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MODULO 4/5: CONTAMINAZIONE MICROBIOLOGICA e MTA
I CONTAMINANTI MICROBIOLOGICI coprono circa il 93% di tutte le contaminazioni. I microrganismi maggiormente presenti sugli alimenti sono batteri, funghi (lieviti o muffe), virus. EPIDEMIOLOGIA L’ INCIDENZA DELLE MALATTIE TRASMESSE DAGLI ALIMENTI (MTA) è in costante ascesa anche nei paesi industrializzati (EFSA, 2015). Negli USA circa 48 milioni di persone si ammalano ogni anno, 128.000 sono ospedalizzati e 3.000 muoiono a causa di malattie di origine alimentare. In Europa (nel 2013) si sono riscontrati 5.196 focolai di tossinfezioni alimentari, 43. casi di malattia nell’uomo, 5.946 ricoveri e 11 decessi (EFSA 2015). In Italia (2009) si sono riscontrati 248 casi di focolai di tossinfezione segnalati con un totale di 1.451 casi di malattia. Questo scenario epidemiologico delle MTA può essere attribuito a diversi fattori: 1) CAMBIAMENTO DELLE ABITUDINI ALIMENTARI Sempre più pasti vengono consumati fuori casa (ristorazione collettiva). L’abitudine a comprare alimenti a lunga conservazione o alimenti pronti all’uso, che richiedono particolari cautele (consumo immediato o immediata refrigerazione). L’aumento della disponibilità sul mercato di prodotti vegetali freschi confezionati (i “prodotti di IV gamma”) che di fatto subiscono pochi trattamenti prima di essere confezionati e spesso sono consumati crudi quindi se contaminati rappresentano un serio rischio per la salute del consumatore (alimenti del freddo come imbustati da frigo con prodotti vegetali). La catena del freddo, indispensabile per la loro corretta conservazione, rappresenta anche un potenziale rischio per la loro sicurezza in quanto favorisce lo sviluppo di batteri psicrotrofi (nei prodotti refrigerati è possibile la crescita microbica di psicrotrofi). 2) Il diffondersi nella popolazione di REGIMI DIETETICI PARTICOLARI (crudisti, consumo di alimenti crudi). 3) La GLOBALIZAZIONE DEI MERCATI porta sulla nostra tavola cibi prodotti in aeree geografiche molto lontane, il che rende difficile il controllo sia della loro origine sia della loro qualità igienico- sanitaria (emergenze di nuove minacce). 5) La comparsa dei cosiddetti PATOGENI EMERGENTI , ne sono un esempio l’encefalite spongiforme bovina nei paesi europei (mucca pazza), influenza aviaria (Cina), influenza suina (America centrale), alle infezioni da E. coli verocitotossici (VTEC), all’emergenza di nuovi sierotipi di Salmonelle (microrganismi prima sconosciuti sono modificazioni degli organismi conosciuti precedentemente). 6) Comparsa di NUOVI VEICOLI (alimenti come veicoli), prima sconosciuti, ad esempio il sidro di mele (E. coli O157:H7), i lamponi (Cyclospora, norovirus), germogli di erba medica alfa-alfa (Salmonella, E. coli O157:H7). 7) Anche il CAMBIAMENTO CLIMATICO ha un impatto sulla dispersione e sulla persistenza di molti batteri patogeni nell’ambiente, con un conseguente aumento del rischio di contaminazione di acqua e alimenti. DOVE SI VERIFICANO LE INFEZIONI ALIMENTARI? Secondo i più recenti dati di sorveglianza epidemiologica, negli Stati Uniti il 68% dei casi di tossinfezioni alimentari riportati è stato associato a cibo preparato nei ristoranti, al bar, in albergo o in altri punti di ristorazione collettiva, ma anche in casa. Tra gli altri luoghi in cui è stata contratta un’infezione si annoverano scuole, mense e ospedali o altre strutture sanitarie. In Europa nel 2013 il 38,5% delle tossinfezioni si sono verificate in ambiente domestico (errata conservazione e/o preparazione degli alimenti in casa), il 22% nei ristoranti e l’8,3% nelle mense scolastiche (EFSA 2015) (vedi slide pagina 8). LE MTA SONO UN TEMA CENTRALE PER LA SALUTE PUBBLICA A LIVELLO MONDIALE STRATEGIE DI CONTROLLO: appropriati programmi di prevenzione (HACCP); formazione del personale addetto; educazione e informazione dei consumatori (attenzione alla catena del freddo o alla cottura); una legislazione adeguata e sistemi di controllo armonizzati a livello internazionale.
OMS nel 2008 pubblica le “Foodborne disease outbreaks: guidelines for investigation and control” destinate ai professionisti della salute pubblica, agli ispettori degli alimenti e della salute, ai funzionari medici nazionali e distrettuali, al personale di laboratorio e a tutti coloro che possono partecipare alla sorveglianza e al controllo dei focolai delle malattie legate al cibo, con lo scopo di armonizzare in ambito internazionale le procedure di sorveglianza e di controllo delle epidemie legate agli alimenti, esso si concentra sugli aspetti pratici delle indagini epidemiologiche delle epidemie, indagini ambientali e di laboratorio da effettuare. Scolasticamente si è soliti distinguere le MTA in:
- INFEZIONI ALIMENTARI provocate dall’ingestione di alimenti o bevande contenenti microrganismi patogeni vivi e la loro successiva moltiplicazione nella mucosa intestinale o in altri tessuti (ad es. Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp).
- INTOSSICAZIONI ALIMENTARI dovute all’ingestione di sostanze tossiche prodotte dai microrganismi o naturalmente presenti nell’alimento e ingerite con l’alimento stesso, senza che vi sia necessariamente la presenza anche dell’agente patogeno (ad es. la tossina di Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Bacillus cereus).
- TOSSINFEZIONI ALIMENTARI causate dalla produzione di tossine (dopo colonizzazione) nel tratto intestinale da parte di microrganismi veicolati da alimenti (es. Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Vibrio cholerae). Dal documento “Foodborne deseae outbreaks: guidelines for investigation and control” (OMS 2008). Più che di infezioni alimentari, intossicazioni, tossinfezioni oggi si preferisce parlare di “malattie di origine alimentare” (FOODBORNE DISEASES), intendendo in questo modo qualsiasi malattia, di natura infettiva o tossica, che si suppone sia stata causata dall’ingestione di cibo o acqua, oppure trasmetta tramite gli alimenti. CARATTERISTICHE DELLE MTA la sintomatologia predominante è a carico dell’apparato digerente, con un periodo di incubazione normalmente breve. I sintomi specifici quali malessere generalizzato, nausea, dolori addominali, vomito, diarrea, hanno un decorso solitamente benigno, ma nella popolazione ad alto rischio (malati, persone anziane, bambini), possono avere esito più grave e talvolta letale. In alcuni casi, in seguito alla malattia alimentare, sopravvengono complicazioni come la sindrome di Guillain-Barrè, la sindrome uremico-emolitica o artriti reattive. Possono diventare gravi per individui più sensibili come i malati, i bambini e gli anziani e, in alcuni casi potrebbero causare la morte in questi soggetti a rischio (vedi slide pagina 14, 15). SERBATOIO DI INFEZIONE uomo, animale, pianta o substrato inanimato (acqua, suolo) in cui il patogeno vive e si moltiplica, rappresenta il suo habitat naturale dal quale può trasmettersi agli ospiti recettivi. Serbatoio:
- UOMO: S.typhi, virus epatici, meningococchi.
- ANIMALI: dai quali riescono a trasferirsi all’uomo come diversi sierotipi di Salmonella nel pollame, Brucella nei bovini.
- AMBIENTE: dall’acqua la Legionella pneumophila e dal suolo il Clostridium tetani. SORGENTE DI INFEZIONE è il soggetto (uomo o animale) che elimina all’esterno il patogeno consentendo la circolazione dello stesso e la possibile trasmissione all’ospite recettivo. La principale sorgente di infezione è, in genere, rappresentata dall’UOMO INFETTO che può essere malato, ma vanno considerati anche i portatori. Questi possono essere precoci, cioè infetti durante il periodo di incubazione, ad esempio AIDS, oppure sani e che quindi non si ammaleranno mai di quella malattia e quindi sono i più difficili da identificare, o ancora convalescenti dove l’eliminazione avviene per un tempo limitato dopo la guarigione (da una a due settimane). Inoltre, possono essere cronici per i quali l’eliminazione avviene per tutta la vita dopo la guarigione (o comunque per molti anni). Anche gli animali possono essere sorgenti di infezione ( zoonoosi ) (vedi slide pagina 18).
- ACQUA è una grande riserva di m.o. per i quali a volte rappresenta il vero e proprio habitat. Casi di contaminazione alimentare da patogeni derivanti dall’acqua sono molto frequenti poiché l’acqua è utilizzata per abbeverare gli animali, per irrigare, per lavare gli alimenti, in acquacoltura e nell’industria alimentare conserviera. Il CONTROLLO frequente della qualità dell’acqua è fondamentale per ridurre i rischi di contaminazione da questa fonte (parametri di potabilità per le acque destinate al consumo umano, compresa quella utilizzata per la produzione).
- UOMO Le persone coinvolte in questo tipo di contaminazione sono quelle deputate alla manipolazione degli alimenti nelle industrie alimentari e nelle aziende agrarie, nei ristoranti, nei servizi di catering, nei negozi di vendita e nelle cucine domestiche. L’uomo può diffondere m.o. attraverso la desquamazione cutanea (micrococchi, stafilococchi, acari). Dall’apparato respiratorio mediante la saliva, gli starnuti, gli sbadigli vengono dispersi m.o. delle cavità nasali, faringee, laringee (micrococchi e streptococchi). E ovviamente dall’intestino attraverso le feci (enterobatteri, lattobacilli, bifido batteri, clostridi, bacteroidi, streptococchi). Il CONTROLLO per questo tipo di contaminazione prevede che può essere ridotta con corsi di formazione del personale di tipo sia igienico che sanitario. L’abbigliamento può rappresentare un veicolo di m.o., per questo si usano camici/grembiuli di materiale resistente facilmente lavabile o monouso. Il copricapo va sempre indossato in modo da contenere tutta la capigliatura così da impedire sia ai capelli che alle squame cutanee di finire negli alimenti. Le mani sono spesso responsabili di contaminazioni alimentari. Il microbiota delle mani riflette l’ambiente e le abitudini dell’individuo potendo derivare, dal suolo, dalla polvere, dalle acque e da parti del suo corpo. Alcune lavorazioni (alimenti freschi e minimamente trattati (verdure di IV gamma) prevedono l’impiego di guanti in lattice monouso che devono essere sostituiti frequentemente quando si danneggiano o si sporcano, quando si toccano i rifiuti e quando si cambia tipo di alimento o di lavorazione. Le norme igieniche riguardano sia la persona che la manipolazione degli alimenti. Particolare attenzione viene posta alla modalità e frequenza del lavaggio delle mani. Ci si deve lavare le mani: dopo aver usato i servizi igienici; dopo aver toccato naso, orecchie, capelli o altre parti del corpo; dopo aver toccato i rifiuti; prima di iniziare la manipolazione degli alimenti; dopo ogni cambio di alimento e lavorazione. Come lavare le mani: bagnare mani, polsi e avambracci, applicare il sapone liquido, strofinare dita e unghie, risciacquare, disinfettare (se necessario), risciacquare, asciugare con salvietta monouso o getto d’aria. Le unghie devono essere tenute corte e senza smalti colorati che ne impediscano di vedere la pulizia. Inoltre il personale durante il lavoro: non deve portare anelli, orecchini, bracciali, orologi e bigiotteria in genere che potrebbero trattenere residui di sporcizia o cadere negli alimenti (pericolo di contaminazione biologica e fisica); non deve masticare gomma e non mangiare per evitare che goccioline di saliva o corpi estranei cadano negli alimenti (pericolo di contaminazione biologica e fisica); non deve fumare e non pettinarsi (pericolo di contaminazione biologica e fisica); deve coprire adeguatamente tagli, abrasioni e foruncoli (pericolo biologico); deve evitare di portarsi le mani al naso, alla bocca alle orecchie (pericolo biologico). Dal punto di vista sanitario il personale deve conoscere quali sono le malattie che possono essere trasmesse dall’uomo ai consumatori attraverso gli alimenti. Ci sono malattie che prevedono l’allontanamento della persona infetta dalla manipolazione di cibi ed il personale deve essere in grado di riconoscerne i sintomi. Il personale deve inoltre sottoporsi periodicamente a esami clinici per accertare lo stato di salute e la condizione di portatore sano di Salmonella spp. e Staphylococcus aureus (vedi slide pagina 33). - MACCHINARI e UTENSILI i macchinari utilizzati per la raccolta, il trasporto, la lavorazione e la conservazione degli alimenti oltre che gli strumenti usati durante la macellazione si possono contaminare con m.o. provenienti dall’alimento stesso contaminato, dall’acqua, dall’aria e dal personale. Se ci sono particolari condizioni ambientali i m.o. possono moltiplicarsi nei macchinari e
raggiungere elevati livelli così da rappresentare un effettivo rischio per l’alimento. Parti difficilmente raggiungibili durante le operazioni di pulizia e disinfezione potrebbero rappresentare dei veri e propri serbatoi. In una macelleria ad esempio, il piano dove si taglia la carne, i coltelli ed il tritacarne devono essere frequentemente puliti e sanificati per evitare la contaminazione della carne che vi si lavora. Il CONTROLLO prevede che per ridurre questo tipo di contaminazione macchinari e utensili vanno puliti e igienizzati periodicamente e attentamente (corsi di formazioni per il personale addetto).
- ULTERIORI FONTI DI CONTAMINAZIONE Particolare attenzione va posta anche a quei m.o. che potrebbero derivare dalle sostanze che vengono aggiunte all’alimento, infatti le spezie possono contenere batteri sporigeni e muffe, la frutta disidratata può contenere patogeni, nella farina, negli amidi e zuccheri si possono trovare spore di batteri termofili. Le operazioni di confezionamento possono rappresentare un rischio. BIOFILM si tratta di una matrice biologicamente attiva, formata da cellule microbiche e da sostanze extracellulari adese ad una superficie solida. Possono trovarsi in qualsiasi tipo di superficie in ambienti umidi e non sterili. La formazione del biofilm è un processo dinamico che si verifica a tappe:
- ADESIONE (fase reversibile): favorita dalla presenza di adesine sulla superficie dei batteri, ma anche di pili, fimbrie, glicocalice, strato mucoso, capsula.
- FISSAZIONE (fase irreversibile): avviene grazie alla liberazione di polisaccaridi extracellulari prodotti dai microorganismi (glicocalice).
- COLONNIZZAZIONE (fase irreversibile): confluenza delle micro-colonie e maturazione del biofilm. Il biofilm può essere plurispecie o monospecie. Quelli plurispecie sembrano essere più resistenti perché i prodotti di diversi microrganismi conferiscono maggiore stabilità. Capacità di colonnizzare le superfici è stata trovata in Campylobacter jejuni ed Escherichia coli (O157:H7), Pseudomonas e Staphylococcus soprattutto in ambienti di lavorazione della carne, Listeria monocytogenes e Yersinia enterocolitica (vedi slide pagina 36). PERICOLI ASSOCIATI AI BIOFILM Elevata resistenza agli agenti antimicrobici; danneggiano impianti; arrecano danni alla salute umana quando costituiti da m.o. patogeni che possono abbandonare il biofilm e finire nell’alimento. RIMOZIONE DEL BIOFILM CONTROLLO: evitare la formazione del biofilm privilegiando superfici lisce, regolari senza fessure e zone morte mal raggiungibili, quindi facilmente pulibili, evitare l’accumulo di residui alimentari e m.o. attraverso un corretto piano di pulizia e sanificazione. Potrebbe essere di aiuto l’uso di spazzole e getti ad alta pressione di soluzioni per la pulizia delle superfici. Si possono usare anche mezzi chimici (disinfettanti) che provocano l’uccisione dei m.o. ma poi deve comunque seguire la rimozione meccanica del biofilm perché biofilm sterili possono comunque rappresentare un substrato per una nuova crescita microbica. In alternativa ai disinfettanti chimici ossidanti si possono usare degli oli alimentari (oliva, mais, cocco, soia) che agiscono come agenti deassorbenti (rimuovono i biofilm). Oggi si stanno studiando anche metodi biologici basati sull’uso di batteriocine che inibiscono l’adesione batterica (nisina) (sistemi di controllo sulla formazione dei biofilm). Per facilitare la rimozione dei biofilm si sta studiando anche l’impiego di enzimi attivi sugli esopolisaccaridi (proteasi, alfa-amilasi, beta- gluconasi). Alcuni studi si stanno concentrando su modificazioni chimiche delle superfici che impediscano l’adesione batterica. Al di là delle operazioni necessarie per la rimozione dei biofilm, le procedure di pulizia e sanificazione sono fondamentali per garantire un ambiente di lavoro igienicamente sicuro. Sanificazione pulizia (eliminazione dello sporco visibile rappresentato dai residui alimentari che consentono la moltiplicazione microbica) + disinfezione. PROTOCOLLO: DETERSIONE, DISINFEZIONE, RISCIACQUO.
1) ESSICCAZIONE (frutta, spezie, funghi, cereali, pasta) si ottiene industrialmente mediante una corrente di aria calda in appositi essiccatoi (essiccazione non totale). In un processo di essiccazione i controlli vanno concentrati su (punti critici di controllo):
- Temperatura di essiccazione (se non adeguata non si ottiene il risultato sperato);
- Velocità di sottrazione dell’acqua (se troppo veloce si può formare uno strato secco in superficie che impedisce successive evaporazioni);
- Dimensione del prodotto in modo da ottenere alla fine un valore di Aw omogeneo in tutte le parti dell’alimento;
- Qualità microbiologica dell’aria immessa nell’essiccatoio in modo da evitare contaminazioni;
- Umidità dei locali di stoccaggio poiché i prodotti essiccati sono molto igroscopici e quindi vanno mantenuti in ambienti asciutti per evitare riassorbimento di acqua. I prodotti essiccati offrono al consumatore una notevole sicurezza dal punto di vista microbiologico ma non dal punto di vista nutrizionale perché subiscono un DEPAUPERAMENTO della frazione vitaminica (la vitamina C risente particolarmente di questo trattamento) e proteica. 2) LIOFILIZZAZIONE (caffè, cacao, latte, alimenti per neonati) a differenza dell’essiccamento nel quale il prodotto mantiene circa il 10-15% di acqua questo è un metodo di essiccamento praticamente completo. Il prodotto è prima congelato in modo da bloccare qualsiasi processo di alterazione ed il successivo essiccamento sotto vuoto permette di ottenere un prodotto praticamente anidro pronto a ridisciogliersi velocemente nel mezzo acquoso. Gli alimenti preparati con questa tecnica hanno minimo ingombro, tempi di conservazione lunghi, sono facili da ricostituire (basta aggiungere acqua), non subiscono alterazioni a livello della composizione chimica (dal punto di vista nutrizionale non subisce perdite). 3) AFFUMICATURA (certi tipi di carne e pesce ed alcuni formaggi): se abbinata alla salagione l'effetto risulta potenziato. Va comunque sottolineato che l'esposizione ai fumi della combustione di legni aromatici è una pratica pericolosa per la salute umana poiché nel fumo sono presenti sostanze con azione battericida come la formaldeide che però ha anche azione mutagena (la sua azione battericida è inoltre limitata alla superficie dell’alimento). Nel fumo si trovano inoltre gli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA, es. benzo(a)pirene) con proprietà cancerogene. Oggi si preferisce limitare l’uso di questa tecnica. A livello industriale si stanno cercando alternative (tra cui aromatizzanti di affumicatura o il fumo liquido: condensato acquoso dei fumi e successiva filtrazione per eliminare le sostanze pericolose. 4) SALAGIONE (baccalà, aringhe, prosciutto, aggiunta di soluti): aumentando la concentrazione di soluto diminuisce la disponibilità dell’acqua e quindi la probabilità di crescita dei microrganismi. La maggior parte dei batteri non tollera concentrazioni di NaCl tra il 5 e il 10% (questo valore blocca la germinazione delle spore del Clostridium botulinum). Fanno eccezione lo Staphylococcus spp. (15%), gli alofili Halobacterium spp. ed Halococcus spp. (15-25%). Lo zucchero aggiunto nelle marmellate ne allunga di molto la conservazione. ► pH L’acidificazione di un alimento in anaerobiosi è importante. I batteri crescono entro un range di pH piuttosto ampio: tra 4 e 8, solo un numero ridotto cresce sotto 4 e sopra 8. La maggior parte dei patogeni non è in grado di crescere con valori di pH < 4.5 Alcune Muffe e lieviti possono invece crescere con valori di pH < 2. Il valore di pH del substrato influenza anche la germinazione delle spore: a pH < 4.5 questo fenomeno si arresta.
AZIONE MICROBICIDA DI UN AMBIENTE ACIDO: gli enzimi sono molecole fondamentali alla sopravvivenza batterica, essi sono attivi solo a certi valori di pH, in genere intorno alla neutralità. Quindi un aumento di protoni (H+) nell’alimento ottenuto tramite acidificazione, provoca danneggiamento della membrana cellulare con conseguente ingresso di tali ioni nella cellula batterica e riduzione del pH intracellulare che provoca la denaturazione delle proteine e degli acidi nucleici. La cellula muore (vedi slide pagina 71, 72, 73). COME RIDURRE IL pH DI UN ALIMENTO: Il pH di un alimento può essere ridotto in diversi modi. Per aggiunta diretta di acidi organici come l’acido acetico utilizzato per i prodotti della pesca (marinatura) e per gli ortaggi (sottaceti), l’acido citrico aggiunto alle conserve. Si potrebbero aggiungere anche acidi inorganici come il fosforico ma questi hanno attività antimicrobica inferiore rispetto agli organici. In generale l’acido acetico e quello lattico sono i più utilizzati poiché risultano essere gli inibitori migliori. Per produzione di acidi da reazioni di fermentazione , ad esempio, acido lattico da fermentazione lattica, acido acetico da fermentazione acetica. Negli alimenti acidificati la crescita microbica sia dei batteri patogeni che deterioranti risulta inibita, ma ci sono delle muffe e lieviti ed anche alcuni batteri che sono in grado di metabolizzare gli acidi rialzando il pH dell’alimento e consentendo così la moltiplicazione di patogeni e deterioranti. Tale fenomeno (rialcalinizzazione dell’alimento, favorendo nuovamente la moltiplicazione microbica) interessa soprattutto le insalate, i formaggi molli freschi ed i prodotti a base di pomodoro. ► NUTRIENTI La maggior parte degli alimenti sono ottimi substrati dal punto di vista nutrizionale per i batteri poiché forniscono loro proteine, aminoacidi, monosaccaridi, sali minerali, ecc. La richiesta di nutrienti varia da specie e specie. Le muffe sono in grado di svilupparsi in condizioni più restrittive. I GRAM- sono quelli che hanno maggiori necessità inoltre per una stessa specie microbica la richiesta di nutrienti può variare in base alle condizioni in cui si trovano a crescere, infatti ad elevate temperature o bassi valori di Aw, in generale in condizioni di stress ambientale, le loro esigenze nutrizionali aumentano. La composizione di un alimento favorisce la crescita di alcuni batteri rispetto ad altri:
- Alimenti amidacei (pasta, pane) favoriscono la crescita di batteri che possiedono l’enzima amilasi con cui possono degradare l’amido (Bacillus) (tra le muffe abbiamo il genere Aspergillus).
- Alimenti di origine vegetale favoriscono la crescita dei batteri che possiedono enzimi in grado di degradare la cellulosa e quindi con buona attività pectinolitica (Clostridium, Bacillus, Klebsiella, Aeromonas, ecc.).
- Alimenti proteici (carne) favoriscono la crescita dei batteri che possiedono enzimi ad attività proteolitica come le collagenasi (Bacillus).
- Prodotti lattiero-caseari: essendo ricchi in lattosio favoriscono la crescita per lo più degli enterobatteri in grado di fermentare lattosio (E.coli).
- Frutta: essendo povera di vitamine del gruppo B è attaccata prevalentemente da funghi e lieviti poiché capaci di sintetizzare autonomamente queste vitamine. SOSTANZE ANTIMICROBICHE Gli agenti antimicrobici possono trovarsi naturalmente presenti negli alimenti. Alcuni composti ad azione antimicrobica presenti negli alimenti vegetali sono gli oli essenziali, i polifenoli, i tannini, i glicosidi, e le resine, (nei fagioli ed in alcuni cereali hanno questa azione le lectine), altri componenti antimicrobici sono stati identificati nell’aglio, nella cipolla, nel cacao, negli agrumi, nel miele. Ma possono anche essere prodotti da reazioni ad esempio di imbrunimento. Va tuttavia detto che spesso i microbi sviluppano una resistenza a questi inibitori per cui dal punto di vista pratico l’importanza di tali composti è limitata. Composti antimicrobici si possono inoltre formare nell’alimento in seguito a particolari reazioni che potrebbero avvenire durante la conservazione (che non rendono l’alimento accattivante e
L’UHT è una tecnologia di sterilizzazione in cui il latte è esposto ad alte T° per frazioni di secondo, riducendo al minimo il depauperamento proteico e vitaminico.
- Blanching scottatura, vi si sottopongono i vegetali (spinaci, fagiolini, carote, funghi affettati, e frutta destinata alla produzione di confetture) prima di essere surgelati, essiccati o confezionati in scatola. Consiste in una breve esposizione dell’alimento a ll’acqua bollente o al vapore per pochi minuti. L’esatta procedura operativa dipende dal tipo di alimento. Lo scopo del blanching è quello di ridurre parzialmente la carica microbica almeno per certe forme microbiche in fase vegetativa, muffe e lieviti e inattivare gli enzimi responsabili del deterioramento (prima del congelamento).
- Cottura è un trattamento termico in un mezzo umido (bollitura, cottura al vapore) o secco (forno) protratto per diverso tempo. L’alimento cotto è un alimento sicuro dal punto di vista igienico, sempre che la cottura sia adeguata, ma è il processo che incide maggiormente sulla qualità nutrizionale dell’alimento stesso (la cottura deve raggiungere il cuore del prodotto). ATTENZIONE VA POSTA nei riguardi degli alimenti sottoposti a trattamenti termici perché a RISCHIO di CONTAMINAZIONE POST TRATTAMENTO. Le basse temperature hanno soprattutto un riescono ad uccidere solo i parassiti (anisakis nel pesce) (vedi slide pagina 92). I principali effetti delle basse temperature sui microrganismi sono:
- Rallentamento o arresto della crescita per rallentamento della velocità delle reazioni enzimatiche, con conseguente riduzione delle funzioni metaboliche e del processo di crescita in generale, è noto infatti che gli enzimi necessitano di temperature precise per esercitare la loro azione, e di acqua libera che diminuisce nell’alimento man mano che la T° scende sotto lo zero poiché si trasforma in ghiaccio. L’acqua trasformata in ghiaccio riduce l’aw e inoltre aumenta la viscosità del citoplasma andando a concentrare gli elettroliti.
- Aumento della viscosità del citoplasma, concentrazione degli elettroliti. Si possono distinguere tre tecnologie che sfruttano le basse temperature: refrigerazione; congelamento; surgelamento.
- Refrigerazione temperature di lavoro tra 0 e +4-5°C, è inibita la crescita dei batteri mesofili e termofili ma non quella dei batteri psicrofili e psicrotrofi. Pertanto i prodotti refrigerati si devono considerare a rischio perché in essi si potrebbe verificare crescita di alcuni batteri patogeni (L. monocytogenes, Y. Enterocolitica, Cl. botulinum tipo E) con conseguente produzione di tossine pericolose per il consumatore. In generale per minimizzare la crescita microbica durante la conservazione a freddo è utile monitorare la temperatura quotidianamente (nell’industria alimentare). Evitare di stoccare alimenti caldi in grandi volumi nel frigorifero (la massima carica batterica si realizza nell’intervallo tra +65 e +10°C) che rimarrebbero troppo a lungo caldi. In questi casi l’uso dell’abbattitore che riduce la temp. al cuore del prodotto fino a +3 in 90 minuti è una garanzia di qualità. Evitare l’ammassamento dei prodotti, lasciando uno spazio di circa 5 cm tra i prodotti per permettere la circolazione dell’aria.
- Congelamento si opera un raffreddamento fino a raggiungere, al cuore del prodotto, la temperatura di –12°C/-18°C. In queste condizioni una certa percentuale di batteri muore (termofili e mosofili), la maggior parte rallenta i processi di crescita, ma è ancora in grado di sopravvivere. In generale i batteri gram+ resistono meglio dei gram- alle basse temperature. Le tossine non sono influenzate da tale trattamento. A queste T° l’80-90% dell’acqua è trasformata in ghiaccio ma permane una piccola quantità di acqua che permette ai batteri psicrofili e psicrotrofi di svolgere reazioni degradative seppur lente, ed è per tale motivo che il prodotto congelato non può mantenersi molto a lungo (breve conservazione). Il congelamento può essere lento con formazione di grandi nuclei di cristallizzazione associati a rottura della
parete/membrana cellulare e danneggiamento delle qualità organolettiche dell’alimento (abbandonata dall’industria alimentare). Qui la crescita microbica si riduce poco perché il microrganismo si adatta a queste T°, e la formazione dei grossi cristalli porta alla perdita delle caratteristiche nutrizionali. Oppure può essere un congelamento rapido con la formazione di cristalli più piccoli, maggior uccisione batterica, elevato shock termico. Questo trattamento è preferibile dalle aziende in quanto non comporta alterazione delle qualità nutrizionali, non rompe le membrane.
- Surgelamento è una tecnica di congelamento ultrarapido, si definisce prodotto surgelato un “prodotto alimentare in confezione chiusa sottoposto ad un trattamento tale da abbassare rapidamente la temperatura a –18°C/-25°C e mantenuto a tale temperatura fino alla vendita al consumatore”. L’abbassamento della temperatura deve avvenire in un tempo massimo di 4 ore. Con tale metodo si ottiene la micro-cristallizzazione dell’acqua contenuta nel prodotto che al momento dello scongelamento rimane in loco mantenendo intatte le strutture cellulari. Ne deriva che tale alimento conserva intatti i caratteri organolettici e nutrizionali dell’alimento fresco ed offre la massima garanzia sotto il profilo igienico-sanitario. All’atto dello scongelamento i batteri che non sono morti hanno una fase di latenza piuttosto lunga e poi iniziano a replicarsi, ne consegue che l’alimento surgelato e poi scongelato deve essere avviato il più rapidamente possibile alle successive fasi di lavorazione (vedi slide pagina 97). ► UMIDITÀ AMBIENTALE L’umidità dell’ambiente influenza i valori di Aw di un alimento. Dal punto di vista microbiologico una bassa umidità ambientale risulta favorevole per la qualità igienico-sanitaria dell’alimento in quanto determina un abbassamento di Aw sulla superficie dell’alimento sfavorendo la crescita microbica, viceversa un’elevata umidità ambientale determina la condensazione dell’acqua sulla superficie del prodotto aumentando la Aw e di conseguenza la crescita batterica. L'influenza dell'umidità sul fattore Aw dipende oltre che dal gradiente esistente tra l'umidità ambientale ed il valore di Aw dell'alimento anche dalla pezzatura dell’alimento stesso (prodotti in piccole pezzature raggiungono l’equilibrio idrico tra alimento ed aria in minor tempo rispetto a prodotti di grandi pezzature) e dal tempo a disposizione. Se produciamo un alimento essiccato, poi dobbiamo stare attenti all’umidità ambientale che andrebbe a rovinare lo sviluppo di quel prodotto. ► ATMOSFERA MODIFICATA (I GAS) Hanno azione battericida generale o selettiva.
- OSSIGENO alle concentrazioni presenti in atmosfera i batteri anaerobi stretti sono inibiti mentre gli anaerobi facoltativi sono rallentati (bacillus, enterobatteri e batteri lattici), gli aerobi stretti (Pseudomonas e micrococcus) sono invece stimolati. In concentrazioni superiori a quelle atmosferiche si generano radicali perossidici che neanche la catalasi e la perossidasi microbica riescono ad eliminare. Attraverso la sottrazione di ossigeno si può impedire la crescita dei batteri aerobi che ne hanno bisogno per ricavare l’energia (ATP) necessaria per le funzioni vitali utilizzandolo come accettore finale di elettroni. Confezionamento sotto vuoto con materiali impermeabili all’ossigeno. Nella carne fresca confezionata sotto vuoto e conservata tra 0-5°C l’ossigeno residuo viene consumato rapidamente dai psicrotrofi aerobi (pseudomonadaceaea) con un conseguente rapido aumento della CO2 (da 10% a 30% in 4 h) come conseguenza della respirazione microbica, viene così rallentato lo sviluppo dei primi m.o. e favorito, T° permettendo, quello dei batteri resistenti alla CO2 (lactobacillus e carnobacterium spp.). L’abbassamento del pH che ne consegue per l’accumulo di acido lattico e di eventuali batteriocine prodotte allunga il tempo di conservazione della carne di parecchie settimane.
- ANIDRIDE CARBONICA (CO2) influenza la crescita microbica in maniera proporzionale alla sua concentrazione e alla temperatura di conservazione. Agisce attraverso: l’acidificazione diretta del citoplasma microbico; altera la permeabilità della membrana con conseguente squilibrio dei movimenti in/out dei soluti; inibisce direttamente alcuni sistemi enzimatici
Olanda Regno Unito, Polonia, Repubblica ceca, per i seguenti prodotti: patate, frutta, ortaggi, cereali, carni di pollo, prodotti ittici, grano e cereali. In Italia il Ministero della Sanità ha autorizzato soltanto l’irradiazione a scopo anti-germogliativo (patate, aglio, cipolle). Decreto Legislativo 30 gennaio 2001, n. 94 (attua le direttive comunitarie 1999/2/CE e 1999/3/CE): disciplina il trattamento delle derrate alimentari con radiazioni ionizzanti (vedi slide pagina 112). LA RESISTENZA ALLE RADIAZIONI: G+ (Enterococcus faecium, micrococchi) > G- Sporigeni (Cl. Botulinum tipo A) > non sporigeni Lieviti > Muffe. Maggiore è il numero delle cellule microbiche minore è l’efficacia di un determinato dosaggio. Se i m.o. si trovano in un mezzo acquoso sono più sensibili rispetto a substrati ricchi in proteine che esercitano un’azione protettiva. I Nitriti rendono le spore più sensibili alle radiazioni (vedi slide pagina 114, 115, 116). RUOLO DEI M.O. NEGLI ALIMENTI : 1) DETERIORANTI hanno un ruolo negativo in quanto responsabili del deterioramento dell’alimento e della perdita della sua qualità organolettica (accorciano la shelf life dell’alimento, il tempo di conservazione). Si tratta di m.o. metabolicamente molto attivi che utilizzano i componenti dell’alimento per la loro moltiplicazione. Le proteine sono idrolizzate da proteasi e peptidasi fino ad aminoacidi. Se il processo avviene in assenza di ossigeno si chiama putrefazione, si originano sostanze maleodoranti tra cui H2S, solfuro di metile, mercaptani, NH3, indolo, acidi grassi. I carboidrati vengono demoliti ad acqua e anidride carbonica oppure sono decomposti in anaerobiosi secondo 6 fermentazioni diverse. I lipidi vengono idrolizzati a glicerolo, acido grasso e fosfato nel caso dei fosfolipidi (vedi slide pagina 119, 120). 2) PRO-TECNOLOGICI (m.o. starter) essi hanno un ruolo positivo nell’alimento, importanti dal punto di vista tecnologico per le industrie alimentari sono ad esempio i lieviti coinvolti nella fermentazione per la produzione di vino o birra, i lactobacilli per i formaggi e lo yogurt. La fermentazione aiuta a prolungare la shelf life dell’alimento (riduzione di zuccheri, formazione di sostanze come l’etanolo, riduzione del pH) e modifica le caratteristiche organolettiche e nutritive dello stesso grazie alla biosintesi di vitamine, aminoacidi essenziali e l’aumento della digeribilità di fibre e proteine. 3) PATOGENI danno origine alle malattie alimentari. Devono tuttavia raggiungere la cosiddetta carica infettante = valore di carica batterica tale da indurre malattia nell’uomo. Tali parametri sono da intendersi esclusivamente indicativi poiché altri fattori (matrice alimentare, stress fisico/chimici, variabilità di specie) possono modificare la capacità di sopravvivenza dei m.o. PARAMETRI DI TRATTAMENTO TERMICO PER L’INATTIVAZIONE DEI PATOGENI NEGLI ALIMENTI:
4) MICRORGANISMI INDICATORI DI QUALITÀ Anche se dal punto di vista igienico-sanitario i m.o. presenti nell’alimento di maggiore interesse sono quelli legati alla possibilità di trasmettere malattie all’uomo, altrettanto importante è lo studio dei m.o. indicatori di qualità o dei loro prodotti metabolici. Essi indicano l’idoneità dei processi e permettono di predire la shelf-life del prodotto alimentare (in base alla quantità e al tipo possiamo definire un tempo di conservazione dell’alimento). In quegli alimenti caratterizzati da un microbiota ristretto la qualità del prodotto è direttamente proporzionale alla carica batterica di tale m.o. ed il suo controllo può allungare sensibilmente la shelf-life del prodotto. In questo caso il numero totale di unità microbiche può essere stabilito attraverso tecniche colturali con appropriati terreni selettivi oppure attraverso tecniche coltura- indipendenti quali la Real time PCR. In quegli alimenti caratterizzati da un microbiota complesso si considerano dei gruppi microbici come indicatori di qualità più che un singolo microrganismo. Quelli maggiormente impiegati sono gli aerobi totali che possono fornire utili indicazioni sul suo stato microbiologico, riflettendo esso la storia produttiva dell’alimento stesso, condizionandone lo stato di conservabilità, la comparsa di fenomeni alterativi ed evidenziando le condizioni di trasformazione e di conservazione. Si effettua una conta totale su piastra in condizioni aerobiche (semina per inclusione). Questo parametro valuta solo i m.o. vitali quindi non può fornire indicazioni sulla qualità delle materie prime se esse hanno subito un trattamento termico (batteri presenti magari anche in cospicue quantità ma morti…non li vediamo in piastra!!). Modificando le condizioni di incubazione e la composizione del substrato si possono avere informazioni più specifiche (presenza di termodurici, termofili, mesofili, psicrofili, ecc.). In base al valore di questo parametro si valuta la conformità dell’alimento rispetto a determinati standard legislativi e linee guida (validi per ciascuna tipologia di alimento) (vedi slide pagina 124, 125, 126, 127).
Lymulus) ricche di granuli citoplasmatici contenenti un polipeptide attivato dalla presenza di endotossine (coagulageno). Maggiore è il contenuto di endotossine maggiore è l’enzima attivato e maggiore sarà la coagulazione. Gli amebociti devono prima essere estratti dal sangue dell’animale (30% del sangue viene sottratto all’animale) poi lisati per liberare il polipeptide. Tanto più coagulo si forma, tanto più LPS si forma) (vedi slide pagina 138).
- IL CAMPIONAMENTO (ISO 17025:2017) È importante perché è impossibile analizzare l’intero. Se adeguatamente condotto permette di estendere i risultati all’intero lotto. [Campionamento corretto = risultato corretto]. IL CAMPIONAMENTO SI ESEGUE PER: verificare la rispondenza ai requisiti legislativi, nella gestione dei casi di emergenza e nei casi sospetti o per segnalazioni di irregolarità; durante il processo di lavorazione per verificare le condizioni igieniche del prodotto durante le varie fasi; per controllare la correttezza dei programmi di sanificazione (su pavimenti e superfici). Alcune definizioni: - Lotto (o partita) quantità definita ed omogenea di alimento prodotta e confezionata in condizioni uniformi entro un limitato periodo di tempo (giornata lavorativa, turno di lavoro…) senza interruzioni e sospensioni (impiegando le stesse materie prime, gli stessi operatori e gli stessi macchinari).
- Campione rappresentativo una frazione di lotto, rappresentativa della totalità, che viene prelevata e sulla quale verranno eseguite le analisi di laboratorio.
- Aliquota frazione rappresentativa del campione, costituita da unità campionarie.
- Unità campionaria (o di campionamento) unità elementare del campione, una o più unità vanno a costituire le aliquote, le unità campionarie devono essere selezionate casualmente. Possono essere costituite da confezioni intere o parti di confezione prelevate asetticamente (vedi slide pagina 143). COME SI ESEGUE IL CAMPIONAMENTO :
- NON PROBABILISTICO non basato sulla randomizzazione (casualità) ma su altri criteri (facilità di raggiungimento del prodotto, comodità), soggetto a forte distorsione.
- RANDOMIZZAZIONE SEMPLICE scelta casuale del materiale da prelevare (si numerano le confezioni e si scelgono numeri a caso).
- RANDOMIZZAZIONE SISTEMATICA si seguono intervalli regolari (si numerano le confezioni e si prelevano i sacchetti pari, oppure 1 sacchetto ogni 4).
- RANDOMIZZAZIONE STRATIFICATA i campioni vengono stratificati in base ad un fattore che potrebbe influenzare il carattere in studio poi all’interno di ciascuno strato si seleziona con metodo randomizzato (ad esempio si potrebbe stratificare secondo la dimensione). È fondamentale che il campione arrivi in laboratorio nelle stesse condizioni microbiologiche in cui si trova al momento del prelievo e questo si verifica se si seguono alcuni accorgimenti:
- Prelievo in sterilità (utensili sterili monouso o in acciaio da ri-sterilizzare tra una operazione e l’altra, uso di contenitori sterili) in ambienti non ventilati, puliti e con superfici lavabili.
- Confezionamento del campione e sigillatura in modo da evitare manomissioni.
- Corretto trasporto in laboratorio (vedi slide pagina 146). Al ricevimento, sempre secondo la norma ISO 7218:2007, si deve verificare: l’idoneità del campione (condizione e quantità); la congruenza con quanto riportato nel verbale del prelievo che deve sempre essere allegato al campione; la temperatura di arrivo. RIFIUTARE i campioni che non rispettano questi requisiti. ERRORI PIU’ FREQUENC NELLE FASI DI CAMPIONAMENTO E NEL TRASPORPTO:
- ERRORE NEL CONFEZIONAMENTO DEL CAMPIONE;
- ASSENZA DELL’ESATTA INDICAZIONE DELLA NATURA DELLA MERCE;
• CONFUSIONE TRA ALIQUOTA E UNITA’ CAMPIONARIA;
• QUANTITA’ INSUFFICIENTE DEL CAMPIONE PER LE PROVE DA ESEGUIRE;
• NON C’E' CORIZISPONDENZA TRA N. DI CARTELLINO E N. DI VERBALE;
• RICHIESTA DI ESAMI ANALITICI INADEGUATI;
• RICHIESTA DI ESAMI APPROSSIMATIVA;
• RICHIESTA DI ANALISI IRRIPETIBILE QUANDO NON SUSSISTANO LE CONDIZIONI;
• CONFUSIONE TRA RIPETIZIONE DI ANALISI E REVISIONE;
• ERRORI SUL N. DI ALIQUOTE CAMPIONATE O DA LASCIARE IN LABORATORIO;
- CONFUSIONE SUL CORRETTO UTILIZZO DEI CAMPIONI IN CONTRADDITTORIO (vedi slide pagina 149-170).
MTA – MALATTIE A TRASMISSIONE ALIMENTARE
- SALMONELLA PRESENZA DI SALMONELLA NELL’ALIMENTO: Le SALMONELLOSI MINORI Identificazione del pericolo: gastroenteriti molto diffuse sia in Europa (seconda malattia da alimenti) che in USA (prima) (vedi slide pagina 171).
- EPIDEMIOLOGIA : Salmonella ha una diffusione mondiale, anche se sierotipi diversi possono essere riscontrati in differenti parti del mondo. In Italia le infezioni da Salmonella sono sottoposte ad obbligo di notifica al SSN. Si contano 10-15000 casi/anno con una mortalità di 20individui/anno soprattutto anziani 2001 Australia (Queensland) 41 casi, insalata, macchina usata in fabbrica per il taglio dell’insalata è risultata contaminata. 2001 Australia, 28 casi, budino al mango, contaminazione da personale malato 2002 Florida, 141 persone, pomodori confezionati tagliati a dadini. 2002 Inghilterra, più di 1000 casi con 17 morti, uova. 2002 Posillipo (Napoli) 128 partecipanti ad un banchetto nuziale, salsa olandese servita insieme alla spigola, preparata con uova fresche lasciate per 5h a T° ambiente (30°C) 2017 infezione internazionale (Germania Regno Unito Finlandia) da S. Agona, cetrioli.
- Caratterizzazione del Pericolo (tassonomia, caratteristiche e virulenza) : Si tratta di una malattia infettiva a trasmissione oro-fecale dovuta ad una infezione da batteri appartenenti al genere Salmonella, della famiglia delle Enterobacteriaceae. Questo genere si divide in due sole specie: Enterica e Bongori. Ciascuna delle due specie si divide in un elevato numero di sierotipi (serovar), l’OMS ne ha identificati, solo per la S. enterica, 2610. I vari sierotipi si differenziano in base alle caratteristiche degli Antigeni O ed H secondo lo schema di Le Minor-Kauffmann-White (vedi slide pagina 173, 174). I sierotipi maggiormente coinvolti nelle tossinfezioni alimentari sono S.
- Cacao.
- LE UOVA : la Salmonella può trovarsi sul guscio o all’interno. La contaminazione esterna deriva dal contatto con il materiale fecale alla deposizione, la presenza all’interno dell’uovo può derivare sia dalla penetrazione attraverso le membrane del guscio, sia dall’ovidutto che viene colonizzato dai macrofagi infettati a livello intestinale o attraverso una infezione ascendente della cloaca. S. enteriditis presenta specifici meccanismi molecolari che la rendono in grado di sopravvivere ai composti antibatterici presenti nell’albume.
- PATOGENESI NEGLI AVICOLI La sede preferenziale di localizzazione intestinale negli avicoli è l’intestino ceco, almeno nelle specie che lo possiedono, con conseguente flogosi accompagnata da danno tissutale. Dall’intestino le salmonelle possono diffondere per via ematica, raggiungendo prima fegato e milza e poi potenzialmente qualsiasi organo. Alcuni ceppi, generalmente appartenenti al sierotipo Enteritidis, sembrano possedere uno spiccato tropismo per l’apparato riproduttore con conseguente trasmissione verticale (vedi slide pagina 180).
- PATOGENESI NEI SUINI Nel suino, il primo sito di colonizzazione e replicazione delle salmonelle è la mucosa delle tonsille. Tuttavia, questa sede non sembra rappresentare una porta di ingresso per la diffusione sistemica e generalmente non si osservano sintomi clinici associati a questa evenienza. Superato lo stomaco, le salmonelle giungono nell’intestino dove si localizzano preferenzialmente a livello di ileo, ceco e colon. Il colon in particolare sembra essere l’organo maggiormente colpito con conseguente sviluppo di una colite necrotica diffusa o focale. L’adesione e la penetrazione possono avvenire sia a livello di Cellule M che degli enterociti. La massiccia replicazione all’interno degli enterociti, unita al richiamo di cellule della linea bianca, porta al danno tissutale. L’elevata risposta infiammatoria e immunitaria che ne conseguono fanno sì che spesso, in questa specie, l’infezione rimanga confinata a livello intestinale (vedi slide pagina 181).
- MECCANISMI DI PATOGENICITA’ NELL’UOMO (vedi slide pagina 182). SUPERAMENTO DELLA BARRIERA GASTRICA L’acidità gastrica, insieme alla pepsina, rappresenta la prima e più importante barriera che le salmonelle, così come altri patogeni gastroenterici, devono superare. Il pH dello stomaco in un soggetto sano è generalmente inferiore a 3, ed è determinato dalla presenza di acido cloridrico secreto dalle cellule parietali gastriche. Tali valori di pH, oltre a svolgere funzioni digestive, risultano fattori difensivi nei riguardi dei microrganismi, inoltre sono necessari per convertire il pepsinogeno, secreto anch’esso dalle cellule della mucosa gastrica, nella forma attiva (pepsina). La pepsina è un enzima ad azione proteolitica, che svolge un’azione sia sulla digestione delle proteine che sull’uccisione dei batteri ingeriti con gli alimenti. Salmonella ha sviluppato un sistema di resistenza nei confronti dell’acidità gastrica, in modo da giungere nell’intestino. Meccanismo di resistenza all’acidità gastrica: “stationary phase acid tolerance response” (SP ATR) e “Log Phase Acid Tolerance Response” (LP ATR), durante le quali producono particolari proteine dette acid shock proteins (ASPs). Le proteine (ASPs) contrastano gli effetti potenzialmente letali degli acidi. Il meccanismo responsabile della LP ATR determina anche la resistenza a numerosi altri fattori che possono danneggiare il batterio come lo stress ossidativo, lo shock da calore, l’alta osmolarità e i danni al DNA. COLONNIZAZIONE INTESTINALE E DIFFUSIONE : la localizzazione è soprattutto a livello del tenue. Possono aderire, attraverso adesine e fimbrie, all’enterocita e tramite il sistema di secrezione di tipo 3, traslocare all’interno del citoplasma della cellula ospite svariate proteine che hanno, tra l’altro, la funzione di indurre modificazioni della morfologia dell’enterocita (alterazione dei filamenti di actina e quindi del citoscheletro). Consegue la protrusione di pseudopodi che internalizzano il batterio. Alcune di queste proteine fungono da tossine responsabili degli eventi tipici della gastroenterite, stimolando la secrezione di fluidi nel lume intestinale e soprattutto stimolando la produzione di citochine (IL-8), che richiamano leucociti (neutrofili) verso la porzione
apicale degli enterociti. La conseguenza di questo fenomeno è l’accumulo di cellule infiammatorie e fluidi ricchi di proteine nel lume, che determinano un ulteriore richiamo di acqua, e provoca la necrosi delle porzioni di epitelio interessate (DIARREA SANGUINOLENTA) (vedi slide pagina 185, 186). SOPRAVVIVENZA NEL FAGOSOMA : attraverso il T3SS-2 vengono traslocate nel citoplasma dei macrofagi alcune proteine, che inibiscono l’assemblaggio della NADPH- ossidasi a livello della membrana del fagosoma prevenendo o riducendo la produzione di radicali superossidi (O2.-) nel vacuolo contenente il m.o. Inoltre la presenza di catalasi inattiva l’effetto di H2O2 eventualmente formato (vedi slide pagina 186).
- MISURE DI CONTROLLO :
- Controllo delle fonti di approvvigionamento idrico;
- Riconoscimento dei portatori nell’ambito del personale addetto alle imprese alimentari;
- Protezione degli alimenti dal contatto con le mosche importanti vettori;
- Cuocere con cura tutti i cibi di origine animale;
- Lavare con acqua potabile i vegetali che si consumano crudi;
- Evitare la contaminazione crociata;
- In ambito industriale utilizzare adeguatamente le temperature sia basse che alte, abbassare la Aw sotto 0.94.
- METODI ANALITICI PER LA DETERMINAZIO NE DI SALMONELLA NEGLI ALIMENTI : METODI TRADIZIONALI (NORMA ISO 6579:2002 Corr 1:2004) : affidabili ma lunghi, sfruttano l’impiego di terreni di coltura e analisi biochimiche e sierologiche. Fasi:
- Pre-arricchimento terreno non selettivo che permette alle salmonelle presenti ma stressate per i trattamenti tecnologici e di manipolazione a cui l’alimento è sottoposto di riprendersi e moltiplicarsi così da aumentare di numero. Si usano brodi ricchi e completi: acqua peptonata tamponata a pH7 per la maggior parte degli alimenti; latte scremato sterile +verde brillante 0.02% per cacao e derivati.
- Arricchimento serve a selezionare le salmonelle (favorisce la loro crescita a discapito di altri m.o. ). 1 o 0.1 ml di pre-arricchimento (in base alla maggiore o minore capacità selettiva del brodo) sono trasferiti in uno o più terreni selettivi: Brodo selenito cistina (non più molto utilizzato per la presenza di sodio selenito acido, altamente tossico e quindi con problemi di smaltimento); Brodo Rappaport Vassiliadis; Brodo tetrationato Novobiocina (tutti e 3 a 37°C x 24-48 ore).
- Isolamento consiste in uno striscio su terreni selettivi e differenziali sui quali Salmonella cresce con colonie facilmente differenziabili: Desossicolato citratolattosio agar (DCLA): la salmonella cresce con colonie diafane (lac-) talvolta con centro nero (produzione di H2S); Bismuto sulfite agar BSA: la salmonella cresce con colonie nere con riflessi centrali metallici. Questi 2 a 37°C per 24 ore. Verde brillante agar BGA: la salmonella cresce con colonie rosse circondate da un alone rosso; Rambac; Salmonella shigella agar SSA (vedi slide pagina 190).
- Identificazione e conferma IDENTIFICAZIONE COLONIE SOSPETTE: Test sierologico (agglutinazione con siero polivalente); Tipizzazione fagica; Prove biochimiche (API test) (vedi slide pagina 191). METODI RAPIDI : risultati in 24h, vantaggio di prendere decisioni in tempi rapidi:
- Metodi biomolecolari (PCR e PCR real-time): basati sullo studio di specifiche sequenze geniche (DNA/RNA) dell’agente patogeno da ricercare. PCR (Polymerase chain reaction) : (Mullis Premio Nobel per la chimica): reazione enzimatica di amplificazione in vitro di un segmento di DNA ottenuta attraverso una Taq polimerasi utilizzando specifici primers. Fasi: ARRICCHIMENTO DELLA MATRICE CONTENENTE IL M.O.; ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI; AMPLIFICAZIONE DELLA SEQUENZA SPECIFICA; DETERMINAZIONE DEI PRODOTTI DELLA PCR tramite corsa su gel di agarosio e colorazione con
