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MICROSCOPIA
CENNI DI ANATOMIA E FISIOLOGIA DELL’OCCHIO
àfondo occhio sx àfreccia a sx indica papilla ottica (che è una zona cieca) ricca di vasi retinici àfreccia a dx indica macula lutea priva di vasi con al centro la fovea centralisàzona di maggior risoluzione data la presenza maggiore di coni e bastoncelli
àpercorso luce per arrivare alla retina àdall’esterno passa attraverso la cornea àformata da uno stroma àtessuto connettivoàfasciato da un epitelio corneale (pluristratificato piatto non cheratinizzato) che appoggia sulla sua membrana basale àepitelio che ricopre lo stroma all’interno (cubico monosratificato) che poggia sulla sua membrana basale àall’interno del connettivo vediamo diversi nuclei
àdopo aver attraversato camera anteriore attraversa il cristallino àimmagine al TEM del cristallinoàcellule sono dette FIBRE del cristallino perché molto lunghe impilate molto regolarmente
àimmagine al SEM delle cellule del reticolo cristallino
Percorso luce Corneaà Camera anterioreà Cristallinoà Camera posterioreà àRETINAà
- coni e bastoncelli non sono raggiunti per primi dalla luceà RETINA INVERSA
- fotorecettori appoggiati su strato di cellule cubiche che prende il nome di epitelio pigmentato della retina
àimmagine istologica con ematossilina-eosina della fovea àgli strati di neuroni diminuiscono per permettere il passaggio della luce mentre i fotorecettori aumentano di concentrazione (in C)
àimmagine negativa al microscopio otticoàin sezione chiamata cross section attraverso i segmenti esterni dei fotorecettori àvediamo i coni che hanno un diametro più largo e numericamente inferiore rispetto ai bastoncellià infatti ci troviamo alla periferia di una retina
àPERCHE’ PER VEDERE MEGLIO CI AVVICINIAMO Viene presa in causa una parte maggiore di retina e quindi un numero maggiore di fotorecettori
àper migliorare il limite di risoluzione di un microscopio, non potendo agire incrementando sen a, una via possibile è quella di aumentare il va-ore dell’indice di rifrazione del mezzo interposto (n)àSi potràà 1)interporre pertanto fra lente frontale dell’obiettivo e oggetto un mezzo con indice di rifrazione più alto, come per esempio una goccia di olio con indice di rifrazione all’incirca uguale a quello del vetro (n pari a 1,5)àosservazione microscopica a immersione àpermette di distinguere punti distanti poco più di 0,1 μm;
2)utilizzare luce di lunghezza d’onda minore, quale la radiazione ultravioletta (k pari a 250-350 nm) con la quale si può raggiungere un potere di risoluzione di 0,1 μm, che rappresenta il limite estremo della microscopia otticoàper il rilevamento delle immagini occorre fare ricorso a pellicole fotografiche sensibili all’ultravioletto.
àIl condensatore converge i raggi luminosi sul preparato da cui fuoriescono come un cono di luce che coincide con il diametro della lente frontale dell’obiettivo. L’angolo a è detto semiangolo di illuminazione e il prodotto fra l’indice di rifrazione del mezzo interposto tra oggetto e lente (n) e sen a rappresenta l’apertura numerica di un obiettivo
CONFRONTO TRA I 3 MICROSCOPI
àstruttura simile tra microscopio ottico ed elettronico A sxà microscopio ottico composto
- Il tubo portaottica sorregge una coppia di oculari dal lato e gli obiettivi dal lato del tavolino su cui viene posto l’oggetto da osservare.
- Gli obiettivi sono montati su una torretta girevole denominata revolver che consente una loro rapida sostituzione.
- Tubo e tavolino sono montati su un braccio ricurvo e il tutto su un basamento à stativo.
- Per la messa a fuoco vengono utilizzati dispositivi meccanici di spostamentoà 1)uno per grandi spostamenti (vite macrometrica ) 2)uno per messa a fuoco fine (vite micrometrica ).
- Sotto il tavolino, che presenta un foro al centro per il passaggio della luce, è posto il dispositivo di illuminazione costituito da una sorgente di illuminazione (lampade a incandescenza o alogene) e dal condensatore di Abbe àè una lente convergente che concentra la luce, emessa dalla sorgente, su una zona limitata (ma più estesa di quella coperta dall’obiettivo) del preparato, da cui poi fuoriesce un cono luminoso il cui diametro coincide con quello della lente frontale dell’obiettivo (cioè la lente dell’obiettivo più vicina al preparato
- Tramite una cremagliera, il condensatore può essere alzato o abbassato variando la convergenza dei raggi luminosi e quindi regolando la quantità di luce che raggiunge la lente frontale.
- Su ogni obiettivo e su ogni oculare sono riportati valorià 1)(per esempio, 10×, 40× eccetera)àindicano l’ingrandimento proprio di quegli specifici dispositivi ottici
- (0,63 o 0,95)àrelativo all’apertura numerica di quell’obiettivoàa parità di ingrandimento sono da preferire gli obiettivi con maggiore apertura numerica perché danno immagini più luminose e più risolte
2)MICROSCOPIO ELETTRONICO àGran parte delle strutture subcellulari sfugge all’analisi microscopica classica (microscopia ottica) in quanto la capacità risolutiva del microscopio ottico è intimamente legata alla lunghezza d’onda della luce, nel campo del visibile (400-800 nm). àutilizzando un fascio di elettroni, ovvero una radiazione elettromagnetica di lunghezza d’onda molto ridotta, si è potuto oltrepassare quel limite di 0,2 μm otticamente invalicabileàproblemi
A dxà microscopio elettronico a scansione àimpiegato per lo studio topografico della superficie delle strutture biologiche àla superficie del campione, in precedenza fissato in glutaraldeide o tetrossido di osmio, è in genere rivestita con appositi apparecchi da un sottile strato di metalli pesanti (oro od oro-palladio) per consentirne l’osservazione. àIl campione, inserito in un’apposita camera del microscopio, viene esplorato da un fascio molto sottile di elettroni, detti primari (circa 7 nm di diametro), che deflessi da un particolare dispositivo, formano una sorta di pennello che esplora per punti successivi la superficie dell’oggetto. àGli elettroni primari vanno a eccitare la superficie del campione che emette raggi X ed elettroni secondari àvengono raccolti da un rilevatore posto vicino al campione. àLa componente essenziale del rilevatore è uno scintillatore , che emette fotoni, i quali, in sincronismo con il fascio di elettroni primario, operano la scansione sullo schermo del monitor. àIl sincronismo tra la scansione effettuata sul campione e quella sul monitor è operato dal sistema di scansione àL’immagine che si forma sullo schermo riproduce con effetto tridimensionale la superficie analizzata, rivelandone tutti i particolari con una risoluzione solitamente di 20 nm àimmagine più scura se emette meno elettroni e viceversa àconsente anche la microanalisi dei metalli contenuti nel campione: siccome con l’eccitazione del campione, da parte degli elettroni primari, si ha anche emissione di raggi X, una specifica microsonda racco-glie i raggi X emessi e ne analizza lo spettro che essendo caratteristico di ogni ele-mento, ne consente l’identificazione àsolitamente le punte sono quelle più chiare perché sono zono più esposteàelettroni colpendo punta verranno emessi in tutte le direzioni senza essere mascherati
3)MICROSCIO A FLUORESCENZA
àCon questo microscopio il preparato viene illuminato con luce ultravioletta a una determinata lunghezza d’onda e i suoi componenti vengono esaminati in base alla fluorescenza emessa. àLa sorgente luminosa è una lampada a vapori di mercurio che emette radiazioni ultraviolette (invisibili). àLa fluorescenzaà è il fenomeno per cui determinate sostanze, dette fluorescenti , colpite dalle radiazioni ultraviolette emettono luce di lunghezza d’onda maggiore (visibili). dipende dal rilascio di energia da parte di elettroni di una molecola che, eccitati dalla luce ultravioletta (invisibile), passano da un determinato orbitale a uno superioreàgli elettroni eccitati sono però instabili e tendono a ritornare al punto di partenza, restituendo l’energia che hanno assorbito sotto forma di calore e di luce. Poiché parte dell’energia assorbita viene ceduta sotto forma di calore, la luce emessa avrà un’energia minore di quella eccitante e, conseguentemente, una maggior lunghezza d’onda, per cui rientra nel campo del visibile. Se ne possono avere due tipi 1)naturale ( autofluorescenza )àprodotta da sostanze presenti nel tessutoàes. vitamina a si identificano direttamente sulle sezioni di tessuti con l’osservazione delle loro tipiche fluorescenze
- secondaria àè indotta da una colorazione ( fluorocromizzazione ) con coloranti fluorescenti detti fluorocromi più usati sono lo ioduro di propidio, che colora in rosso il DNA, àsistema epifluorescenza àpreparato viene eccitato dall’altoàvantaggi 1)non ci si deve preoccupare dello spessore del preparato 2)più sicuro perché evita che gli occhi vengano colpiti da luce ultravioletta àTale microscopio si avvaleà di una sorgente luminosa ad alta energia (lampada a vapori di mercurio, ad argon o allo xenon), di un filtro d’eccitazione (lascia passare luce a k che eccita il fluorocromo in uso), un filtro di sbarramento (lascia passare luce a k corrispondente a quella emessa dal fluorocromo) uno specchio dicroico (riflette la luce a k pari o inferiore a quella di eccitazione e trasmette la luce a k superiore a quella di eccitazione). àIl grande sviluppo e diffusione di tale microscopio si deve anche alla produzione di moltissimi fluorocromi (anche vitali), che emettono luce a diversa lunghezza d’onda, consentendo la visualizzazione e localizzazione contemporanea di tipi cellulari distinti o di organuli diversi all’interno di una cellula àpercorso della luce in questo microscopio àIl preparato viene eccitato dall’alto con luce ultravioletta (frecce viola) grazie a uno specchio dicroico. àLa luce ultravioletta viene fermata, prima di arrivare all’oculare, da un apposito filtro di sbarramento, così che all’occhio dell’osservatore arrivano solo i raggi luminosi emessi per fluorescenza (frecce gialle).
4)MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FASE
àutilizzata in microscopia cellulare quando si devono osservare colture cellulari àpermette di osservare cellule viventi nel loro stato naturale senza il bisogno di fissarle o colorarle
àin A, dove il campione è colorato, l’ampiezza e quindi il raggio di luce diminuisceàcontrasto creato quindi dal fatto che l’intensità del raggio che passa è minore rispetto a quello fuori dalla cellula àin B, dove il campione NON è colorato, l’ampiezza e quindi il raggio di luce rimane inalterato anche a seguito del passaggio della luce nel campione àcontrasto molto ridottoàquindi i due raggi sono della stessa intensità ma a seguito del passaggio nella cellula, vanno fuori fase àla microscopia sfrutta questo andamento fuori fase del raggio di dx, il quale si trova poi auto offesa in confronto alla luce incidente che non è passata attraverso la cellula, permettendo all’occhio umano di vederla
àdall’immagine vediamo una cellula in cultura viva àin A siamo in un campo chiaro àin B siamo in contrasto di faseàmolto meglio distinguibile
5)MICROSCOPIO A LUCE POLARIZZATA ànon molto usato in biologia àLa comune luce (non polarizzata) consiste in un fascio di raggi che hanno una direzione comune di propagazione, ma vibrano in differenti piani. àLa microscopia a polarizzazione utilizza, per l’illuminazione del preparato, luce polarizzata àvibra in un solo piano àintensità luce uscente dipende dall’angolo tra le due direzioni di polarizzazione in entrata e in uscita del filtroàse angolo è 90° la luce non passa, se 0 la luce attraversa il filtro àLo strumento di base è costituito da un microscopio ottico classico con due filtri polarizzatori, uno prima, (detto polarizzatore e posizionato subito sotto il condensatore) ed uno dopo l’oggetto( detto analizzatore) àun oggetto posto sul cammino di questa luce può risultareà
- isotropo à se trasmette la luce con la stessa velocità in tutte le direzioni,
presenta lo stesso indice di rifrazione in tutte le direzioni
- anisotropo se non trasmette la luce con la stessa velocità in tutte le direzioni in quanto presenta indici di rifrazione diversi secondo il piano di vibrazione del raggio di luce rispetto all’orientamento delle molecole. àA filtri incrociati (uno a 0 e laltro a 90°), il fondo dell’immagine appare nero; in queste condizioni, l’oggetto non birifrangente appare invisibile poiché non altera lo stato della radiazione polarizzata fra i due filtri; l’oggetto birifrangente, invece, apparirà luminoso o colorato sul fondo nero
àpreparati che presentano una certa cristallinità e con determinate caratteristiche permettono che la luce polarizzata dal primo filtro sposti il suo asse, oltrepassare anche il secondo filtro ed essere visto àimmagine femore di anfibio preparato per erosione àzone anisotropeàbirifrangenti data la loro regolarità
7 )sezioni al microtomo à ànel quale il materiale da sezionare viene spinto progressivamente in avanti da un congegno capace di portarlo sotto una lama affilata che taglia fettine di un determinato spessore
8 )distensione delle fette su vetrini à Fette stese su vetrino porta oggetti Per farlo correttamente si prende goccia H20, la si mette sul vetrino porta oggetti, si scalda il tuttoà acqua evapora e fetta si appoggia 9 )sparaffinatura in solventi organici à Eliminazione paraffina tramite solventi organici 10 )idratazione delle fette tramite la serie discendente degli alcool 11 )colorazione à quando il colorante, in soluzione, si lega stabilmente ad alcune strutture cellulari che rimangono colorate anche dopo ripetuti lavaggi delle sezioni nel solvente in cui era sciolto il colorante. colorazioni dirette àquando le sezioni prendono il colorante direttamente dalla soluzione vs colorazioni indirette àquando il preparato viene sottoposto all’azione preliminare di sostanze preparatorie alla colorazione colorazioni semplici àquando si usa un solo colorante vs colorazioni combinate àquando si usano due o più coloranti simultaneamente o in successione (bi o tricromica) coloranti naturali àestratti da animali o da piante vs coloranti artificiali 12 )disidratazione tramite serie ascendente degli alcool à dato che colorazione avvenuta con coloranti affini all’H20 è necessaria un’ulteriore disidratazione tramite alcol 13 )montaggio in balsamo (resine sintetiche) à posta goccia di montante e vetrino portaoggetto fatto aderire con l’altro vetrino portaogetto
IN MICROSCOPIA ELETTRONICA Poiché i raggi elettronici si propagano solo nel vuoto e poiché sono forniti di scarso potere di penetrazione, si rende necessario che il materiale da esaminare sia fissato, disidratato e ridotto in fettine estremamente sottili, cioè dell’ordine di 50-80 nm di spessore 1)prelievo organo/tessuto 2)fissazione à con un miscuglio tra folmaldeide (molecola molto piccola) e gluteraldeide (più grande)à quest’ultima permette di creare dei ponti realizzando una fissazione molto efficacie fissativo di Karnvsky 3)preparato lavato 4)rifissato con un altro fissativo tetrossido d’osmioà 1)molto ossidante
2)Osmio atomo molto pesate che risulta quindi opaco agli elettroniàfunziona quindi come colorante 5)lavaggio con tampone 6)disidratazione 7)inclusione in resa usata resina perché permette di ottenere fette molto più sottile necessarie in questo tipo di microscopia utilizzate queste vaschette per portacampioni
8)taglio
usato ultramicrotomoàpiù sofisticato del microtomo usate lame di vetro o di diamanteàpermette sottigliezza sezioni (sotto i 100nm)
9)distensione fette sui vetrini di rame 10)contrastato i preparati non vengono colorati ma contrastati con i coloranti elettronici che sono Sali di atomi pesanti come acetato di uraline una tecnica molto impiegata in microscopia elettronica per lo studio dei virus e delle macromolecole è la colorazione negativa in cui la struttura in esame viene im-pregnata con una soluzione di sali di metalli pesanti che penetrano negli spazi vuoti fra le macromolecoleàquesti spazi appariranno colorati (neri) e le macromolecole appariranno incolori (bianche) come in un negativo fotografico
