INDICATORI MICROBIOLOGICI | Dispense di Microbiologia

Indicatori microbiologici e valutazione della qualità

delle acque super ciali

Riassunto. - La valutazione della qualità microbiologica dell’acqua viene storicamente effettuata mediante

la ricerca di microrganismi indicatori. Negli anni più recenti gli studi e le evidenze sperimentali hanno portato

ad una revisione del signi cato sanitario dei tradizionali indicatori di contaminazione fecale. Per varie ragioni,

Escherichia coli e gli enterococchi meglio ottemperano ai criteri di de nizione di organismo indicatore rispetto

ai tradizionali coliformi fecali e streptococchi fecali. Per la loro elevata resistenza le spore di Clostridium

perfringens potrebbero rappresentare un utile indicatore di contaminazione microbica dei sedimenti. Nel lavoro

vengono passate in rassegna le più recenti normative relative alla salvaguardia delle acque super ciali con

particolare attenzione ai parametri microbiologici.

Parole chiave: acque di super cie, E. coli, enterococchi, indicatori microbici.

Summary (Microbial indicators and fresh waters quality assessment). - Traditionally, the microbiological

quality of waters has been measured by the analysis of indicator microorganisms. The article reviews the

sanitary signi cance of traditional indicators of faecal contamination (total coliforms, faecal coliforms and

faecal streptococci) and points out their limits. For some characteristics Escherichia coli may be considered a

more useful indicator then faecal coliforms and recently it has been included in all recent laws regarding fresh,

marine and drinking water. A clearer taxonomic de nition of faecal streptococci evidenced the dif culty into

de ning a speci c standard methodology of enumeration and suggested the more suitable role of enterococci

as indicator microorganisms. Several current laws require the detection of enterococci. The resistance of

Clostridium perfringens spores may mean that they would serve as a useful indicator of the sanitary quality of

sea sediments.

Key words: surface water, E. coli, enterococchi, microbial indicators.

Introduzione

Nell’ampio spettro di patologie umane trasmesse

attraverso l’acqua alcune sono da attribuire a

microrganismi autoctoni dell’ambiente acquatico, la

cui incidenza è correlata alle esposizioni umane alle

naturali risorse idriche (Legionella sp., Pseudomonas

aeuriginosa, Vibrio sp.), altre, in numero prevalente,

sono dovute ad agenti patogeni derivanti dal tratto

gastrointestinale degli animali a sangue caldo e

dell’uomo, pervenuti nell’ambiente acquatico in seguito

ad episodi di contaminazione fecale; in quest’ultimo

caso, la concentrazione dei microrganismi patogeni

nell’ambiente dipende dal numero di persone infette

e di portatori asintomatici presenti nella comunità,

dall’ef cacia dei sistemi di trattamento e dalla capacità

di autodepurazione dei corpi idrici recettori.

Poiché le metodiche di rilevamento e di

quanti cazione dei microrganismi patogeni sono

spesso molto articolate, costose, caratterizzate da scarsa

ef cienza di recupero e comunque richiedenti un elevato

livello di specializzazione da parte degli operatori, e

peraltro non disponibili per tutti i microrganismi, la

valutazione della qualità microbiologica dell’acqua

si basa sulla de nizione e sulla ricerca di organismi

indicatori per i quali vengono ssati opportuni valori

guida [1].

Un organismo per essere elevato al ruolo di

indicatore deve soddisfare i seguenti requisiti:

deve essere presente nell’acqua tutte le volte in

cui sono presenti i microrganismi patogeni;

la sua concentrazione nell’acqua deve essere in

relazione a quella dei microrganismi patogeni e comunque

deve ri ettere il livello di inquinamento microbiologico;

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Indicatori microbiologici e valutazione della qualità

delle acque super ciali

Riassunto. - La valutazione della qualità microbiologica dell’acqua viene storicamente effettuata mediante la ricerca di microrganismi indicatori. Negli anni più recenti gli studi e le evidenze sperimentali hanno portato ad una revisione del signi cato sanitario dei tradizionali indicatori di contaminazione fecale. Per varie ragioni, Escherichia coli e gli enterococchi meglio ottemperano ai criteri di de nizione di organismo indicatore rispetto ai tradizionali coliformi fecali e streptococchi fecali. Per la loro elevata resistenza le spore di Clostridium perfringens potrebbero rappresentare un utile indicatore di contaminazione microbica dei sedimenti. Nel lavoro vengono passate in rassegna le più recenti normative relative alla salvaguardia delle acque super ciali con particolare attenzione ai parametri microbiologici. Parole chiave: acque di super cie, E. coli , enterococchi, indicatori microbici. Summary (Microbial indicators and fresh waters quality assessment). - Traditionally, the microbiological quality of waters has been measured by the analysis of indicator microorganisms. The article reviews the sanitary signi cance of traditional indicators of faecal contamination (total coliforms, faecal coliforms and faecal streptococci) and points out their limits. For some characteristics Escherichia coli may be considered a more useful indicator then faecal coliforms and recently it has been included in all recent laws regarding fresh, marine and drinking water. A clearer taxonomic de nition of faecal streptococci evidenced the dif culty into de ning a speci c standard methodology of enumeration and suggested the more suitable role of enterococci as indicator microorganisms. Several current laws require the detection of enterococci. The resistance of Clostridium perfringens spores may mean that they would serve as a useful indicator of the sanitary quality of sea sediments. Key words: surface water, E. coli , enterococchi, microbial indicators. Introduzione Nell’ampio spettro di patologie umane trasmesse attraverso l’acqua alcune sono da attribuire a microrganismi autoctoni dell’ambiente acquatico, la cui incidenza è correlata alle esposizioni umane alle naturali risorse idriche ( Legionella sp., Pseudomonas aeuriginosa , Vibrio sp.), altre, in numero prevalente, sono dovute ad agenti patogeni derivanti dal tratto gastrointestinale degli animali a sangue caldo e dell’uomo, pervenuti nell’ambiente acquatico in seguito ad episodi di contaminazione fecale; in quest’ultimo caso, la concentrazione dei microrganismi patogeni nell’ambiente dipende dal numero di persone infette e di portatori asintomatici presenti nella comunità, dall’ef cacia dei sistemi di trattamento e dalla capacità di autodepurazione dei corpi idrici recettori. Poiché le metodiche di rilevamento e di quanti cazione dei microrganismi patogeni sono spesso molto articolate, costose, caratterizzate da scarsa ef cienza di recupero e comunque richiedenti un elevato livello di specializzazione da parte degli operatori, e peraltro non disponibili per tutti i microrganismi, la valutazione della qualità microbiologica dell’acqua si basa sulla de nizione e sulla ricerca di organismi indicatori per i quali vengono ssati opportuni valori guida [1]. Un organismo per essere elevato al ruolo di indicatore deve soddisfare i seguenti requisiti:

deve essere presente nell’acqua tutte le volte in cui sono presenti i microrganismi patogeni;
la sua concentrazione nell’acqua deve essere in relazione a quella dei microrganismi patogeni e comunque deve ri ettere il livello di inquinamento microbiologico;

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la sua sopravvivenza nell’acqua deve essere simile a quella dei microrganismi patogeni;
la resistenza nei confronti dei trattamenti di depurazione e di disinfezione deve essere simile a quella dei microrganismi patogeni;
non deve essere patogeno;
il suo ruolo di indicatore deve essere valido in qualsiasi tipologia di acqua che richieda un programma di monitoraggio;
le sue caratteristiche non devono mutare nel tempo;
non deve essere in grado di moltiplicarsi o crescere nell’acqua;
deve essere rilevabile con metodi semplici, accurati, rapidi ed economici. Il ricorso all’uso di organismi indicatori non consente una stima diretta della presenza di un dato microrganismo patogeno nell’ambiente idrico; permette, piuttosto, la valutazione della probabilità che esso sia presente. Nessuno degli indicatori può dare la sicurezza dell’assenza anche di patogeni primari o potenziali, specialmente di quelle forme dotate di alto potere infettante ed elevata resistenza alle condizioni ambientali e alla disinfezione (cisti di protozoi, virus enterici). Infatti , non esiste un indicatore capace di segnalare tutti i patogeni, anche nel circoscritto ambito dell’inquinamento fecale. La ricerca degli indicatori, rispetto a quella diretta dei singoli microrganismi patogeni, ha inoltre il vantaggio di essere indipendente dall’endemicità di alcune infezioni microbiche; infatti, i dati desunti dalla ricerca diretta dei patogeni, non hanno un valore predittivo poiché sono legati a diversi fattori, primo fra tutti la diffusione delle patologie nella popolazione, e potrebbero condurre a conclusioni poco attendibili. Storicamente i microrganismi più ampiamente usati come indicatori di contaminazione fecale dell’acqua sono stati i coliformi totali, i coliformi fecali e gli streptococchi fecali; tuttavia, in considerazione dei limiti, di seguito riportati, che questi tradizionali indicatori hanno dimostrato, le normative di più recente elaborazione prevedono anche (o in alternativa) la ricerca di nuovi indicatori quali Escherichia coli e le spore dei clostridi sol to-riduttori. Indicatori microbiologici I coliformi totali sono batteri aerobi ed anaerobi facoltativi, gram-negativi, non sporigeni, bastoncellari, che fermentano il lattosio con produzione di gas e di acido in 24-48 ore, a 36 ± 1 °C. I coliformi totali appartengono alla famiglia delle Enterobacteriacee ed includono generi quali Escherichia, Enterobacter , Klebsiella e Citrobacter ; la de nizione di tale gruppo non si basa su criteri tassonomici , ma su speci che reazioni biochimiche. Storicamente i coliformi totali sono stati utilizzati come un indice di qualità dell’ambiente idrico. Il signi cato sanitario loro attribuito trae origine dall’elevata concentrazione dei coliformi totali nel materiale fecale di origine umana (10^9 UFC/g). Tuttavia, alcuni membri appartenenti al gruppo dei coliformi totali sono largamente diffusi nell’ambiente dove colonizzano suolo, acqua, aria e vegetazione. La loro ampia diffusione in natura, documentata da una origine non strettamente enterica, la ridotta capacità di sopravvivenza nell’ambiente rispetto a virus e a parassiti, la capacità di alcuni coliformi di replicarsi nell’ambiente e, non ultima, la mancanza di una relazione tra le densità dei microrganismi patogeni e i coliformi totali, hanno fatto sorgere dubbi sulla loro validità come indicatori [1]. Anche in ambienti marini i coliformi totali hanno una capacità di sopravvivenza inferiore rispetto ad alcuni microrganismi patogeni [2]. Studi epidemiologici hanno inoltre evidenziato che la presenza di coliformi totali non è correlata alla diffusione di patologie acquisite con il consumo di acqua potabile e quindi il loro rilevamento non ha incidenza sulla qualità microbiologica dell’acqua stessa [3]. I coliformi fecali, meglio de niti come coliformi termotolleranti, per la loro capacità di fermentare il lattosio con produzione di gas e acido alla temperatura di 44,5 ± 0,2 °C e con un tempo di incubazione di 24- 48 ore, sono un sottogruppo dei coliformi totali più strettamente correlati al tratto intestinale degli animali a sangue caldo. In questi ultimi anni sono stati evidenziati alcuni limiti nell’impiego dei coliformi come indicatori di contaminazione fecale delle acque e si è delineata la necessità di sostituire il parametro coliformi fecali con E. coli. Infatti, considerata l’elevata rappresentanza della specie E. coli nell’ambito del gruppo dei coliformi fecali (90%), nonché l’esclusivo rapporto del microrganismo con il tratto intestinale dell’uomo e degli animali a sangue caldo, tenuto anche conto dell’origine non necessariamente fecale dei microrganismi appartenenti a tale gruppo e del loro spiccato potenziale di ricrescita una volta pervenuti nell’ambiente, E. coli meglio assolve il ruolo di indicatore [4]. Anche recenti studi dell’EPA sostengono l’inadeguatezza dei coliformi fecali come indicatori di contaminazione fecale per le acque adibite a scopi ricreazionali [5]. Tale scelta, secondo recenti studi, è anche motivata dalla maggiore stabilità nella presenza di E. coli nelle acque ambientali nel corso dell’anno, rispetto ai coliformi fecali e totali che risulterebbero più sensibili alle variazioni stagionali e non di meno dalla minore sensibilità del microrganismo alle procedure di disinfezione rispetto alla maggior parte dei patogeni enterici [6].

356 e nell’intestino di alcuni animali a sangue caldo; alcune specie sono fortemente patogene per l’uomo (Clostridium tetani e Clostridium botulinum ) perché producono tossine molto potenti. Tra i clostridi sol to- riduttori Clostridium perfringens, specie di sicura origine fecale, la cui concentrazione nelle feci umane è compresa tra 10^2 e 10^7 UFC/g, è stato proposto come indicatore di inquinamento fecale. Poiché le spore dei clostridi sol to-riduttori sopravvivono per lunghi periodi nell’acqua e sono più resistenti dei coliformi e degli streptococchi ai trattamenti di disinfezione, possono essere utilizzate, insieme ai classici indicatori, come indicatori secondari di ef cienza di trattamenti delle acque. Inoltre il reperimento in acqua di spore di clostridi sol to- riduttori, senza la contemporanea presenza di coliformi e di streptococchi, consente di poter ritenere che l’acqua in oggetto abbia subito un processo di contaminazione in epoca non recente. Acque in cui sia stata registrata assenza di E. coli e di streptococchi, potrebbero non essere indenni dalla presenza di patogeni enterici quali, ad esempio, Giardia intestinalis e Cryptosporidium parvum , più resistenti di E. coli e degli enterococchi alla disinfezione. In questi casi è stato ipotizzato, anche sulla base di evidenze sperimentali che dimostrano l’esistenza di correlazioni statisticamente signi cative tra le concentrazioni dei protozoi e quelle delle spore di Clostridium perfringens, che quest’ultime possano indicare la presenza di tali agenti patogeni proprio per la loro maggiore resistenza nell’ambiente [13]. Nel DL.vo 31/01 la ricerca delle spore di Clostridium perfringens è inserita tra i parametri da ricercare nei controlli di routine per la valutazione delle acque destinate al consumo umano, qualora le acque provengano o siano in uenzate da acque super ciali; nel caso in cui tali acque risultino positive per la presenza Clostridium perfringens (spore comprese) l’autorità sanitaria deve accertarsi che non sussistano potenziali pericoli dovuti alla presenza di microrganismi patogeni quali ad esempio Cryptosporidium. Indicatori di contaminazione microbica e DL.vo n. 152/ Le normative sulle acque antecedenti al DL.vo n. 152/99 ssavano limiti di concentrazione degli indicatori microbiologici per le acque adibite ad una particolare destinazione d’uso (potabile, ricreazionale) e il tipo di informazione dedotta, anche se permetteva di evidenziare eventuali episodi di contaminazione, era sempre puntiforme, ovvero non integrata con le informazioni derivanti dagli altri parametri che caratterizzano uno speci co scenario ambientale. L’aspetto nuovo del DL.vo n. 152/99, che ri ette la linea su cui è stata formulata la Direttiva Quadro sulle Acque, è che la valutazione della qualità ambientale ed ecologica si basa sull’acquisizione della conoscenza di tutti i fattori che possono in uenzare le condizioni ambientali. Attraverso l’integrazione delle informazioni analitiche con la valutazione e l’interpretazione di nuovi elementi e di caratteristiche territoriali è possibile effettuare previsioni di rischio per la salute ed elaborare programmi di tutela e risanamento ambientale. Nell’allegato 1 del DL.vo n. 152/99 il cui contenuto è ribadito nell’allegato 1 del DL.vo n. 258/00, contenente disposizioni correttive ed integrative del DL.vo n. 152/99, sono stabiliti i criteri per il monitoraggio e la classi cazione delle acque in funzione degli obiettivi di qualità ambientale. La classi cazione distingue le acque super ciali (al punto 3), in corsi d’acqua, laghi, acque marine costiere, acque di transizione e corpi idrici super ciali. Relativamente ai corsi d’acqua è prevista la ricerca di alcuni parametri di base sulla matrice acquosa; si tratta di parametri chimici, chimico- sici e microbiologici, che meglio ri ettono le pressioni antropiche, alcuni dei quali sono de niti macrodescrittori e utilizzati nella classi cazione. Sul biota è prevista, come analisi di base, la determinazione dell’Indice Biotico Esteso (IBE) per valutare gli impatti antropici sulle comunità animali. Le analisi di base possono essere integrate da analisi supplementari (saggi biologici sui sedimenti e saggi biologici sul biota nalizzati all’evidenziazione di effetti a breve e a lungo termine). Escherichia coli è l’unico parametro microbiologico che gura tra i parametri di base da ricercare nella matrice acqua per la classi cazione dei corsi d’acqua. La tabella 7 dell’allegato 1 del DL.vo n. 152/99, permette di valutare il livello di inquinamento espresso dai macrodescrittori, calcolato integrando le informazioni provenienti dai parametri chimici e microbiologici. Incrociando il dato risultante dai macrodescrittori con il risultato dell’IBE è possibile attribuire classi di stato ecologico dei corsi d’acqua. Relativamente ai sedimenti le cui analisi sono supplementari non è prevista la ricerca di parametri microbiologici. Relativamente ai laghi, le determinazioni necessarie per la classi cazione prevedono, come per i corsi d’acqua, analisi di base e analisi supplementari, ma i parametri di base sono solo chimico- sici. Per le acque marine costiere, tra i parametri di base, da ricercarsi sulla matrice acqua, è previsto il rilevamento degli enterococchi. Pur tuttavia, al momento non esiste ancora un approccio integrato per la valutazione dello stato di qualità degli ambienti marini costieri che tenga conto di tutti i parametri di base e delle determinazioni eseguite sul biota e sui sedimenti. Per una prima classi cazione ci si basa pertanto sul calcolo dell’indice tro co e i risultati che derivano dall’applicazione

INDICATORI MICROBIOLOGICI E QUALITÀ DELLE ACQUE SUPERFICIALI^357 Tabella 1. - Caratteristiche di qualità per acque superficiali destinate alla produzione di acqua potabile. Parametri microbiologici (da DL.vo n. 258/00, allegato 2, tabella A1) [8] Parametro Unità di misura A1 A2 A Coliformi totali MPN-UFC/100 ml 0 5000 50 000 Coliformi fecali (^) MPN-UFC/100 ml 20 2000 20 000 Streptococchi fecali MPN-UFC/100 ml 20 1000 10 000 Salmonella P/A Assenza in 5000 ml Assenza in 1000 ml Categoria A1: trattamento fisico semplice e disinfezione. Categoria A2: trattamento fisico e chimico normale e disinfezione. Categoria A3: trattamento fisico e chimico spinto, affinazione e disinfezione. MPN: numero più probabile; UFC: unità formante colonia; P: presenza; A: assenza. dell’indice di trofìa determinano l’attribuzione delle acque marine costiere ad un particolare stato ambientale (elevato, buono, mediocre, scadente). Le determinazioni da eseguire sul biota prevedono analisi di accumulo di metalli pesanti e di composti organici nei mitili (idrocarburi policiclici aromatici e composti organoclorurati). Le Regioni possono inoltre integrare eventualmente i parametri in funzione dell’esigenza di approfondire le conoscenze su speci che situazioni locali. Sui sedimenti sono previste analisi di base (analisi granulometrica, idrocarburi policiclici aromatici, metalli pesanti bioaccumulabili) ed analisi addizionali (saggi biologici per evidenziare effetti a breve e a lungo termine). Relativamente ai parametri addizionali da ricercarsi sui sedimenti, da tempo si discute sull’esigenza di integrare le determinazioni analitiche richieste e previste nel DL.vo n. 152/99, per la valutazione della qualità degli ambienti marino-costieri, con il rilevamento di un idoneo indicatore microbiologico di contaminazione fecale. In questo caso il rilevamento dei coliformi e degli streptococchi avrebbe scarsa validità a causa del loro rapido decadimento in un ambiente ostile come quello marino; le spore dei clostridi sol to-riduttori, invece, resistendo alle condizioni avverse del mezzo, sopravvivono a lungo nell’ambiente e, avendo rispetto ai coliformi il vantaggio di non riprodursi nei sedimenti marini, sono additate come il parametro indicatore che meglio ottempera ai requisiti richiesti [14]. Nell’allegato 2 del DL.vo n. 152/99, il cui contenuto è ribadito nell’allegato 2 del DL.vo n. 258/00, sono stabiliti i criteri per la classi cazione dei corpi idrici a speci ca destinazione funzionale. In particolare nella sezione A sono ssati i criteri generali e le metodologie per il rilevamento delle caratteristiche qualitative e per la classi cazione delle acque super ciali destinate alla produzione di acqua potabile. I parametri microbiologici previsti (tabella 1A dell’allegato 2) sono i coliformi totali, i coliformi fecali, gli streptococchi fecali e Salmonella. Per la classi cazione delle acque vengono individuate tre diverse categorie (A1, A2, A3), in funzione del tipo di trattamento necessario per ottemperare ai requisiti di potabilità, e per ogni categoria sono individuati dei valori limite per i singoli parametri microbiologici (Tab. 1). Nell’allegato 5 del DL.vo n. 152/99, il cui contenuto è ribadito dall’allegato 5 del DL.vo n. 258/00, sono ssati i limiti di emissione degli scarichi idrici (acque re ue urbane e acque re ue industriali) in corpi d’acqua super ciali e sul suolo. Per quanto riguarda gli scarichi degli impianti di trattamento delle acque re ue urbane e gli scarichi industriali in acque super ciali e in fognatura, tra i vari parametri è prevista la ricerca di E. coli (tabella 3 dell’allegato 5). Per gli scarichi degli impianti di trattamento delle acque re ue urbane, i limiti di concentrazione di E. coli devono essere ssati all’atto dell’approvazione dell’impianto di trattamento delle acque re ue urbane dall’autorità competente, in relazione alla situazione ambientale e igienico-sanitaria del corpo recettore e in base agli usi esistenti. È tuttavia consigliato un limite non superiore a 5000 UFC/100 ml. Nella tabella 4 dello stesso allegato sono invece ssati i limiti di emissione per le acque re ue urbane ed industriali che recapitano sul suolo. Anche in questo caso è prevista la ricerca di E. coli come indicatore di contaminazione fecale delle acque ed i limiti, come per le emissioni in corpi idrici super ciali e in fognatura, sono stabiliti caso per caso. L’articolo 26 del DL.vo n. 152/99 stabilisce che le acque re ue siano riutilizzate e rimanda la de nizione delle norme tecniche e dei requisiti minimi di qualità per il loro riutilizzo ad un decreto (n. 185/03) [15] che il Ministero dell’Ambiente e della Tutela del Territorio ha elaborato di concerto con altri ministeri, tra cui quello della Salute. Attraverso la regolamentazione delle destinazioni d’uso e stabilendo i requisiti minimi di qualità, il decreto n. 185/03 norma il riuso di acque re ue domestiche, urbane ed industriali. Nella tabella

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