración intra y extracelular de Na+, K+ y Cl- y sus potenciales de equilibrio. Iones Intracelular (mM) Extracelular (mM) Eión (mV) Na+^ 70 300 35 K+^ 250 80 - 27, Cl-^ 90 400 - 35,
Fisiología General (14801) Ilustración 3. Captura del osciloscopio luego de establecer los parámetros según la Tabla 3.
2. Canales
En esta actividad se modificaron de forma individual las conductancias de los canales pasivos del Na+, K+ y Cl-. Luego se bloquearon los canales de Na+^ dependientes de voltaje. Finalmente, al paso anterior, se le sumó el aumento de la conductancia de los canales pasivos del Na+. Paso 1 Modificando la conductancia de los canales pasivos del Na+^ a 0,5 pS y manteniendo los otros valores iguales se despolariza la membrana de forma espontánea y repetitiva hasta valores cercanos a 0 mV.
Fisiología General (14801) del gráfico). Frente a un estímulo de - 10 mV por 2 ms la membrana se hiperpolariza y luego se desencadena un PA (segunda sección del gráfico). Ilustración 6. Captura del osciloscopio luego de establecer la conductancia del Cl- en 1,0 pS Paso 4 En otra instancia, se bloquearon los canales de Na+^ dependientes de voltaje y se aplicaron dos estímulos (Imagen 7). Primero 10 mV por 1 ms ocasionó una despolarización leve de la membrana (varía aproximadamente en 8 mV). El segundo fue - 10 mV por 2 ms, la membrana se hiperpolariza (variando 12 mV). Ilustración 7. Captura del osciloscopio luego de bloquear los canales de Na+ dependientes de voltaje.
Fisiología General (14801) Paso 5 Finalmente, al bloquear los canales de Na+^ dependientes de voltaje y aumentar la conductancia de los canales pasivos del Na+^ (a 2 pS) el potencial en reposo de la membrana cambió a - 42,5 mV. No responde a ninguno de los dos estímulos que fueron aplicados en las situaciones anteriores (Imagen 8). Ilustración 8. Captura del osciloscopio luego de bloquear los canales de Na+ dependientes de voltaje y establecer la conductancia de los canales pasivos de Na+ en 2 pS
3. Potencial de acción de membrana
Paso 1 A continuación, se fue aumentando la intensidad del estímulo progresivamente en una unidad y aplicando en cada oportunidad un estímulo. Se observó que a los 4 nA la membrana se despolariza alcanzando los 40 mV (PA). La conductancia del Na+^ tiene un comportamiento similar al pico que describe el potencial de acción (ver Imagen 9, pico amarillo). Mientras que la curva que representa la conductancia del K+^ (pico verde) alcanza su máximo pocos milisegundos después que el punto máximo del PA.
Fisiología General (14801) Ilustración 11. Captura del osciloscopio al incrementar gradualmente la intensidad del estímulo con los canales de Na+ dependientes de voltaje desactivados. Paso 3 Experimento efecto de la duración del estímulo Con la intensidad del estímulo fijada en 1 nA, se aumentó gradualmente su duración en una unidad, iniciando con 1 ms. Cuando el estímulo tiene una duración de 4 ms y es aplicado 2 veces consecutivas (ver referencia en Imagen 1 2 ) se genera un PA. Ilustración 12. Captura del osciloscopio al incrementar gradualmente la duración del estímulo. Si bien no se presenta en este trabajo la imagen correspondiente, observamos que estímulos más duraderos (entre 6 y 20 ms) no se traducen a una despolarización de la membrana suficiente para superar el potencial umbral. Paso 4
Fisiología General (14801) Experimento: Suma de los estímulos subumbrales Aplicando un estímulo de 3 nA por 1 ms vemos que el potencial en reposo de la membrana no se modifica notoriamente (apenas supera los - 60 mV), algo similar ocurre con las conductancias del Na+^ y el K+^ que se encuentran en valores cercanos al 0 pS. Sin embargo, al utilizar un estímulo de la misma intensidad y duración 2 veces con un intervalo entre ellos de 1 milisegundo se observa un PA. Ilustración 13. Captura del osciloscopio aplicando estímulos subumbrales. Paso 5 Por otra parte, para comprobar el efecto de los estímulos en los períodos refractario absoluto y refractario relativo fijamos el estímulo inicial (1° pulso) en 10 nA por 1 ms y el segundo estímulo (2° pulso) en 100 nA (la mayor intensidad que permite el programa) por 1 ms, partiendo de allí modificamos en una unidad el intervalo entre estímulos comenzando en 1 ms. En todas las instancias el 1° pulso desencadena un PA con un pico cuyo punto máximo está cerca de los 40 mV. En los primeros casos, donde el intervalo entre estímulos es de 1 y 2 milisegundos, el 2° pulso no provoca alteraciones en las conductancias del Na+^ y el K+^ ni desencadena un PA. Al aumentar el tiempo entre estímulos, observamos que se produce un segundo PA, con un intervalo de 4 ms el PA alcanza un valor máximo de 21,1 mV y 33 mV cuando el intervalo es de 5 ms. Al establecer el tiempo entre estímulos en 3 ms se observa un segundo pico que alcanza los - 38 mV el cual no consideramos un PA ya que no está acompañado por un aumento en la conductancia del Na+^ producto de la apertura de los canales de Na+^ dependientes de voltaje (retomaremos esta observación en el apartado de discusiones y conclusiones).
Fisiología General (14801) Tabla 5. Protocolo para la determinación del periodo refractario relativo Repetición 1° pulso PA (Si/No) Intervalo 2° pulso PA (Si/No) A 10 nA por 1 ms Si 5 ms 10 nA por 1 ms No B 10 nA por 1 ms Si 5 ms 20 nA por 1 ms No C 10 nA por 1 ms Si 5 ms 30 nA por 1 ms Si Ilustración 15. Captura del osciloscopio en la aplicación del protocolo anterior.
4. Drogas
Paso 1 Acción de la tetradotoxina (TTX) sobre el potencial de acción Para este experimento el estímulo aplicado tuvo una intensidad de 6 nA y una duración de 1 ms. Comenzamos realizando un control sin inhibición (Imagen 13a) y una prueba con 10% de inhibición (Imagen 13b), comparando estas dos situaciones observamos que: se retarda el inicio del PA respecto al estímulo; la corriente de Na+^ disminuye (línea celeste); la conductancia del K+^ no se ve afectada y la del Na+^ disminuye ligeramente. Cuando el efecto inhibitorio de la TTX se fija en 20% (Imagen 13c) la conductancia del Na+^ disminuye aún más, sin embargo, ocurre un PA. La última prueba se realizó con una inhibición del 25% (Imagen 13d), en estas condiciones ya no se observa despolarización de la membrana ni un PA, la corriente de Na+ permanece constante y las conductancias del Na+^ y el K+^ se mantienen bajas, sin sufrir modificaciones.
Fisiología General (14801) Ilustración 16 a. Captura del osciloscopio aplicando un estímulo de 6 nA por 1 ms. Ilustración 17 6b. Captura del osciloscopio aplicando un estímulo de 6 nA por 1 ms y un efecto inhibitorio del 10% de la TTX. Ilustración 18 6c. Captura del osciloscopio aplicando un estímulo de 6 nA por 1 ms y un efecto inhibitorio del 20% de la TTX.
Fisiología General (14801) Ilustración 17b. Captura del osciloscopio aplicando un estímulo de 6 nA por 1 ms y un efecto inhibitorio del 25% del TEA. Ilustración 17c. Captura del osciloscopio aplicando un estímulo de 6 nA por 1 ms y un efecto inhibitorio del 50% del TEA.
Fisiología General (14801) Ilustración 17d 20. Captura del osciloscopio aplicando un estímulo de 6 nA por 1 ms y un efecto inhibitorio del 100% del TEA. Paso 3 Acción de la pronasa sobre el potencial de acción Bajo el efecto de la pronasa observamos que el potencial en reposo de la membrana aumenta a 27,3 mV. Por otro lado, no se produjeron PA al aplicar estímulos de distintas intensidades y duraciones y con distintos intervalos de tiempo entre ellos. Ilustración 18 21. Captura del osciloscopio aplicando distintos estímulos bajo la acción de la pronasa.
Fisiología General (14801) Por otra parte, bloqueando los canales de Na+^ dependientes de voltaje y aumentando la conductancia de los canales pasivos del Na+^ el potencial en reposo de la membrana cambia, alcanzando un valor cercano al potencial de equilibrio del Na+^ en condiciones normales. En este caso el cambio en la permeabilidad al Na+^ no desencadena PA espontáneos como en el caso anterior porque los canales dependientes de voltaje que lo causan no se encuentran disponibles. Al no haber PA tampoco hay respuesta de los canales de K+^ que repolarizarían la membrana. El mayor flujo de sodio por lo tanto desplaza el potencial en reposo de la membrana hacia un nuevo equilibrio más próximo al potencial de equilibrio del ion. Las circunstancias para el Cl-^ son similares a las del K+. Dado que la permeabilidad del anión en condiciones normales es relativamente alta, los cambios en este factor tienen poca incidencia en el funcionamiento eléctrico de la membrana.
3. Potencial de acción de membrana
Observamos que el umbral de excitación de la célula se encuentra en - 60 mV, los estímulos que logran superar este umbral desencadenan un PA, mientras que los que quedan por debajo no provocan un PA. Las conductancias del Na+^ y el K+^ aumentan al superarse el umbral, ya que se abren los canales de Na+ dependientes de voltaje (pico amarillo), lo que se corresponde con el pico del potencial de acción, y posteriormente, y de forma más lenta, se abren los canales del K+^ ayudando a que la célula retorne a su potencial de reposo. A su vez, como cabría esperar, al bloquear los canales de Na+^ dependientes de voltaje los estímulos no provocan un PA. El período de latencia es el intervalo de tiempo transcurrido entre la aplicación del estímulo y la respuesta de la célula. Se observa que su duración disminuye en la medida en que se incrementa la intensidad de los estímulos. Esto lleva a pensar que la intensidad del estímulo influye en la velocidad con que se abren los canales de Na+^ dependientes de voltaje.
Experimento efecto de la duración del estímulo
Ante la aplicación repetida de estímulos subumbrales la neurona no respondió generando un PA. Se necesitó de la superposición de dos estímulos de nivel umbral (4 nA) para desencadenar un PA. Esto se debe al fenómeno de acomodación observado en las neuronas (Randall y otros, 2002, pág. 161) donde la consecución de estímulos subumbrales o el incremento gradual de la intensidad del estímulo producen que la célula se “acostumbre” y se incremente el valor umbral para el PA.
Fisiología General (14801)
Experimento: Suma de los estímulos subumbrales
Dos estímulos subumbrales son capaces de generar un PA porque se adicionan sus efectos despolarizantes en un intervalo de tiempo lo suficientemente corto (1 ms). Ya que al aumentar este intervalo de tiempo (a 4 ms) no se desencadena el PA. Este efecto es importante en la fisiología del sistema nervioso ya que es una de las formas de integración de información (sumación temporal) que ocurre en las neuronas (Randall y otros, 2002, pág. 226). A partir de los experimentos para observar el efecto de los estímulos en los períodos refractario absoluto y refractario relativo concluimos que: el período refractario absoluto finaliza luego de 3 ms, a partir de allí inicia el período refractario relativo ya que al aplicar un estímulo lo suficientemente intenso (mínimamente de 90 o 100 nA) hay respuesta o alteración del potencial de membrana. Consideramos como respuesta a la apertura de los canales de Na+^ dependientes de voltaje, esto se ve traducido en el osciloscopio como un aumento de la conductancia del Na+^ (picos amarillos).
4. Drogas
Acción de la tetradotoxina (TTX) sobre el potencial de acción
Observamos que la TTX retarda o evita la generación de PA de manera progresiva a medida que aumenta su concentración (porcentaje de inhibición). Estos resultados son congruentes considerando que esta toxina bloquea selectivamente los canales de Na+^ dependientes de voltaje, por lo tanto, al haber más toxina habrá más canales inactivados. En línea con lo que se fue exponiendo, la inactivación de estos canales afecta a la generación de un PA, ya que la membrana no podrá despolarizarse sin un ingreso de iones Na+. A partir de los resultados obtenidos, consideramos que la TTX bloquearía la compuerta de activación de los canales de sodio dependientes de voltaje. Esto se deduce al observar que en el osciloscopio se reduce la amplitud del pico correspondiente a la corriente de compuerta en la curva de I_Na+^ (corriente de sodio).
Acción del tetraetilamonio (TEA) sobre el potencial de acción
Este compuesto bloquea selectivamente los canales de K+^ dependientes de voltaje, dicho bloqueo disminuye o impide que el potasio salga rápidamente de la célula por vía de los canales dependientes de voltaje después de la despolarización. Debido a esto los iones K+^ terminan saliendo a través de canales pasivos o dependientes voltaje que continúen activos de manera que la célula se repolariza, aunque le
