Cellule Staminali: Un'Introduzione alla Biologia e alle Applicazioni - Prof. Follenzi | Appunti di Istologia

CELLULE STAMINALI

Una cellula per essere staminale deve avere capacità di:

• auto-mantenimento, cioè dividersi e rinnovarsi per lungo tempo, grazie alla mitosi asimmetrica;

• differenziamento in molteplici tipi di cellule.

Il corpo umano è costituito da circa 220 tipi differenti di

cellule, tutte derivanti dalla cellula staminale totipotente che

è lo zigote.

La specializzazione cellulare porta alla perdita della capacità di

auto-mantenimento; quando una cellula perde la capacità di

rigenerare, differenzia e si specializza e, alla sua morte, deve

essere rimpiazzata dalla divisione di una cellula staminale, la

quale non è specializzata. Tutte le cellule, anche se

specializzate, contengono le informazioni per svolgere

qualsiasi funzione, perché il genoma è uguale per tutte; ciò

che cambia è l’espressione genica.

Un progenitore può dare origine a due cellule specializzate,

non può produrre una cellulare staminale; invece, una cellula

staminale dà origine a una staminale e a una specializzata.

- 1963, scoperta della presenza di una cellula capace di auto-mantenimento nel midollo osseo

del topo da parte di Till e McCulloch;

- 1974 scoperta di cellule staminali nel cordone ombelicale;

- 1981, isolamento di cellule staminali embrionali nel topo;

- 1992, coltivazione in vitro di cellule staminali neuronali (neurosfere);

- 1997, la leucemia origina da cellule staminali ematopoietiche malate (cellule staminali tumorali);

- 1998, isolamento di cellule staminali embrionali umane;

- 2006, scoperta nel topo di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ottenute tramite

riprogrammazione genetica di cellule differenziate adulte;

- 2007, ottenimento delle iPSCs, non solo dal topo ma anche da fibroblasti umani.

Nel 1978, in Inghilterra, c’è stata la nascita della prima bambina in provetta; è cominciata la

fecondazione in vitro e, degli gli oociti fecondati, una parte veniva iniettata nelle tube delle donne e

una parte congelata. L’energia elettrica consumata per mantenere i freezer era piuttosto alta, per

cui si è deciso di donarli alla ricerca, per cui è iniziata la ricerca sulle staminali.

Esistono:

- cellule staminali embrionali;

- cellule staminali adulte (ematopoietiche e neuronali);

- cellule staminali pluripotenti indotte che derivano da cellule mature che vengono

riprogrammate attraverso fattori di trascrizione.

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CELLULE STAMINALI

Una cellula per essere staminale deve avere capacità di:

auto-mantenimento, cioè dividersi e rinnovarsi per lungo tempo, grazie alla mitosi asimmetrica;
differenziamento in molteplici tipi di cellule. Il corpo umano è costituito da circa 220 tipi differenti di cellule, tutte derivanti dalla cellula staminale totipotente che è lo zigote. La specializzazione cellulare porta alla perdita della capacità di auto-mantenimento; quando una cellula perde la capacità di rigenerare, differenzia e si specializza e, alla sua morte, deve essere rimpiazzata dalla divisione di una cellula staminale, la quale non è specializzata. Tutte le cellule, anche se specializzate, contengono le informazioni per svolgere qualsiasi funzione, perché il genoma è uguale per tutte; ciò che cambia è l’espressione genica. Un progenitore può dare origine a due cellule specializzate, non può produrre una cellulare staminale; invece, una cellula staminale dà origine a una staminale e a una specializzata.
1963, scoperta della presenza di una cellula capace di auto-mantenimento nel midollo osseo del topo da parte di Till e McCulloch;
1974 scoperta di cellule staminali nel cordone ombelicale;
1981 , isolamento di cellule staminali embrionali nel topo;
1992 , coltivazione in vitro di cellule staminali neuronali (neurosfere);
1997 , la leucemia origina da cellule staminali ematopoietiche malate (cellule staminali tumorali);
1998 , isolamento di cellule staminali embrionali umane;
2006 , scoperta nel topo di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ottenute tramite riprogrammazione genetica di cellule differenziate adulte;
2007 , ottenimento delle iPSCs, non solo dal topo ma anche da fibroblasti umani. Nel 1978, in Inghilterra, c’è stata la nascita della prima bambina in provetta; è cominciata la fecondazione in vitro e, degli gli oociti fecondati, una parte veniva iniettata nelle tube delle donne e una parte congelata. L’energia elettrica consumata per mantenere i freezer era piuttosto alta, per cui si è deciso di donarli alla ricerca, per cui è iniziata la ricerca sulle staminali. Esistono:
- cellule staminali embrionali;
- cellule staminali adulte (ematopoietiche e neuronali);
- cellule staminali pluripotenti indotte che derivano da cellule mature che vengono riprogrammate attraverso fattori di trascrizione.

La classificazione avviene in base alla loro capacità di differenziamento:

totipotenti, possono dare origine a tutte le cellule, tra cui lo zigote e la morula a 8 cellule (1- 3 giorni);
pluripotenti, localizzate nella massa cellulare interna della blastocisti (5-14 giorni), non sono in grado di generare un organismo completo;
multipotenti, presenti nel cordone ombelicale o in altri tessuti dell’adulto, come le staminali ematopoietiche, che possono dare origine solo a un numero limitato di cellule;
unipotenti, sono precursori che contribuiscono alla maturazione di un solo tipo cellulare, ma hanno la capacità di auto-mantenimento, come le cellule staminali epiteliali.

CELLULE STAMINALI EMBRIONALI:

Le cellule staminali embrionali derivano dall’embrione, sono presenti nei primi giorni di sviluppo embrionale (meno di due settimane). Sono le più versatili perché possono differenziare in tutti i tipi cellulari, comprese cellule fetali e adulte. Si prelevano dalla blastocisti che contiene circa 50- 10 cellule che vengono poi messe in coltura ed è formata da uno strato esterno di cellule, da una cavità riempita di fluido e da un gruppo di cellule chiamate massa cellulare interna. La morula è uno stadio a 8 cellule totipotente; a volte, nei protocolli in cui bisogna analizzare il cariotipo è possibile prelevare una delle cellule per verificare che il cariotipo sia normale e reimpiantare. Le altre 7 sono totipotenti, quindi, possono generare un intero organismo, cosa non possibile alla morula di 16 cellule, a seguito di compattazione, perché si sono formate due layer di cellule diverse, uno interno che forma la massa cellulare interna da cui origina l’embrione e uno periferico a ridosso della zona pellucida (strato acellulare che contiene l’embrione) che formerà il trofoblasto, ossia gli annessi embrionali. Le cellule si recuperano tra il quarto e il sesto giorno, prima che l’embrione si impianti al momento della perdita della zona pellucida. I corpi embrioidi vengono prelevati, messi su piastre di coltura, viene digerita la parte esterna (trofoblasto) e vengono recuperate le cellule staminali embrionali che vengono messe su piastre di coltura in cui ci sono cellule feeder irradiate che producono le sostanze nutrienti per aiutarne la crescita. Quando isolate, possono continuare a crescere e poi è possibile farle differenziare, grazie a fattori di crescita presenti in coltura, in tutti i tipi cellulari. La condizione è un terreno particolare che contiene fattori di crescita che stimolano pathways che portano all’attivazione di geni cruciali per il differenziamento.

I ricercatori sono riusciti a rigenerare l’intera epidermide di bambini, prendendo le cellule staminali dell’epidermide del paziente, hanno fatto una modificazione genetica (terapia genica) e poi hanno reimpiantato le cellule nell’organismo. I cheratinociti, ossia le cellule staminali, hanno necessità di feeder layer, ossia fibroblasti irradiati che devono fornire sostanze. Sono state geneticamente modificate e, infine, coltivate per formare dei foglietti di epidermide da trapiantare. Terapie in studio:

diabete, creare, dalle staminali embrionali, le cellule pancreatiche;
insufficienza renale, cellule renali differenziate da cellule embrionali;
danni cardiaci;
malattie neurodegenerative, come il Parkinson;
ischemia cerebrale, cellule neuronali staminali ottenute dal cervello adulto. Le cellule staminali ematopoietiche si trovano a livello del cordone ombelicale (1-5%), del midollo osseo (1-2%) e del sangue periferico (0.01%-0.05%). Si effettua una mobilizzazione delle cellule staminali dal midollo, grazie a una citochina M-CSF, e poi viene fatta un’aferesi, ossia un prelievo. Le cellule staminali sono rare, c’è una cellula staminale ogni 10-100 mila, inoltre, sono in G quiescenti, non sono mai in attiva proliferazione, soltanto 1 - 2 volte l’anno in base alle necessità e agli stress ematopoietici. Cenni storici:
le prime evidenze dell’esistenza di cellule staminali ematopoietiche avvennero alla fine della Seconda guerra mondiale, dopo l’esplosione della bomba atomica;
1949 - 1951: topi letalmente irradiati furono salvati iniettando cellule della milza o di midollo osseo
Anni ‘60: circa 200 trapianti allogenici di midollo nell’uomo ma con scarso successo. Primo trapianto con successo avvenuto tra gemelli monozigoti;
1963: identificazione della cellula staminale ematopoietica nel topo;
1 968: primo trapianto allogenico riuscito in un bambino con immunodeficienza legata al cromosoma X;
1988: identificazione della molecola CD34 come marcatore di CSE nell’uomo;
1988: trapianto riuscito in un bambino con malattia di Fanconi trattato con cellule ottenute dal cordone ombelicale del fratello;
2020: sono usciti i primi trial clinici in cui sono stati curati dei pazienti con anemia di Fanconi, utilizzando cellule autologhe corrette geneticamente.

Le cellule staminali ematopoietiche si dividono per mitosi asimmetrica per permettere l’autorinnovamento e la formazione di progenitori che daranno origine solo a cellule mature. Nel midollo vengono prodotte circa 5 milioni di cellule al secondo; con la divisione simmetrica, c’è il problema di esaurire le cellule staminali. La caratteristica della vera cellula staminale è la quiescenza, garantita dalla presenza di una nicchia ematopoietica e possono entrare in funzione solo in base allo stress dell’organismo. Il modello di ematopoiesi monofiletica è valido per il feto: esiste il progenitore comune linfoide e mieloide; quest’ultimo, a sua volta, si divide in progenitore della linea mieloide e il progenitore che dà origine alla linea eritroide e megacariocitaria. Ora si ritiene che dalla cellula staminale originino progenitori committed unipotenti.

Nelle persone adulte viene prelevato il sangue midollare a livello della cresta iliaca posteriore per una biopsia. Piuttosto che i trapianti, oggigiorno si effettuano mobilizzazioni del midollo attraverso la somministrazione della citochina G-CSF o M-GSF, agonista di CXCR4 (molecole di adesione a livello della nicchia). Successivamente si effettua il prelievo mediante aferesi e si recuperano le cellule dal trapiantare nel ricevente. Le cellule staminali hanno la necessità di rimanere adese alla nicchia osteoblastica e alla nicchia vascolare; CXCL12 o SDF1 è il ligando di CXCR4, la loro espressione stabilisce la capacità della cellula di rimane nel midollo o muoversi. Le cellule staminali embrionali hanno una capacità di proliferare illimitata e possono generare un ampio spettro di cellule; purtroppo, possono generare teratomi, essere rigettate e ci sono diversi problemi etici. Le cellule staminali adulte non presentano rigetto, non ci sono problemi etici; purtroppo, sono rare, non esistono tanti marcatori per poterle identificare, isolare e purificare, il numero, spesso, è insufficiente per il trapianto e non è possibile fare un’amplificazione in coltura.

CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE:

Nel 2006, da Yamanaka, sono state scoperte le cellule staminali pluripotenti indotte nel topo, mentre, nel 2007, anche nell’uomo. Nel 2012 ha vinto il premio Nobel. Gurdon ha fatto scoperte alla fine degli anni 50-60, studiando le rane; egli ha identificato i fattori di trascrizione necessari per poter ottenere nuove rane, dunque, per amplificare le cellule staminali. Ian Wilmut è riuscito a ottenere la pecora Dolly per nuclear transfer, Yamanaka si è rifatto ai suoi studi. Da uno screening dei fattori di trascrizione (geni) che potevano essere fondamentali per far ritornare una cellula matura in cellula staminale embrionale, ne ha identificati, da 24, a 4: Oct3/4, Sox2, Klf (un oncogene ma non così grave), c-Myc (è un oncogeno, se overespresso causa tumori). I primi 3 attivano regolatori di pluripotenza e reprimono programmi tipici delle cellule somatiche; l’ultimo, attiva processi metabolici e proliferativi. Viene forzata l’espressione di questi fattori di trascrizione, riportando indietro la cellula.

Ci sono diversi metodi di riprogrammazione:

trasduzione virale, vettori retrovirali, più efficiente perché può rimanere per più tempo;
plasmidi a dna;
trasfezione di rna, questo viene iniettato nelle cellule, tradotto; l’rna deve produrre i 4 fattori di trascrizione che vengono espressi temporaneamente e influiscono sulla cromatina con conseguente riprogrammazione;
proteine ricombinanti. Limitazioni:
le iPSC possono andare incontro a errori di metilazione del DNA, vengono aggiunti gruppi metilici in corrispondenza del promotore, per cui, il gene non viene espresso; si tratta di modificazioni epigenetiche;
c-Myc è un oncogene, per cui il 20% dei topi chimerici ha sviluppato tumori;
Yamanaka è riuscito a generare iPSCs anche senza c-Myc, anche se il processo richiede più tempo ed è meno efficiente. Valutazioni delle Ipsc:
identità morfologica:
capacità di self-renewal;
valutazione morfologica al microscopio;
identità molecolare:
espressione di proteine chiave per la pluripotenza (Oct4 e Nanog) o marcatori di superficie (SSEA4);
espressione della telomerasi, enzima che allunga i telomeri;
demetilazione dei promotori di geni specifici per la pluripotenza e riattivazione del cromosoma X per le femmine;
identità funzionale:
formazione di teratomi. Applicazioni:
studio di modelli di malattia in vitro;
screening per nuovi farmaci;
generazione delle iPSC derivate dal paziente;
studio dello sviluppo e delle funzioni di tessuti umani;
medicina rigenerativa: risorsa di cellule autologhe (non sono rigettate).

Sono state prelevate le CD presenti nel sangue periferico, riprogrammate, corrette mediante un vettore lentivirale con la forma sana del gene per il fattore VIII e poi differenziate in cellule endoteliali (producono il fattore VIII, non gli epatociti), trapiantate nel fegato dei topolini, esse hanno attecchito, hanno proliferato e hanno corretto il fenotipo emorragico. Per trapiantare nuove cellule è necessario toglierne alcune non corrette, ma ciò non è una tecnica efficiente, perché c’è rischio di sanguinamento. Le cellule corrette vengono trapiantate, non nel fegato, bensì, in una tasca che funziona da scaffold e ospita le cellule, le quali attecchiscono e producono il fattore VIII.

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