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TRABAJO PRÁCTICO DE MICROSCOPÍA
OBJETIVOS
- Comprender el uso del microscopio óptico y su importancia en el estudio de la célula.
- Reconocer tipos de células y de tejidos por observación microscópica.
MARCO TEÓRICO
Las células son las unidades básicas de los seres vivos. La mayoría de ellas son de pequeño tamaño por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su visualización. Por lo general el poder resolutivo del ojo humano es de 0.2 mm o sea, si hay dos líneas a 0.2 mm de distancia, veremos una sola línea. Los microscopios se utilizan para mejorar la resolución. El término célula fue usado por primera vez cuando Robert Hooke observó un trozo de corcho en un microscopio de luz en 1665. Luego, Antony van Leeuwenhook observó en 1670 varios tipos de células y finalmente, fue en 1838 cuando Matthias Schleiden y Theodro Schwan propusieron a partir de sus observaciones microscópicas de diversos tejidos la teoría celular “Todos los organismos están compuestos de células, y todas las células provienen de la división de otras células preexistentes”. Estos descubrimientos dieron así origen al nacimiento de la biología celular contemporánea. Las células son muy pequeñas y además son traslúcidas lo que hace imposible su observación por ojo humano desnudo. Es por eso que el microscopio ha sido, y es una de las herramientas más utilizadas en biología. El progreso en la construcción de nuevos microscopios, así como el desarrollo y uso de nuevos métodos de fijación, corte y tinción han permitido una serie de descubrimientos en los campos de la histología, citología y bacteriología, permitiéndonos entender cada vez con más claridad la estructura de la célula y su organización, lo que es una importante ayuda para la comprensión de su funcionamiento.
EL MICROSCOPIO OPTICO Y SUS PARTES.
En términos generales, el microscopio es un sistema de lentes montados en un tubo. La distancia desde el tubo al objeto que se quiere observar puede regularse por medio de dos botones de ajuste, y todo el conjunto está dispuesto sobre un robusto soporte en el que también se apoya la platina sobre la cual se coloca la preparación a observar, y una fuente de luz que se dirige a través del objeto en estudio.
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Las diferentes partes de un microscopio pueden agruparse en 3 sistemas fundamentales: El sistema mecánico se compone del pie en el cual se sustenta el instrumento, y la columna, que se encuentra fijada al pie y sostiene las otras partes del microscopio; el tubo que sostiene los oculares, el revolver portaobjetivos, la platina y el sistema de enfoque, tanto macrométrico (aproximado) como micrométrico (preciso). El sistema óptico se compone de 2 sistemas diferentes de lentes. Los oculares son 2 lentes separados por un diafragma fijo, tienen la función de aumentar la imagen proyectada por los objetivos. Los objetivos son 3 ó 4 lentes ubicados en el revólver, son los que aumentan la imagen y pueden ser secos (entre ellos y la muestra hay una capa de aire) o de inmersión (entre ellos y la muestra se coloca una sustancia especial que permite lograr un aumento mayor). El sistema de iluminación se compone de una fuente luminosa, que es generalmente una lámpara ubicada en el pie o en la base de la columna del microscopio. Si la fuente luminosa es independiente del microscopio, además se necesita de un espejo que refleje la luz y la desvíe hacia el condensador y de un condensador, que a través de un sistema de lentes concentra la luz que llega al condensador se regula por medio de un diafragma ubicado en su parte inferior. Adicionalmente se puede colocar un filtro, generalmente azul, para obtener una luz homogénea y parecida a la luz natural.
FIGURA 1. Esquema de un microscopio óptico en el cual se indican sus partes.
El poder de resolución de un microscopio depende también de la apertura numérica, capacidad de una lente para aprovechar la mayor cantidad de rayos para formar la imagen. Esta puede aumentarse al usar entre el objetivo y el objeto a observar una sustancia con índice de refracción mayor del aire. Para esto se usan los llamados aceites de inmersión. Así, al aumentar la apertura numérica se obtienen mayores aumentos. Este tipo de aceites se usan solamente con objetivos especiales que se llaman lentes de inmersión.
PODERES DEL MICROSCOPIO
El microscopio posee varias características o poderes que determinan en forma importante su utilidad como herramienta de estudio. Estos son:
Poder de aumento: Es la razón entre el tamaño de la imagen que produce el microscopio y el tamaño original del objeto en observación. Este aumento se logra a través del ocular y de los objetivos, y ya que cada uno es capaz de amplificar la imagen, el aumento total logrado se obtiene al multiplicar estos dos valores de aumento. Poder de definición: Es la capacidad del microscopio para formar imágenes nítidas y de bordes definidos. Poder de penetración: Es la capacidad para visualizar los diferentes planos de una preparación y está dado por el ajuste de precisión que se logra con el tornillo micrométrico. Poder de resolución: Permite distinguir como objetos separados dos puntos que se encuentran muy cercanos entre sí.
USO DEL MICROSCOPIO Para un buen uso del microscopio sea cuidadoso y siga atentamente las siguientes instrucciones:
- Asegúrese de que el microscopio se encuentre en una posición cómoda para usted, tomándolo siempre de la columna.
- Encienda la lamparilla.
- Coloque el objetivo de menor aumento.
- Coloque su preparación en la platina asegurándose de que ésta se encuentre con el cubreobjeto hacia arriba.
- Abra totalmente el diafragma iris y suba el condensador casi hasta el tope.
- Si su microscopio tiene espejo, céntrelo para que la preparación reciba el máximo posible la luz.
- Enfoque la preparación bajando el tubo o subiendo la platina. Existe un tope que impide que los objetivos de menor aumento topen la preparación.
- Mire a través del ocular y usando el tornillo macrométrico aleje lentamente el objetivo de la preparación, hasta lograr una imagen más o menos nítida. Termine de enfocar usando el tornillo micrométrico.
- Una vez enfocada su preparación, regule la cantidad de luz que recibe su muestra cerrando para ello el diafragma.
- Si después de realizar todos los pasos anteriores no logra observar su preparación en forma nítida, verifique que la preparación esté ubicada dentro del campo visual y que el cubreobjetos se encuentre mirando hacia arriba. Revise también la limpieza de la preparación, oculares, objetivos, condensador, espejo, y por último, verifique que la iluminación sea la adecuada y que el objetivo se encuentre en su posición correcta.
- Para cambiar de objetivo, gire el revolver hasta el objetivo del aumento que desea utilizar, y vuelva a enfocar su preparación utilizando para ello el tornillo micrométrico.
- Para usar el objetivo de inmersión coloque sobre su preparación una gota de aceite de inmersión, y luego enfoque su preparación con el objetivo inmerso en el aceite. Una vez finalizada la observación, limpie cuidadosamente el objetivo eliminando el aceite de inmersión. Para ello utilice xilol y una hoja de papel para lentes, especialmente dispuesto para ello, pues las pelusas del papel común permanecen en el objetivo y pueden interferir en observaciones posteriores.
- Al terminar su trabajo limpie el resto del microscopio con un paño suave, apague la lamparilla, situé el objetivo de menor aumento en posición de observación, baje la platina, y cubra el microscopio.
OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS
El avance tecnológico ha permitido en los últimos años el desarrollo de una serie de microscopios que con pequeñas modificaciones de los principios básicos del microscopio de luz permiten un mejor estudio de la célula. Algunos ejemplos son los siguientes: Microscopio de contraste de fases: El mayor problema de la observación microscópica de muestras biológicas es el poco contraste que éstas poseen. Las partes invisibles de una preparación son atravesadas por la luz, sin que cambie su amplitud, pero produciendo un cambio en su fase. En este tipo de microscopio los cambios de fase de la luz se traducen en cambios de amplitud, este microscopio permite examinar objetos vivos, así como el seguimiento en ellos de procesos celulares como la mitosis.
FIGURA 3: Imagen de células epiteliales enfocadas con un microscopio de contraste de fase con objetivo 20X.
ACTIVIDADES PRÁCTICAS
Observación de preparaciones biológicas permanentes: Cortes de Intestino delgado, de pulmón, de cerebro, de páncreas, etc. de Rattus norvegicus.
La fijación es un método que se utiliza para preservar la morfología y la composición química de las células que componen una preparación microscópica. Consiste en agregar agentes fijadores a la muestra como acetona, formaldehído o glutaraldehído, los cuales mantienen las interacciones entre las moléculas (proteínas, ácidos nucleicos, etc.) y permiten que las preparaciones duren en buen estado durante meses o años. Uno de los métodos más utilizados para realizar preparaciones permanentes consiste en fijar el material de interés en una solución FAA (formaldehído-alcohol- ácido acético), a una concentración entre 50 y 100% y finalmente embeberlo en parafina para obtener bloques que puedan ser cortados en secciones muy finas utilizando un micrómetro. Estas secciones que contienen material fijado y desecado se colocan cuidadosamente en un portaobjetos, y se disuelve la parafina con un solvente orgánico como xilol. Una vez hecho esto, la muestra se tiñe para contrarrestar las distintas estructuras celulares y se protege con un cubreobjeto montado sobre una sustancia sellante.
Procedimientos y observaciones. Observar cada una de las preparaciones entregadas por su profesor y realice un dibujo teniendo presente las siguientes recomendaciones:
Los dibujos deben realizarse siempre a lápiz mina, evitando borrones y colores oscuros. La utilización de lápices de colores es opcional, pero el colorear su dibujo le puede ayudar a diferenciar con mayor claridad las estructuras observadas. Realice un dibujo simple o esquemático, pero lo suficientemente grande como para mostrar todos los detalles importantes. Trate de mantener una escala apropiada al tamaño de las estructuras observadas. Acompañe su dibujo de notas explicativas, escritas en forma ordenada, clara y breve. Si lo desea, anote los nombres de las estructuras identificadas en su observación. Indique siempre el aumento con que está observando su preparación. Ej: 10X o 100X.
Bibliografía:
Introducción a la biología celular 3a. ed. Alberts, Bruce, 2009 Biología celular y molecular 7a. ed. Lodish, Harvey. 2013.
