Estrazione del DNA, Barcoding, Elettroforesi e PCR: Tecniche Biotecnologiche, Slide di Biologia, microbiologia e tecnologie di controllo ambientale

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Dall’estrazione del DNA alle biotecnologie

nello studio del barcoding: elettroforesi e

PCR

Dall’estrazione del DNA alle biotecnologie

nello studio del barcoding: elettroforesi e

PCR

PCTO

Estrazione del DNAEstrazione del DNA

• (^) Il materiale contenente le informazioni che si trasmettono da una generazione all’altra è costituito, in tutti gli organismi viventi, dagli acidi nucleici denominati DNA ( acido desossiribonucleico ) RNA ribonucleico ( acido ribonucleico ).
• (^) Nella maggior parte dei casi è il DNA a rappresentare l’impronta genetica che identifica ciascuna persona e solo in alcuni organismi, per esempio certi virus, le informazioni sono contenute nell'RNA.
• (^) Il DNA contiene le informazioni necessarie per la produzione delle proteine, molecole formate dagli aminoacidi, che costituiscono tutti gli organismi.

Estrazione del DNAEstrazione del DNA

• (^) La struttura della doppia elica fu scoperta nel 1953 da Francis Crick e James Watson che riceveranno il premio Nobel nel 1962.
• (^) La struttura tridimensionale del DNA è formata da due eliche avvolte una sull'altra: l’esterno della struttura è costituito da zuccheri e fosfati, mentre le basi appaiate (l'adenina con la timina e la guanina con la citosina) sono collocate all'interno. Questa struttura fu scoperta nel 1953 da Francis Crick e James Watson che riceveranno il premio Nobel nel 1962.

Estrazione del DNAEstrazione del DNA

• (^) Un gruppo “fosfato-zucchero-base azotata” costituisce un nucleotide. I nucleotidi sono legati gli uni agli altri per formare una catena di DNA. Il DNA è dunque un polimero che forma una molecola di DNA bicatenario.
• (^) Questa molecola è simile a una scala a pioli nella quale i gruppi fosfato-ribosio costituiscono i pioli e le basi azotate i supporti laterali. Le due catene del DNA in questa scala a pioli sono in orientazioni opposte (antiparallele). Questa scala è ritorta, dando la famosa forma a doppia elica del DNA bicatenario.

Estrazione del DNA: l’esperienzaEstrazione del DNA: l’esperienza

• (^) Esistono numerosi protocolli per estrarre il DNA da diversi organismi. Io ne presento uno che riguarda l’estrazione dl DNA da una banana.
• (^) Queste esperienze non hanno bisogno di nessun apparecchio particolare e possono essere eseguite grazie a prodotti acquistati nei grandi magazzini.
• (^) Da notare che il DNA ottenuto non è di eccellente qualità. Esso non permetterebbe di eseguire delle esperienze precise di biologia molecolare.
• (^) Il DNA così purificato è, in effetti, ancora contaminato da altre molecole (come le proteine) ed è probabilmente parzialmente degradato dalle nucleasi. Tuttavia, questo protocollo permette di visualizzare facilmente il proprio DNA e di apprezzarne l’aspetto filamentoso.

Estrazione del DNA: l’esperienzaEstrazione del DNA: l’esperienza

Per effettuare l’esperimento occorrerà:

• (^) banana
• (^) cloruro di sodio (sale da cucina)
• (^) detersivo per piatti
• (^) acqua distillata
• (^) succo d’ananas (facoltativo)
• (^) alcol etilico
• (^) un colino
• (^) un becher,o semplicemente un piatto, e
• (^) una forchetta
• (^) siringa graduato
• (^) una provetta o un piccolo recipiente trasparente
• (^) guanti

ELIMINAZIONE DEI RESIDUI.

• (^) con un colino filtrare la soluzione in modo da separare l’acido nucleico dai residui cellulari
• (^) prelevare 5 ml di filtrato ricco di DNA tramite la siringa graduata
• PRECIPITAZIONE DEL DNA
• (^) con un colino filtrare la soluzione in modo da separare l’acido nucleico dai residui cellulari
• (^) prelevare 5 ml di filtrato ricco di DNA tramite la siringa graduata ed inserirlo in una provetta o piccolo recipiente trasparente
• (^) aggiungere alla provetta 3 mi di succo d’ananas in modo da rendere l’ambiente acido ed eliminare le proteine grazie alla bromelina presente nel succo d’ananas
• VISUALIZZAZIONE DEL DNA
• (^) prelevare 6 ml di alcol etilico con la siringa graduata e si versano lungo le pareti della provetta; solo cos’ avverrà la separazione del DNA dal resto della soluzione
• (^) essendo il DNA insolubile nell’acqua si verificherà una stratificazione con al centro il DNA separato dall’alcol e dalla soluzione che si è preparata prima

Estrazione del DNA: l’esperienzaEstrazione del DNA: l’esperienza

Esperimento fatto da me

DNA barcoding: un codice a barre per ogni

specie vivente

DNA barcoding: un codice a barre per ogni

specie vivente

• (^) La procedura di DNA barcoding è basata su un protocollo internazionale, rilasciato dal CBOL (Consortium for the Barcode of Life), organo nato nel 2004 che gestisce gli studi in questo ambito a livello mondiale.
• (^) La prima fase della procedura consiste nella collezione e conservazione di campioni: gli animali devono essere uccisi e conservati in modo da non danneggiarne il DNA, ad esempio attraverso il congelamento, l’immersione in etanolo o la disidratazione.
• (^) Durante il campionamento e la manipolazione dei tessuti, la superficie di lavoro e tutti gli strumenti utilizzati devono essere puliti e sterilizzati
• (^) I campioni vengono utilizzati per l’isolamento e purificazione del DNA
• (^) In seguito all’estrazione del DNA, si procede con l’amplificazione della regione barcode (PCR), e poi con il lavaggio dei prodotti della PCR da nucleotidi non incorporati e primers residui.

DNA barcoding: un codice a barre per ogni specie viventeDNA barcoding: un codice a barre per ogni specie vivente

• (^) Si attua quindi l’analisi delle sequenze e si inseriscono i risultati nel database di sequenze internazionale, il BOLD (Barcode of Life Data Systems), piattaforma informatica che permette ai ricercatori di visualizzare, interpretare, condividere risultati.
• (^) Il BOLD riporta una statistica delle sequenze, continuamente aggiornata, che al momento indica 5˙289˙482 sequenze barcode, su un numero totale di 6˙115˙862 sequenze; le specie “barcodate” sino ad oggi sono 175˙423 per gli animali, 65˙602 per le piante, 20˙808 per i funghi e altre forme viventi.

PCRPCR

Il termine PCR è un acronimo di p olymerase chain reaction e descrive un protocollo per l'amplificazione, in laboratorio, di un frammento di DNA. La PCR è una tecnica di grande importanza in ogni ambito scientifico: si utilizzano le PCR per esperimenti zoologici, biologici, diagnostici, legali e per altri campi ancora. La PCR è condotta in dei piccoli pozzetti inseriti in un macchinario chiamato termociclatore. Schema esemplificativo della PCR

PCRPCR

• (^) Il primo passo per l'amplificazione di un segmento di DNA è quello di rompere la doppia elica. Per questa ragione, il macchinario provvede all'aumento della temperatura all'interno del pozzetto fino al raggiungimento di circa 94-96°C per 15 secondi.
• (^) Dopo il disappaiamento del DNA si inseriscono i primer, in altre parole molecole di DNA complementari, che si appaieranno alle doppie eliche in specifiche regioni. A questo punto, è chiaro che se i primer sono specifici per una sequenza e questa manca nel DNA l'esito della PCR sarà negativo. I primer non sono casuali ma vengono scelti in base alla zona del DNA che si intende amplificare.

Fasi e resa della PCRFasi e resa della PCR

• (^) La resa di una generica reazione PCR può essere schematizzata in un grafico che tiene conto della concentrazione del DNA (in valore logaritmico) rispetto al numero dei cicli.
• (^) La prima fase è definita fase geometrica e rappresenta tutti gli eventi che seguono i primi cicli di appaiamento ed estensione nella PCR. La seconda fase è definita lineare , poiché procede con un andamento lineare (se osservato in scala logaritmica). L'ultima fase prende il nome di plateau poiché si assiste all'assestamento del sistema e al blocco dell'allungamento e della "duplicazione" del DNA. Fasi della PCR

Elettroforesi su gel di saccarosioElettroforesi su gel di saccarosio

• (^) L’elettroforesi è una tecnica che utilizza un campo elettrico per separare e visualizzare frammenti di DNA in base al loro peso molecolare ed alla loro carica. Gli acidi nucleici, migrano sempre verso il polo positivo per la presenza, nella loro molecola, della carica negativa data dai gruppi fosfato.
• (^) Il supporto utilizzato per eseguire l’elettroforesi è il gel, che si ottiene dalla fusione e successiva gelificazione di una soluzione contenente agarosio e, come solvente ,TAE ( T sta per Tris/HCl, che consente il mantenimento di un valore costante di pH della soluzione; E sta per EDTA, che chela i cationi bivalenti, come il magnesio: questo è importante, perché la maggior parte delle nucleasi richiede cationi bivalenti per funzionare). Frammenti Di DNA separati tramite elettroforesi su gel, colorati con etidio bromuro ed esposti a luce ultravioletta