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EPIDEMIOLOGIA
Lo studio delle malattie può avvenire in ambiti differenti: -A livello molecolare (biologia molecolare, biochimica e immunologia) -A livello tissutale (ossia dei tessuti) e degli organi (es. anatomia patologica) -A livello del singolo individuo (clinica medica)
- A livello della popolazione ( EPIDEMIOLOGIA ) Per popolazione si intende un insieme di unità (individui) con uno o più attributi in comune (es. sono presenti nella stessa area geografica, oppure hanno la stessa età, oppure hanno la stessa alimentazione, ecc.). L’epidemiologia si occupa di tutte le malattie esclusivamente a livello di popolazione piuttosto che di individuo, infatti una situazione patologica NON è prodotta da una sola causa. Spesso la malattia è l’evento conseguente a interazioni complesse di fattori esterni o interni all'organismo. Tali fattori agiscono contemporaneamente o in successione sull'organismo e tali malattie sono dette "multifattoriali" o "ad eziologia multifattoriale". Tutti i fattori che sono in grado di influenzare la comparsa o l'andamento di una malattia, non potendo essere ritenuti «causa» di malattia in senso stretto, vengono detti DETERMINANTI. Anche se nella realtà è molto difficile differenziare l’apporto dei singoli determinanti , sono state proposte due diversificazioni in determinanti primari e secondari. I determinanti primari sono fattori la cui variazione esercita un effetto maggiore nella genesi della malattia, quindi sono di importanza fondamentale per la comparsa della malattia. A volte i determinanti primari risultano anche fattori indispensabili per la comparsa della malattia. I determinanti secondari vengono anche definiti fattori favorenti o predisponenti , tuttavia, questi fattori esercitano un effetto minore nella genesi della malattia e, pertanto, non sono indispensabili né fondamentali. La quantificazione delle malattie o di fenomeni a esse correlati rappresenta una attività fondamentale in epidemiologia. Per ottenere dei dati utilizzabili e interpretabili, dobbiamo esprimere i risultati delle nostre misure sotto forma di « proporzioni » o « rapporti », o « tassi ». I «tassi» sono misure dinamiche, che rappresentano la variazione di una quantità per la variazione unitaria di un'altra quantità (generalmente il tempo). Parlando in generale, le misure di frequenza delle malattie possono descrivere: l'insieme di tutti i casi esistenti in un determinato momento e in una determinata popolazione; il verificarsi di nuovi casi. A questo scopo si usano quindi due misure fondamentali: la prevalenza e l' incidenza. Queste due misure sono molto diverse fra loro: la prevalenza sono gli individui che presentano la malattia, mentre l'incidenza sono i nuovi individui che presentano la malattia nel tempo (periodo). Postulati di Koch I postulati sono i seguenti:
- il presunto agente responsabile della malattia in esame deve essere presente in tutti i casi riscontrati di quella malattia.
- deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in coltura pura
- ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite sano (ma suscettibile alla malattia), si riproduce la malattia
- il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato sperimentalmente Se positivi, abbiamo la prova della patogenicità del microrganismo e della sua influenza in un determinato quadro patologico. Questi postulati, per quanto estremamente potenti, hanno evidenti dei limiti sperimentali:
- Alcuni microrganismi commensali o normalmente presenti nell'ambiente danno patologia solo in determinati soggetti o situazioni
- Spesso l'inoculazione, invece di portare a una patologia conclamata, provoca danni subclinici.
- Alcuni microrganismi (ad esempio il Mycobacterium leprae) non sono coltivabili in vitro o non è possibile trovare un animale adatto all'inoculazione (perché il patogeno ha tropismo unico per l'uomo o perché gli altri animali sviluppano una diversa patologia rispetto all'uomo) Allo stato delle attuale conoscenze della biologia i postulati di Koch dovrebbero essere rivisti in quanto non tengono conto della possibilità di una eziologia multipla (una malattia, molte cause - o meglio «determinanti») né l'eventualità che una stessa causa possa indurre malattie differenti. Patogenicità e risposta immunitaria Quando un parassita microbico cresce e si riproduce sopra o all’interno di un ospite causando una alterazione delle normali condizioni organiche dell’ospite, si ha una infezione. Il microrganismo che causa infezione è definito patogeno e la sua capacità di indurre la malattia è definita patogenicità. L’esito delle infezioni dipende da tre fattori: il numero dei microrganismi presenti sopra o all’interno dell’ospite; la virulenza del microrganismo; le difese e il grado di resistenza dell’ospite. La virulenza è il grado o l’intensità della patogenicità di un microrganismo, viene misurata sperimentalmente determinando la dose letale o dose infettante. La dose letale e dose infettante sono due indicatori che fanno riferimento alla dose o al numero microrganismi patogeni in grado, rispettivamente, di uccidere o infettare il 50% di un gruppo di animali da esperimento in un definito periodo di tempo. Si valuta essenzialmente sulla base di due caratteristiche del patogeno presenti insieme o
separatamente: Invasività : capacità di invadere (penetrare) organi e tessuti dell’ospite; tossigenicità : capacità del patogeno di produrre tossine. FATTORI DETERMINANTI UNA MALATTIA INFETTIVA: Penetrazione (invasività) è una strategia specializzata utilizzata da molti patogeni per sopravvivere e riprodursi. Spesso i microrganismi penetrano attivamente nell’epitelio dell’ospite in seguito a adesione grazie alla produzione di sostanze litiche in grado di alterare i tessuti dell’ospite. La lisi avviene secondo tre modalità: -attaccando la sostanza fondamentale e le membrane basali dei tegumenti e rivestimenti intestinali. -degradando i complessi carboidrato-proteina negli spazi intercellulari o sulla superficie cellulare (glicocalice). -disgregando la superficie cellulare. Crescita e moltiplicazione del patogeno: un ambiente favorevole (nutrienti, potenziale redox, pH, temperatura) permette al patogeno di crescere: in cellule specifiche, nel sangue (setticemie). Le tossine batteriche si dividono in: esotossine ed endotossine Esotossine : sono proteine solubili, termolabili, non causano febbre, immunogene e letali che vengono liberate dal patogeno in fase di crescita. In base al loro meccanismo d’azione e al sito di localizzazione si distinguono in: Citotossine (tessuti in generali); Enterotossine (mucosa intestinale);Neurotossine (tessuto nervoso). Endotossine : la maggior parte dei batteri gram-negativi possiede sulla membrana esterna della parete cellulare un lipopolisaccaride ( LPS ) che in particolari condizioni risulta tossico per specifici ospiti. L’attività endotossica dell’ LPS risiede nella porzione lipidica detta lipide A. MECCANISMI DI DIFESA SELL’OSPITE La capacità dell’ospite di opporre resistenza all’infezione dipende in larga parte dai meccanismi difensivi che esso adotta contro l’agente patogeno, questi meccanismi prendono il nome di meccanismi immunitari. Il sistema immunitario prevede meccanismi GENERALI ASPECIFICI e meccanismi SPECIFICI. Il sistema immunitario specifico assicura una protezione verso microrganismi, cellule neoplastiche e macromolecole estranee (proteine, polisaccaridi e alcuni glicolipidi) collettivamente chiamate ANTIGENI ( IMMUNOGENI ). I linfociti riconoscono l’ ANTIGENE e possono agire direttamente eliminandolo oppure producendo ANTICORPI. Gli ANTIGENI (ANTIBODY GENERATOR) sono in grado di evocare la risposta anticorpale. Gli anticorpi sono GLICOPROTEINE sintetizzate da CELLULE SPECIALIZZATE del nostro organismo ( PLASMACELLULE ). Gli ANTICORPI sono trasportati nel torrente sanguigno (sono solubili nel sangue). L’uomo è capace di sintetizzare oltre 10 milioni di ANTICORPI con SPECIFICITA’ diversa. SIEROTIPO Classificazione di una molecola o di un microrganismo in base al suo carattere antigene, quindi in base agli anticorpi di cui induce la produzione. La reazione Antigene-Anticorpo è altamente specifica, per cui si può riconoscere un antigene non noto in base alla sua capacità di reagire con un anticorpo noto (test immuno-chimici). Anticorpi specifici possono essere prodotti in maniera naturale immunizzando gli animali (inoculo dell’animale con l’antigene). Poi il siero o antisiero (contenente anticorpi) dell’animale viene estratto e testato mettendolo a contatto in una provetta con l’antigene e si verifica se avviene reazione (precipitazione del complesso antig.-antic.), da qui la produzione di vaccini. Su questo principio si basano molto test immunologici (es. ELISA). Microrganismi responsabili di Infezioni e Intossicazioni Alimentari INFEZIONI E INTOSSSICAZIONI A seconda della patogenicità dei batteri patogeni risulta possibile distinguere tre tipi di patologie alimentari:
- L’infezione alimentare avviene quando i batteri patogeni vivi in un alimento vengono ingeriti e riescono a colonizzare il tratto gastrointestinale e invadere i tessuti dell’organismo (intestinale), questa azione viene detta invasività. In alcuni casi all’invasività si associa anche la produzione di esotossine. Un esempio di infezione è quella causata da salmonella.
- L’intossicazione alimentare avviene quando i batteri patogeni producono esotossine nell’alimento (tossine preformate nell’alimento) che vengono ingerite con l’alimento e causano la patologia; pertanto non è necessario ingerire il microrganismo vitale ma con l’intossicazione noi abbiamo ingerito le esotossine dell’alimento. In questo caso si parla di tossigenicità. Un esempio di intossicazione alimentare è quella causata quando si ingerisce tossine botuliniche.
- Un altro meccanismo è la tossinfezione alimentare che avviene quando i batteri patogeni possono agire con entrambi i meccanismi descritti (invasività, tossigenicità). Un esempio di tossinfezione è quella causata da Bacillus Cereus. Enterobacteriaceae Gli Enterobacteriaceae sono una famiglia di batteri gram-negativi non sporigeni che sono anaerobi facoltativi ad eccezione di alcuni ceppi. Questa famiglia di batteri sono generalmente mobili grazie alla presenza di flagelli peritrichi come ad esempio salmonella. Un tratto comune degli Enterobacteriaceae che ci aiuta a differenziargli da altri batteri è la mancanza della citocromo-c ossidasi, sebbene ci siano delle eccezioni. Le Enterobacteriaceae sono batteri catalasi positivi ad eccezione di alcuni ceppi come Shigella; le Enterobacteriaceae fermentano un amplia gamma di carboidrati ma la loro abilità di produrre
importante fattore di virulenza rappresentato da citotossine (verocitotossine) che inibiscono la traduzione delle cellule eucariotiche. Le verocitotossine vengono prodotte e liberate nel circolo sanguigno fino a raggiungere gli endoteli di intestino e reni. Per prevenire infezioni di ceppi enteroemorragici di E.coli è necessario trattare in modo adeguato gli alimenti da processare (effettuare la cottura perché inattivi questi microorganismi). II). Il capostipite del gruppo EHEC è il ceppo O157:H (per la presenza dell’antigene somatico O157 e quello flagellare H7), il più conosciuto e pericoloso. E. coli O157:H7 presenta la dose infettante più bassa tra i patogeni alimentari: in alcuni episodi è stato stimato che circa 10 cellule batteriche abbiano causato patologia, la sintomatologia esordisce con forti crampi addominali e diarrea talvolta emorragica, comparsa di vomito, la febbre è generalmente bassa o assente. A livello alimentare è importante tenere presente che E. coli O157:H7 moltiplica a temperature comprese tra i 10 °C ed i 43 °C e tollera ambienti acidi , infatti è in grado di sopravvivere a pH inferiori a 2,5 per più di 2 ore. E. coli O157:H7 è stato isolato anche da insaccati a media stagionatura (pH 4,5) risultando quindi capace di sopravvivere a processi di fermentazione, asciugatura e stoccaggio. Inoltre, E. coli O157:H7 può sopravvivere per alcune settimane a temperature di refrigerazione nella maionese (pH 3,6 3,9), e di conseguenza in prodotti a base di carne e maionese, nello yogurt e nel succo di mela non pasteurizzato (pH 3,6 4,0), quest’ultimo spesso incriminato come veicolo di queste infezioni alimentari. L’essiccamento ed il congelamento o surgelamento non sembrano essere dei processi limitanti la sopravvivenza di questi ceppi.
- EAEC (enteroaggreganti): associati a casi sporadici di diarrea, hanno capacità di formare aggregati e biofilm sugli enterociti e questa capacità viene definita aderenza aggregativa ed è resa possibile grazie alla presenza di fimbrie e fattori di aderenza di codifica plasmidiale. In definitiva, parlando di E.coli è importante ricordare che tutti i ceppi patogeni di E.coli sono sensibili al calore, pertanto i cibi trattati con il calore possono essere considerati sicuri! Salmonella : Caratteristiche e tassonomia Salmonella è uno dei più importanti patogeni di origine alimentare in tutto il mondo; i sierotipi ospite specifici sono gli agenti causali della febbre enterica nell’uomo. Esso è un batterio enterico appartenente ad un gruppo che incorpora bacilli gram- negativi, facoltativamente anaerobi a forma di bastoncello, classificati come membri della famiglia delle Enterobacteriaceae. La maggior parte dei sierotipi di salmonella cresce ad un intervallo di temperatura compreso fra 5 e 47 °C con un optimum a 35-37 °C, tali microorganismi sono sensibili al calore e di solito vengono inattivati a temperature superiori a 70 °C. Salmonella si sviluppa in un range di pH compreso fra 4 e 9 con un optimum tra 6,5 e 7,5; per moltiplicarsi richiede un alta attività dell’acqua (aw), generalmente compresa fra 0,94 e 0,99 sebbene possa sopravvive senza moltiplicarsi a valori di aw fino a 0,2. La completa inibizione della crescita si ha a temperature inferiori 7°C, pH < 3,8 o attività dell'acqua < 0,94. Salmonella possiede tre antigeni principali: Antigene flagellare H, Antigene somatico O e Antigene Vi (virulenza). L’ antigene flagellare H è di natura proteica e viene distrutto dal calore, può manifestarsi in due forme chiamate fase 1 e fase 2 e salmonella è in grado di passare alternativamente da una fase all’altra. Gli antigeni O sono localizzati sulla superficie della membrana esterna e sono caratterizzati da sequenze specifiche di zuccheri, la diversità degli antigeni somatici dipende dal differente posizionamento degli oligosaccaridi nelle catene. Alcune salmonelle presentano un terzo gruppo di antigeni i Vi e gli ospiti che lo possiedono sono più virulenti ad esempio salmonella typhi e salmonella paratyphi; l’antigene Vi che corrisponde agli antigeni K (capsulari) degli altri enterobatteri ha anche la caratteristica di mascherare gli antigeni O. Come con altri bacilli gram-negativi la membrana cellulare esterna di salmonella presenta una struttura lipopolisaccaridica con proprietà endotossiche; questa struttura è composta da tre componenti: uno strato esterno di polisaccaride O, una porzione centrale cioè il nucleo R e un rivestimento interno di lipide A. Lo strato esterno O varia sia nella struttura che nella composizione conferendo identità biologica ai singoli ceppi, ovvero la distinzione di sierotipi all’interno delle specie di salmonella. Il nucleo R ha una struttura comune con un amplia varietà di batteri gram-negativi e gli anticorpi diretti contro il nucleo R possono essere in grado di proteggere dalle infezioni. L’attuale nomenclatura prevede che il genere salmonella contenga 2 specie ognuna delle quali contiene diversi sierotipi: salmonella enterica divisa in sei sottospecie a cui si fa riferimento con un numero romano e un nome e sono differenziate sulla base di prove biochimiche e in base a correlazioni genomiche (la maggior parte di sierotipi di salmonella è classificata come appartenente a salmonella enterica sottospecie enterica); salmonella bongori che non ha sottospecie. In base al livello di adattamento all’ospite i sierotipi di salmonella possono essere classificati come: sierotipi ospite specifici che sono in grado di causare la malattia in una singola specie ospite (es: Salmonella Typhi); sierotipi adattati all'ospite che sono associati ad una specie ospite ma sono anche in grado di causare la malattia in altri ospiti (Es: Salmonella Choleraesuis); sierotipi ubiquitari che raramente producono infezioni sistemiche ma sono in grado di colonizzare il tratto alimentare di una vasta gamma di animali e sono gli agenti eziologici della salmonellosi di origine alimentare nel uomo e sono anche chiamate salmonelle minori (Es: Salmonella Typhimurium e Salmonella Enteritidis). La nomenclatura di salmonella è complessa infatti si usano modi diversi per riferirsi a questo genere con la combinazione di diversi generi nomeclaturali ma ciò può causare confusione. Salmonella : Patologia Le salmonelle rappresentano uno dei più comuni agenti eziologici di enteriti a trasmissione orofecale, la malattie viene detta salmonellosi. Il processo patogenetico ha inizio subito dopo l’ingestione quando le salmonelle raggiungono il lume intestinale e si replicano, aderiscono agli enterociti e invadono la mucosa. Successivamente penetrano nelle cellule e vengono inglobate nei fagosomi; senza subire alterazione vanno a localizzarsi sulla lamina propria dell’intestino e a livello di questa si replicano
rapidamente provocando un processo infiammatorio con congestione. In questa prima fase, nella dorma non sistemica, la liberazione di lipopolisaccaride batterico provoca febbre vomito e dolori addominali e dopo 10-20 ore inizia la diarrea determinata sia dalla degenerazione e dal distacco degli enterociti che dalla loro sofferenza funzionale. Le forme sistemiche di salmonellosi che possono presentarsi con batteriemie, setticemie e infezioni localizzate si sviluppano soprattutto nei bambini e a pazienti immuno depressi come conseguenza di gastroenteriti acute. Il passaggio dalla semplice enterite ad una forma sistemica è dovuto alla resistenza della salmonella al processo fagocitario all’interno dei granulociti e dei monociti macrofagi, quindi in caso di resistenza i batteri possono passare ai linfonodi mesenterici inducendo semplici batteriemie sintomatiche o manifestazioni settiche con o senza localizzazioni metastatiche, la manifestazione di una forma sistemica dipende sia da fattori intrinseci del microorganismo e sia dalle capacità difensive dell’ospite; possiamo affermare che la patogenesi delle infezioni da salmonella è un fenomeno complesso e multifattoriale. Le salmonelle possiedono diversi fattori di virulenza necessari ad attuare tutte le varie fasi dell’infezione: sistemi di difesa per sopravvivere in ambienti a pH acido utili a superare la barriera gastrica; fattori che intervengono al momento della colonizzazione dell’intestino permettendo al batterio di aderire alla cellule del lume intestinale; fattori che consentono di attraversare l’epitelio intestinale al livello delle placche di Peyer o di sopravvivere nei macrofagi grazie agli enzimi PhoP e PhoQ; ognuno di questi fattori è codificato da geni strutturali, di modificazione e di regolazione. Esiste una correlazione tra l’azione patogena di salmonella e il suo corredo genetico, poiché solo i ceppi che possiedono determinati geni sono in grado di indurre la malattia. Le salmonelle sono in grado di elaborare una tossina termolabile di natura proteica capace di alterare la morfologia delle cellule epiteliali della mucosa intestinale e un lipopolisaccaride (LPS), costituente la membrana batterica e dotato di proprietà endotossiche e di resistenza alla lisi. Una volta ingerito il microrganismo lo sviluppo dell’infezione sintomatica dipende dal numero di batteri ingeriti, la dose minima infettante è di 10^2 e 10^3 cellule ma può variare nei diversi sierotipi e in dipendenza delle condizioni dell’ospite. Quando interagiscono con cellule in coltura le salmonelle producono un alterazione della membrana cellulare (ruffling) accompagnata da estesi riarrangiamenti dei filamenti di actina nelle zone adiacenti al sito di adesione del batterio alla membrana, che contribuisce all’internalizzazione del batterio. I geni necessari all’invasione tissutale fanno parte del complesso macromolecolare denominato Sistema di Secrezione di Tipo III o Type Three Secretion System (TTSS) con cui i batteri patogeni gram-negativi trasportano proteine effettrici dal citosol batterico nella cellula ospite. Le proteine effettrici agiscono sulla cellula ospite eucariotica alterandone la fisiologia e permettendo la sopravvivenza del batterio nei tessuti invasi. È stato dimostrato che le salmonelle possiedono due sistemi di TTSS (TTSS1 e TTSS2), i geni che codificano per le proteine coinvolte nella formazione dei sistemi TTSS sono localizzati in due estese regioni di DNA cromosomale, note come “ Isole di Patogenicità ” e denominate rispettivamente SPI1 e SPI2. I due sistemi di secrezione hanno mostrato ruoli differenti durante il processo patogenetico, infatti SPI1 è il requisito fondamentale per l'invasività della mucosa intestinale; mentre SPI2 influenza la virulenza sistemica, favorisce la crescita intracellulare del microorganismo e la sua sopravvivenza nei macrofagi. Modello di patogenesi di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium: Le cellule di Salmonella attaccano l’epitelio intestinale attraverso adesine codificate dai geni delle isole di patogenicità SPI-3 and SPI-4. L’invasione batterica e l’ingresso del batterio sono mediati dai geni delle isole di patogenicità SPI-1 and SPI-5. In alternativa, le cellule batteriche possono anche essere direttamente internalizzate dalle cellule dendritiche della submucosa intestinale. Una volta internalizzata nel citoplasma, Salmonella si localizza in un vacuolo che la contiene (SCV) all’interno dei fagociti o all’interno della cellula ospite, dove replica. In questo caso i fattori codificati dai geni delle isole di patogenicità SPI-2 e il plasmide pSLT sono essenziali per la sua sopravvivenza (resistenza alla fagocitosi). Attraverso il meccanismo della transcitosi il patogeno riesce ad arrivare alla membrana basale dell’epitelio intestinale. I batteri sono internalizzati nei fagociti e di nuovo all’interno del vacuolo I fagociti così infettati possono trasportare il patogeno attraverso il sistema linfatico e sanguigno (vedi immagine slide). La capacità dei sierotipi tifoidi di iniziare e stabilire un infezione dipende dalla loro capacità di attraversare in modo efficiente la barriera epiteliale dell’intestino insieme ad una strategia efficace per non essere riconosciuti dal sistema immunitario. Al contrario, le salmonelle non tifoidi rimangono nella mucosa intestinale dove inducono una forte risposta immunitaria che innesca la secrezione di citochine pro-infiammatorie e chemochine, di conseguenza si verifica l’induzione di una risposta immunitaria che è cruciale per mantenere l’infezione localizzata nell’intestino che è utile all’ospite per limitare la replicazione e la diffusione degli agenti patogeni. Salmonella sfrutta ed elude l’immunità per promuovere la sua colonizzazione e replicazione nell’ospite attraverso diversi meccanismi; i macrofagi sono in grado di uccidere i batteri attraverso diversi meccanismi efficaci come l’acidificazione. Salmonella : Fonti di Contaminazione e Fattori di Rischio Anche se c’è stato un abbasso di salmonellosi negli ultimi anni in Europa, salmonella è ancora l’agente eziologico responsabile della maggior parte delle infezioni di origine alimentare nel mondo con il tipo Salmonella Enteritidis in cima. Nel ciclo epidemiologico di salmonella gli animali fungono da serbatoi di mantenimento e in base al tipo di animale c’è un tipo di sierotipo (ad Es: Salmonella Gallinarum nei polli). La trasmissione di salmonella all’uomo avviene tramite l’ingestione di alimenti di origine animale contaminati, mentre per quanto riguarda gli alimenti di origine vegetale non è chiaro come salmonella viene dispersa. L’ubiquitarietà e la capacità di crescita delle salmonelle a temperature comprese tra i 7°C e i 46°C fa sì che qualsiasi alimento manipolato o conservato in modo non corretto possa essere fonte di infezione, molti episodi sono causati dal tempo prolungato intercorso fra la preparazione e la cottura dell’alimento poiché si rende possibile la moltiplicazione dei batteri presenti con aumento della dose infettante. Hanno un ruolo importante anche gli operatori del settore alimentare perché una non corretta manipolazione di materie prime contaminate (es: carne, uova) può causare
appropriata misure logistiche e con il rispetto delle corrette misure igieniche come la pulizia e disinfezione dei camion. Deve essere evitato il mescolamento dei lotti di animali assicurando che il trasporto in condizioni poco stressanti sia eseguito secondo i principi dell’EFSA sul benessere degli animali durante il trasporto; poi bisogna evitare di mescolare gli animali a livello temporale e spaziale, ovvero separare animali sani da infetti. Nell’UE il regolamento 2073/2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari stabilisce limiti di carica per salmonella durante la shelf-life e durante il processo produttivo su carcasse post macellazione. Gli operatori del settore alimentare sono regolamentati dal regolamento 852/2004, a rispettare i requisiti generali sull’igiene alimentare attraverso l’implementazione del sistema HACCP, inoltre l’operatore del settore alimentare in seguito a modifiche del regolamento 2073/2004 deve rispettare i limiti imposti per i prodotti di origine animale. Gli interventi per ridurre il rischio di contaminazione devono essere effettuati lungo tutta la catena di produzione, infatti la presenza di animali infetti durante la macellazione influisce direttamente sul livello di contaminazione delle carcasse. Durante la macellazione bisogna eseguire tutte le misure atte a diminuire la contaminazione fecale che può risultare sulle carcasse, programmando la giornata lavorativa. È molto importante anche eliminare il patogeno durante le operazioni di disinfezione che vengono eseguite dopo la macellazione di un gruppo di animali e dopo il ciclo successivo. Il corretto rispetto delle temperature di refrigerazione delle carni dopo la macellazione risulta un parametro fondamentale per evitare la moltiplicazione del patogeno. Una ulteriore fonte di contaminazione è il personale che opera nella filiera alimentare e che dovrebbe essere posto a formazione per le normali pratiche igieniche, a tal proposito i punti chiave per alimenti sicuri sono elencati dal documento del WHO e sono: Abituatevi alla pulizia (soprattutto delle mani); Separate gli alimenti crudi da quelli cotti; Fate cuocere bene gli alimenti; Tenete gli alimenti alla giusta temperatura; Utilizzate solo acqua e materie prime sicure. Sempre nel documento WHO stipulato dall’OMS gli operatori che soffrono di febbre, diarrea, vomito o hanno lesioni cutanee evidenti devono informare immediatamente il datore di lavoro. Listeria monocytogenes : Caratteristiche e tassonomia Listeria monocytogenes sono bacilli gram-positivi, non-sporigeni, con dimensioni di 0.5–2.0 μm, anaerobi facoltativi in grado di produrre acidi organici dalla fermentazione del glucosio (lattato) ed è inattivato grazie alla pastorizzazione o cottura degli alimenti, la crescita ottimale è a 37°C e si sviluppa ad un ampio intervallo di temperatura che va da 0°C a 45-47°C. In quanto microrganismo psicrotrofico è in grado di svilupparsi a temperature di refrigerazione. Il patogeno può sopravvivere per lunghi periodi in alimenti surgelati ma i tassi di crescita risultano significativamente influenzati dal fatto che le temperature scendano al di sotto o al di sopra dei 10 °C. Listeria monocytogenes è estremamente resistente a NaCl in quanto mostra crescita in ambienti che presentano una concentrazione del 10% di questo sale e mostra una sopravvivenza a concentrazioni di NaCl fino al 20-30%. Listeria monocytogenes è frequentemente isolata da ambienti contenenti elevate quantità di sale come il salmone affumicato e può essere rilevato dopo 150 giorni in sale puro a 22°C. Questo batterio risponde ad una elevata osmolarità dell’ambiente attraverso l’accumulo intracellulare di soluti compatibili chiamati osmoliti; i soluti più efficaci contro lo stress osmotico sono betainato di glicina e la carnitina che agiscono nel citosol per controbilanciare l’osmolarità esterna impedendo la perdita di acqua nella cellula (plasmolisi) senza influenzare negativamente la struttura e le funzioni macromolecolari. Se le cellule di Listeria monocytogenes sono sottoposte a stress osmotico interrompono la maggior parte di attività metaboliche e applicano strategie adattive, in contemporanea vengono sintetizzate le proteine da shock osmotico che sono rapidamente sovraespresse. Questo batterio si sviluppa ad un amplia gamma di pH che vanno da 4,6 a 9,2 con un optimum compreso fra 6 e 8, l’inibizione della crescita da parte degli acidi dipende dal pH e dal tipo e concentrazione dell’acido stesso; i valori di attività dell’acqua che consentono lo sviluppo di Listeria monocytogenes dipendono anche dai saluti e da altre condizioni fisiche, i limiti inferiori tipicamente riportati sono compresi fra: 0,92-0,95. Il patogeno non risulta inibito in modo significativo dalla presenza di CO2 e può sopravvivere a molte tecniche di lavorazione degli alimenti come congelamento ed essiccazione. Sebbene l’applicazione di tecniche di conservazione come il packaging in atmosfera controllata estenda la shelf-life degli alimenti inibendo i batteri alterativi gram-negativi aerobi, lo sviluppo di Listeria monocytogenes può verificarsi senza segni di deterioramento e la conservazione in atmosfera controllata è efficace solo se associata ad una corretta refrigerazione al di sotto dei 4°C. Il genere Listeria è composto da 17 specie riconosciute, divise in 4 cladi: il primo clade include le specie definite L isteria sensustricto ( Listeria monocytogenes , L. marthii , L. innocua, L. welshimeri, L. seeligerie L. ivanovii ), nel second, terzo e quarto clade ci sono le altre specie. La maggior parte di questi microorganismi non codifica fattori di virulenza necessari a causare l’infezione e sono classificati come batteri non patogeni, ma gli unici patogeni sono quelli del clade 1 con Listeria monocytogenes che viene riconosciuto come il principale agente patogeno umano e l'unica specie considerata di importanza per la sanità pubblica. Listeria monocytogenes viene tipizzata sulla base del sierotipo identificato da variazioni sia negli acidi teicoici che negli antigeni flagellari; le analisi molecolari hanno identificato 4 lignaggi distinti (1,2,3 e 4) ma non c’è corrispondenza tra lignaggi e sierotipi in quanto i sierotipi sono raggruppati nello stesso lignaggio mentre altri sierotipi si trovano in differenti lignaggi; l’identificazione dei diversi sierotipi è importante quando si vuole risalire all’origine dell’infezioni. I diversi lignaggi sono stati isolati da diverse nicchie ecologiche facendo supporre sottili differenze nel loro comportamento biologico, la maggior parte degli isolati cinici di Listeria monocytogenes riferiti a malattie umane appartengono ai lignaggi 1 e 2 che comprendono i sierotipi 1/2° appartenenti al lignaggio 2 e i sierotipi 1/2b e 4b appartenenti al lignaggio 1; i ceppi del lignaggio 2 sono quelli che vengono più isolati dagli alimenti naturali e agricoli. Nessuno dei metodi attuali di tipizzazione può essere utilizzato per distinguere sierotipi avirulenti o meno virulenti quindi tutti i sierotipi di L. monocytogenes identificati negli alimenti devono essere considerati come un rischio per la salute umana. Listeria monocytogenes : Patologia
Listeria monocytogenes è un patogeno opportunista, presente nell’ambiente e responsabile della listeriosi. Questa malattia, seppur rara, può manifestarsi con un quadro clinico severo e tassi di mortalità elevati soprattutto nei soggetti sensibili come anziani, neonati, donne in gravidanza e immunocompromessi. La sintomatologia associata a Listeria monocytogenes è generalmente sovrapponibile in tutti gli ospiti sensibili e si manifesta con gastroenterite febbrile che può trasformarsi in setticemia o meningite con un elevata mortalità. La listeriosi può presentarsi come una infezione focale che colpisce il peritoneo, l’endocardio o gli occhi. L’incubazione della malattia va da 1 a 30 giorni, a causa dell’elevata mortalità (25% per pazienti sensibili) e dell’elevato tasso di ospedalizzazione circa del 97% dei pazienti, l’isolamento tempestivo e l’accurata identificazione del batterio nei casi sospetti sono fondamentali per identificare i focolai. Dato l’alto tasso di letalità, la listeriosi rappresenta la seconda causa di morte per infezioni alimentari dopo la salmonellosi. La sierotipizzazione differenzia i ceppi di Listeria in base all’immuno reattività delle strutture di superficie di due antigeni cellulari (antigene O e antigene H); sono identificati 12 sierotipi di Listeria monocytogenes tre dei quali 1/2, 1/2b e 4b sono causa del 95% di casi di questa malattia con il sierotipi 4b che è il più associato alle epidemie. Listeria monocytogenes è molto diffusa in natura poiché è parte della flora microbica intestinale di molti mammiferi e la trasmissione avviene principalmente attraverso il consumo di cibo contaminato. Ora vedremo il meccanismo di ingresso di Listeria monocytogenes nell’organismo umano: i batteri possono replicare negli epatociti dove restano localizzati, se invece l’organismo non riesce a controllare l’infezione questa può generalizzare e superare la barriera ematoencefalica. I meccanismi patogenici sono molto complessi e le proprietà patogeniche dei vari sierotipi sono multifattoriali, infatti nei processi infettivi possono essere convolte attività enzimatiche o metaboliche oppure possono essere coinvolte tossine lipolitiche, tossine emorragiche e vari componenti della parete e membrana cellulare. L’infezione inizia con l’ingestione di cibo contaminato e una volta nell’intestino il patogeno è in grado di invadere differenti regioni dell’epitelio intestinale penetrando i vili intestinali. Le cellule target sono quelle della punta dei villi dove le cellule in apoptosi sono estruse o anche le cellule laterali del villo che sono specializzate nella secrezione del muco intestinale. L’attraversamento della barriera intestinale inizia con l’interazione delle proteine batteriche (internaline) con la E-caderina che è un recettore umano specifico; dopo essersi legate queste proteine, le cellule del patogeno vengono internalizzate e per transcitosi raggiungono la lamina propria del villo intestinale e quindi il circolo sanguigno. La transcitosi è un processo cellulare attraverso il quale diverse macromolecole vengono trasportate da un lato e l’altro delle cellule attraverso il citoplasma della cellula stessa, il batterio, quindi, si diffonde raggiungendo fegato e reni. È anche possibile che il patogeno attraversi la barriera ematoencefalica e quindi la placenta; in questo caso il microrganismo raggiunto il trofoblasto si lega a 2 recettori di superfice la E-caderina e il C-Met attraverso due proteine di superfice dette internalina-A e internalina-B permettendo al patogeno di attraversare la barriera placentale e raggiungere il feto. Al livello degli organi Listeria monocytogenes ha l’abilità di alterare la fisiologia della cellula ospite prima di penetrarla, il patogeno inizia questo processo secernendo una tossina detta Listeriolisina- O (LLO). Questa tossina crea dei pori nella membrana della cella ospite attraverso i quali gli ioni possono entrare o uscire permettendo l’ingresso del batterio compromettendo alcuni processi interni della cellula così come alcuni organelli come i mitocondri che influenzati dalla fuoriuscita di ioni Ca+ iniziano a suddividersi con effetto positivo sul patogeno. L’alterazione del bilancio ionico influisce anche sul nucleo della cellula ospite e quindi sui meccanismi trascrizionali del DNA, in particolare il patogeno causa alterazione che interferiscono con l’espressione di geni per la risposta immunitaria. Il patogeno modifica anche la sua struttura esterna cosi da resistere alle difese interne della cellula ospite, quindi Listeria monocytogenes inizia a modificarsi all’interno della cellula ospite e a secernere fattori di virulenza che comprometteranno le funzioni cellulari. Il movimento dei batteri è mediato da una proteina batterica chiamata Act-A che è localizzata sulla superfice cellulare ad una estremità del batterio, ed è in grado di coordinare l’assemblaggio dell’actina che servirà a Listeria monocytogenes per essere spinta verso la membrana dell’ospite provocando la formazione di protuberanze allungate che spingono il batterio nella cellula adiacente. A risposta dell’attacco del patogeno le cellule del sistema immunitario in particolare i neutrofili sono in grado di distruggere le cellule infettate e il patogeno. Listeria monocytogenes : Fonti di Contaminazione e Fattori di Rischio Listeria monocytogenes può essere presente nel terreno nelle piante e nelle acque, anche gli animali possono essere portatori del batterio tanto è vero che la listeriosi si contrae con ingestione di alimenti contaminati. Gli alimenti pronti al consumo come pesce affumicato o affettati sono spesso all’origine dell’infezione da Listeria monocytogenes anche per via della durata di conservazione che favorisce la moltiplicazione batterica. Listeria monocytogenes può sopravvivere per lunghi periodi di tempo in un ambiente ostile come uno stabilimento di trasformazione alimentare, questo è parzialmente dovuto alla sua capacità di sopravvivere ai vari stress ambientali e anche per via della sua capacità di formare biofilm che portano alla persistenza del patogeno sulla superficie e, tramite contaminazione crociata, alla successiva contaminazione dei prodotti finiti. I vegetali freschi (es: cetrioli, peperoni dolci, patate, ravanelli) possono essere contaminati da Listeria monocytogenes specialmente quando vi è contatto con terra e residui organici. Nel latte Listeria monocytogenes può essere presente in latti non sottoposti a trattamenti termici o il latte che ha subito trattamenti termici inadeguati. Il latte crudo può essere contaminato da L monocytogenes da mammelle e attrezzature di mungitura contaminate o animali con mastite listeriale. Listeria monocytogenes può formare biofilm sull’apparecchio di mungitura e contaminare il latte; il patogeno può svilupparsi nel latte crudo refrigerato anche se con crescita rallentata mentre la crescita risulta accelerata quando la temperatura del latte crudo è superiore a 4°C. Listeria monocytogenes può essere frequentemente isolata da prodotti lattiero caseari, in particolare in formaggi a pasta molle; la presenza di L. monocytogenes nei formaggi può essere originata dagli ingredienti, in particolare dal latte crudo, o può provenire dall'ambiente dell'impianto di lavorazione, comprese le attrezzature, il personale o la
disidratazione, incapaci di crescere in presenza di NaCl pari o superiore a 3,5%, il valore di aw minima è 0,98. Le cellule sono bastoncelli a forma di spirale o ricurvi con una lunghezza compresa tra 0,5 e 5 micron e una e una larghezza compresa tra 0,8- 0,2 micron; i bacilli sono gram-negativi con flagelli polari ad una o ad entrambe le estremità; ogni cellula è circondata da una capsula polisaccaridica. Tali microrganismi non formano spore e quando coltivate in un mezzo di coltura solido in piastra mostrano colonie translucide, sparse e non pigmentate. La temperatura di crescita delle specie del genere Campylobacter è compresa tra 37 °C e 45 °C, con un optimum a 42 °C; la maggior parte delle specie è termotrofica, ma generalmente sensibili ai trattamenti termici quali la pastorizzazione e la cottura. Alcuni autori hanno evidenziato come le cellule del patogeno esposte a temperature al di sopra di quelle ottimali per la crescita possano rispondere producendo proteine specifiche heat shock proteins HSP, questo meccanismo omeostatico porta a sviluppare una termotolleranza che si traduce nella sopravvivenza batterica a temperature di 60°C per circa 1 ora. Nonostante questa caratteristica di termotolleranza, queste specie sono termosensibili e vengono distrutte dal normale processo di pastorizzazione (si inattivano già a 48 °C) e da adeguata cottura dei prodotti. Le cellule batteriche esposte a temperature superiori a quelle ottimali per la crescita rispondono generalmente con una risposta di shock termico che coinvolge la sintesi di proteine; questa risposta è considerato un importante meccanismo omeostatico che permette alle cellule batteriche di sopravvivere al riscaldamento e ad una varietà di stress ambientali, queste proteine hanno il compito di mantenere le proteine della cellula avvolte in modo corretto che aumenta la capacita di riparare i danni e resistono ad altri trattamenti prevenendo la morte cellulare. Sono 24 le proteine sintetizzate da Campylobacter jejuni immediatamente dopo lo shock termico come ad esempio: GroEL, GroES, DnaJ*, DnaK, Lon. I mutanti per la proteina DnaJ mostrano un ritardo nella crescita a 46°C e sono anche incapaci di colonizzare i polli. Le specie termotolleranti di Campylobacter quali: Campylobacter jejuni (più frequente), Campylobacter coli, Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis sono gli agenti che causano la malattia umana campilobatteriosi; sebbene alcune specie non termotolleranti come Campylobacter foetus possono causare l’infezione. Attualmente ci sono circa 35 specie di Campylobacter e 14 sottospecie, le diverse specie sono presenti in una vasta gamma di ospiti vertebrati tra cui alcuni rettili ma anche ad alcuni invertebrati come i molluschi. Campylobacter può essere presente nel cosiddetto stato vitale ma non coltivabile (VBNC), che è definito come uno stato di dormienza in cui cessa la crescita del microorganismo sui terreni batteriologici normalmente utilizzati per la sua coltivazione ma comunque questi batteri rimangono vitali con un attività metabolica minima. Quando Campylobacter è in uno stato vitale ma non coltivabile ha un cambiamento caratteristico delle cellule che da spirali diventano a forma coccica dovuto ad uno stress ossidativo; secondo una teoria queste forme cocciche (dormienti) potrebbero essere riattivate in condizioni ideali ma secondo un’altra teoria queste forme cocciche non possono esse più attivate. Per non coltivabile intendiamo: “non coltivabile utilizzando il mezzo e le condizioni utilizzate per coltivare cellule normali non stressate”. Per studiare le forme vitali ma non coltivabili sono state introdotte delle tecniche di analisi per evidenziare l’attività metabolica che hanno evidenziato nelle «cellule vitali ma non coltivabili» di Campylobacter è presente un certo livello di metabolismo e integrità di membrana ma una riduzione della sintesi proteica. Quindi queste cellule potrebbero essere descritte come attive ma non coltivabili e potrebbero o meno essere in grado di causare infezioni; attualmente è improbabile che le cellule vitali ma non coltivabili svolgano un ruolo significativo nel causare la malattia rispetto alla loro controparti vitali ma coltivabili. Campylobacter: Patologia Il quadro clinico della campilobatteriosi di origine alimentare può a volte essere confuso con quello causato da altri patogeni enterici, infatti la campilobatteriosi è una enterite acuta che si può complicare in batteriemia, infezioni acute e artrite settica (rara). Il periodo di incubazione dura in media 3 giorni e può manifestarsi per un minimo di 8 ore ad un massimo di 8 giorni e si manifesta per lo più con diarrea (85%) ma anche con dolori addominali, febbre o vomito. Nella maggior parte dei casi (80%) la malattia è autolimitante e termina in una settimana, il batterio può comunque persistere nelle feci per diverse settimane. Nei pazienti l’espressione clinica della malattia può inserirsi in tre diversi meccanismi patogenetici: semplice diarrea secretoria (adesione e colonizzazione con sintesi di enterotossine); diarrea sanguinante o con muco (proliferazione dei batteri nella mucosa intestinale); i batteri possono passare attraverso o tra gli enterociti, e così al torrente circolatorio per raggiungere organi bersaglio specifici. Durante la campilobatteriosi di origine alimentare l’enumerazione di Campylobacter in campioni di feci può rilevare la presenza di 10^6-10^9 cellule/grammo il che indica che è avvenuta la colonizzazione del tratto intestinale. La colonizzazione può avvenire secondo un preciso schema che inizia con l’adesione alla superficie del muco intestinale seguita dalla penetrazione del muco e un’associazione/adesione alle cellule epiteliali intestinali. Per Campylobacter la colonizzazione è più semplice rispetto ad altri patogeni perché esistono condizioni ottimali per la sua crescita in quanto nell’intestino vi è una temperatura di 37-39°C e condizioni di microaerofilia e in secondo luogo fattori intrinseci come la resistenza ai Sali biliari, la sua morfologia e mobilità e la sua chemiotassi positiva per il muco forniscono a Campylobacter un vantaggio selettivo sulla flora commensale. La relazione dose/risposta per Campylobacter non è ancora chiara poiché la malattia è multifattoriale e dipende: dalla sensibilità dell’ospite; dalle caratteristiche degli alimenti contaminati ingeriti che può proteggere il patogeno dall’acidità gastrica, dalla virulenza dei ceppi ingeriti e dallo stato immunitario dell’ospite. Campylobacter jejuni è un patogeno altamente mobile e la chemiotassi è un fattore importante nella sua patogenesi, poiché la chemiotassi è la capacità di rilevare e muovere secondo un gradiente chimico, ad esempio attrazione per i nutrienti o repulsione di tossine. Questo movimento in Campylobacter jejuni favorisce la sua sopravvivenza e la sua colonizzazione della mucosa intestinale; in Campylobacter jejuni la motilità flagellare è un fattore necessario per la colonizzazione di ospiti animali come il pollame. I flagelli sono essenziali anche per la sopravvivenza di Campylobacter jejuni in condizioni ambientali differenti, in particolare quando l’agente patogeno si trova nel tratto digestivo dove la viscosità dell’epitelio favorisce la motilità batterica Campylobacter si muove con un
movimento a spirale tramite uno o due flagelli polari che partecipano all’ingresso e alla colonizzazione della mucosa intestinale. L’adesione alle cellule epiteliali è un passo essenziale delle infezioni batteriche, è un prerequisito per colonizzare l’intestino dell’ospite e invadere le cellule epiteliali; la colonizzazione è un processo multifattoriale e dipende dalla motilità dei microorganismi, dalla chemiotassi e dalla sintesi di adesine. Le adesine sono strutture superficiali dei batteri che si legano a recettori specifici presenti sulle cellule che formano gli epiteli mucosi; per lo più si tratta di glicoproteine o lipoproteine come ad esempio proteine di fimbrie e pili nei Gram negativi, acidi teicoici e proteine della parete nei Gram+ o polisaccaridi della capsula. Alcuni fattori di adesione sono stati caratterizzati, infatti la proteina più studiata è la CadF che è una glicoproteina della matrice extracellulare che si lega a proteine di membrana della cellula ospite chiamate integrine, inoltre la proteina CadF contribuisce al complesso processo di adesione di Campylobacter jejuni alle superfici inerti ed è un passo preliminare per la formazione di biofilm sulle superfici a contatto con gli alimenti. Campylobacter jejuni può legarsi alle cellule ospiti tramite un’altra adesina chiamata PeB1 che appartiene alla famiglia dei fattori di legame cellulare; anche la lipoproteina JlpA è coinvolta nell’adesione di Campylobacter jejuni alle cellule epiteliali. Nell’intestino l’organizzazione fisica e la composizione dello strato di muco (costituito da glicoproteine microbiota intestinale e peptidi anti microbici) protegge le cellule epiteliali dai batteri patogeni, quindi questi per causare la malattia devono colonizzare e distruggere il muco e per fare questo i microrganismi producono enzimi degradativi del muco come ad esempio le mucinasi e le glicosolfatasi; inoltre la chemiotassi e la motilità flagellare facilitano la colonizzazione e la penetrazione della barriera mucosa. Durante l’infezione degli esseri umani l’invasione delle cellule epiteliali è un fattore di virulenza determinante per Campylobacter jejuni, l’invasione di cellule ospiti da parte del patogeno può essere esercitata attraverso effetti additivi delle proteine coinvolte all’adesione cellulare. Durante questo processo oltre alla produzione di proteine flagellari vengono prodotte proteine necessarie per le interazioni con le cellule eucariotiche fra le quali le proteine Cia (Campylobacter invasion antigens), inoltre la proteina FlaC (Flagellin-Like Protein) prodotta dal flagello è coinvolta nella motilità del microorganismo ed è richiesta per la piena invasione delle cellule eucariotiche. Le tossine che possono essere prodotte da Campylobacter jejuni includono: una Cytolethal distending toxin (CDT), una enterotossina simile alla tossina del colera (CTLT) e altre citotossine; ad oggi conosciamo solo i geni che codificano per la tossina CDT. Il danno al DNA indotto dalla tossina CDT di Campylobacter jejuni sembra avere effetti sull'infiammazione dell'intestino e sui sintomi della diarrea, inoltre la tossina CDT ha dimostrato di essere coinvolta nell’internalizzazione e/o nella sopravvivenza del patogeno nelle cellule ospiti. Campylobacter : Fonti di Contaminazione e Fattori di Rischio L’ubiquità di Campylobacter jejuni e Campylobacter coli sia nel bestiame che negli animali da compagnia rende facile il loro ingresso nella catena alimentare umana con conseguente rischio per la salute infatti è una delle zoonosi più comunemente riportate con 214.779 casi confermati nel 2013 in EUROPA. Le specie termo tolleranti di Campylobacter sono naturalmente presenti nell'intestino del pollame e sono presenti in alto numero anche nei contenuti intestinali di altri volatili, per tanto durante la rimozione dell’intestino che avviene nella lavorazione delle carni possa verificarsi la contaminazione del prodotto finito. Altre fonti di infezione possono essere l’acqua, il latte crudo e altri alimenti meno usuali come i piselli crudi. La carne di pollo rappresenta il più grande fattore per la diffusione di Campylobacter di origine alimentare, infatti un report dell’EFSA dimostra che circa il 37% di carne di pollo fresca sottoposta ad analisi microbiologica è risultata positiva per la presenza di Campylobacter; oltre le carni di pollo i servizi di catering sono riconosciuti come una delle fonti più rilevanti per la diffusione della malattia. Il settore alimentare al dettaglio rappresenta il punto di contatto tra produttori e consumatori, dove i rivenditori possono avere un ruolo non marginale nella gestione del rischio Campylobacter insieme agli allevatori e agli operatori del settore alimentare. In tale ambito il rischio Campylobacter varia notevolmente a seconda della scala e della natura del punto vendita, infatti presso la grande distribuzione organizzata il rischio di contaminazione è inferiore rispetto a quello presente nelle macellerie di piccole dimensioni; tuttavia nella grande distribuzione organizzata eventuali danni possono raggiungere un numero molto più elevato di consumatori. Per quanto riguarda l’allevamento la colonizzazione del tratto intestinale dei pulcini non è rilevabile prima dei 7 giorni di età, mentre la quantità totale di Campylobacter all’interno delle unità allevate può raggiungere il livello massimo all’età della macellazione dove l’agente patogeno può essere rilevato con una frequenza fino al 100%. La trasmissione orizzontale è la maggior causa della colonizzazione mentre la trasmissione verticale (genitoriprole) rimane non chiarita. Sebbene abbiamo informazioni di colonizzazione di Campylobacter nei polli, non abbiamo informazioni su come intervenire per limitare l’azione dell’agente patogeno sia negli allevamenti e sia nelle carni. I principali fattori che possono essere significativamente associati alla presenza di Campylobacter nei polli includono: l’età dell’impianto in cui vengono allevati i polli, il controllo dei roditori, l’età dei polli al momento del macello, presenza di animali domestici e presenza di tende alle finestre. Per quanto riguarda la macellazione la presenza di Campylobacter nel tratto intestinale può portare alla contaminazione della carcassa durante la macellazione, inoltre la rimozione delle penne può aumentare il livello di contaminazione. Carni di maiale e di ruminanti sono generalmente considerate a basso rischio, tuttavia le frattaglie crude di questi animali sono a rischio piuttosto elevato di trasmissione; anche i molluschi bivalvi consumati crudi sono potenzialmente a rischio per il consumatore. Recenti rapporti dell’EFSA hanno identificato alimenti prodotti dalla ristorazione collettiva (catering, ristoranti) come quelli più frequentemente causa di infezione da Campylobacter. Campylobacter è considerato un microrganismo fragile ma può sopravvivere anche per lunghi periodi e rimanere metabolicamente attivo nella carne cruda refrigerata; Campylobacter jejuni ha dimostrato un aumento della resistenza al calore quando è presente nelle carni precedentemente conservate a temperature di refrigerazione. Le principali fonti di rischio sono rappresentate: dalla contaminazione crociata fra materie prime e prodotti finiti, una cottura inadeguata del fegato di pollo, errate procedure di
di temperatura di crescita compresa tra 10 e 50 °C ed un optimum tra 28 e 37 °C, inoltre, solo pochi ceppi possono moltiplicarsi sotto i 7 °C e sopra i 45 °C; e le spore di sono moderatamente resistenti al calore e sopravvivono al congelamento ed essiccamento. Diversi ceppi del gruppo Bacillus cereus possono crescere lentamente a concentrazioni di cloruro di sodio del 10, e i valori minimi di attività dell’acqua per la crescita sono compresi tra 0,91-0,93; esso ha bisogno di amminoacidi come fattori di crescita ma la presenza di vitamine non risulta essenziale. B. cereus può crescere a valori di pH variabili da 4,3 a 9,3, con un optimum compreso tra 6,0 e 7,0; questi valori limite per la crescita non sono assoluti e dipendono da diversi fattori che includono anche il ceppo. Bacillus cereus è stato isolato dall’aria, dal suolo, dall’acqua e da alimenti di origine vegetale e animale, quindi essendo isolato da diverse matrici sia ambientali che alimentari sono molto comuni e non sono adattate ad uno specifico ospite e così le loro spore sono ampliamente distribuite nell’ambiente. Il gruppo al quale appartiene Bacillus cereus comprende le seguenti sette specie: Bacillus cereus sensu stricto, Bacillus anthracis, Bacillus cytotoxicus, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus thuringiensis, Bacillus weihenstephanensis; tutte queste specie sono geneticamente correlate e vengono generalmente conosciute come Bacillus cereus sensu lato. Alcune caratteristiche fenotipiche sono state alla base della speciazione ad esempio Bacillus mycoides e Bacillus pseudomycoides sono caratterizzate da tipiche colonie rizoidali quando coltivati su terreni agarizzati; Bacillus thuringiensis produce la δ-enterotossina (tossina BT) che si presenta come un corpo di inclusione cristallino parasporale e possiede attività insetticida; Bacillus anthracis è l’agente eziologico della malattia antrace. Specie psicrotolleranti di Bacillus cereus , crescita a 7°C o a temperatura inferiore ma non a 43 °C sono state riassegnati alla specie Bacillus weihenstephanensis sulla base di geni che codificano per proteine da shock termico in particolare per proteine da shock da freddo; inoltre la specie Bacillus cereus sottospecie cytotoxis con crescita a temperature di 6-8 °C è stata riclassificata come Bacillus cytotoxicus. Importante caratteristica del gruppo di Bacillus cereus è la produzione di tossine attraverso le quali vengono provocate le patologie associate alle specie, a tal proposito una caratteristica comune al gruppo è la localizzazione a livello di plasmidi dei geni che codificano per la produzione delle tossine. Bacillus cereus sensu stricto è un patogeno alimentare che causa di tossinfezioni ed è un agente patogeno a livello oculare poiché responsabile di congiuntiviti, panoftalmiti, cheratiti, iridocicliti e ascessi orbitali; può causare anche infezioni opportunistiche del tratto respiratorio e infezioni a livello delle ferite. Le cellule di Bacillus cereus sono grandi e raggiungono da 3-5 micron di lunghezza e 1,0 μm di larghezza, spesso sono associate a catene, sono mobili e dotate di flagelli peritrichi; al contrario una delle caratteristiche distintive di Bacillus anthracis è la non mobilità. La caratteristica più importante delle specie di Bacillus cereus è la loro capacità di formare endospore, che sono più resistenti delle cellule vegetative al calore, ai conservanti alimentari e ad altri stress ambientali. Le endospore sono ellissoidali, con una disposizione sia centrale che sub terminale e non formano sporangi. La proprietà di resistenza delle spore sono la conseguenza diretta della loro struttura costituita da un core disidratato, circondato da diversi strati protettivi; la dormienza è un’altra proprietà tipica delle spore che è fondamentale per la loro longevità. Spore dei ceppi di Bacillus cereus spesso associate a tossinfezioni alimentari hanno una resistenza al calore di circa 95 °C per circa 24 minuti, altri ceppi mostrano una gamma più ampia di resistenza al calore che va da 1,5 a 36 min a 95 °C; hanno pure una resistenza alle radiazioni, e la dose necessaria alla riduzione del 90% della carica di spore è di 1,25 e 4 kGy mentre la dose necessaria a ridurre il 90% delle cellule vegetative è di 0,17 e 0,65 kGy. Per alcuni ceppi di Bacillus cereus l’attivazione al calore delle spore può indurre la germinazione delle spore o accelerare l’effetto di molecole che sono preposte all'induzione della germinazione; l’attivazione al calore delle spore può essere definito come un trattamento a una temperatura subletale che potenzia e sincronizza la germinazione delle spore, il tempo e le temperature di attivazione al calore variano da 15 a 30 minuti a 70 80 °C per diversi ceppi ( ad esempio: spore di B. cereus ceppo T vengono attivate a 65 °C per un tempo di 30 minuti). I ceppi coinvolti nella tossinfezione alimentare potrebbero avere maggiore resistenza al calore e quindi essere più adattati a sopravvivere alla coltura. La germinazione delle spore di Bacillus viene indotta da nutrienti specifici, questo tipo di germinazione, indotta da sostanze nutritive, è mediata dall' interazione fra i nutrienti e i recettori preposti alla germinazione della spora situati nella membrana interna ad esempio: la presenza di glicina o l-alanina induce la germinazione delle spore. Tale processo è conseguente all’afflusso di acqua e alla successiva attivazione di un trasportatore o poro che media il trasporto di calcio dipicolinato (Ca-DPA) fuori dalle spore; ma, tuttavia, la precisa dinamica di questo processo di attivazione non è stata ancora del tutto chiarita. Bacillus cereus : Patologia All’interno del gruppo Bacillus cereus, Bacillus cereus sensu stricto è la specie che è più ampiamente riconosciuta come agente causale di malattie di origine alimentare. Due tipi distinte di malattie sono stati attribuiti ad ingestione di cibi contaminati da Bacillus cereus: Infezione (sindrome da diarrea); Intossicazione (sindrome emetica). L’infezione che causa la diarrea è causata dall’ingestione di cellule vitali che producono enterotossine nell’intestino tenue; l’intossicazione che causa la sindrome emetica avviene dopo l’ingestione di una tossina termostabile cereulide preformata nell’alimento. Per quanto riguarda la sindrome diarroica l’ingestione di spore o cellule vitali porta alla colonizzazione dell’intestino tenue dove vengono formate le tossine tra la fase esponenziale e quella stazionaria insieme ad altri fattori di virulenza, la conseguente manifestazione di diarrea avviene dopo circa 8-16 ore dall’ingestione dell’alimento contaminato. La produzione di tossine diarroiche avviene ad intervallo di temperatura compreso fra 10 e 43°C, con una temperatura ottimale di 32°C; le tossine vengono maggiormente prodotte in ambienti con ridotti livelli di ossigeno (ovvero le condizioni dell’intestino tenue). La sindrome diarroica è causata dall’ingestione di tossine termolabili, rapidamente degradate a pH 3 e idrolizzate dagli enzimi proteolitici del tratto digerente. Tale patologia desta preoccupazioni nei bambini con pochi giorni di vita dove lo stomaco non presenta ancora una forte acidità, tale da denaturazione quando presente la tossina preformata in una matrice alimentare. L’effetto patogenico
diarreogeno è collegato a due complessi di enterotossine: l’emolisina BL (HBL) e l’enterotossina non emolitica (NHE); tra le tossine che causano diarrea, la emolisina BL (HBL) è la più studiata poiché possiede proprietà emolitiche, enterotossiche, dermonecrotiche. L’emolisina BL (HBL) è un complesso formato da tre componenti proteiche: L1, L2, B che sono codificate rispettivamente da: gene hblD, gene hblC; gene hblA e sono questi geni localizzati sul cromosoma batterico. Questa enterotossina ha capacità emolitica e provoca lisi osmotica formando un poro trans membrana a seguito del legame delle tre componenti proteiche; tale tossina è citotossica e può causare l’accumulo di liquidi nelle anse ileali dell’intestino. Anche l’enterotossina Nhe è un complesso a tre proteine composta da proteine denominate: NheA, NheB, NheC, che sono codificate rispettivamente da: gene nAA, gene nB, gene nheC e sono questi geni localizzati sul cromosoma batterico; Anche la tossina Nhe è citotossica e causa pori trans membrana. Le tossine Hbl e Nhe risultano correlate e necessitano di tutte tre le componenti proteiche per esercitare la massima attività biologica. C’è una terza enterotossina associata alla sindrome diarroica che è chiamata Citotossina K (CytK), essa è formata da una singola proteina codificata dal gene cromosomale cytK ed è in grado di formare pori trans membrana. La tossina ematica è estremamente resistente al trattamento al calore a 126 °C per 90 min, estremamente resistente a condizioni alcaline e acide come pH 2 e 11 ed estremamente resistente alla proteolisi da proteasi gastrointestinali; tale caratteristiche che rendono la tossina resistente alla cottura e ai processi digestivi dello stomaco sono tipiche anche di altre tossine preformate negli alimenti. Comunque, la tossina emetica è stata identificata come un peptide strutturato ad anello composto da tre sequenze ripetute di quattro amminoacidi e/o ossiacidi; essa è un dodeca depsipeptide chiamata Cereulide. L’emesi è prodotta dal legame della tossina preformata nell’alimento con i recettori dei neuroni enterici 5-HT3 che regolano: la motilità intestinale, l’emesi e la nausea; l’interazione tossina e recettori stimolano le fibre afferenti al nervo vago che portano a una stimolazione del centro del vomito del cervello innescando il riflesso al vomito; la quantità di cereulide necessaria per provocare il vomito è di circa 70 μg. La Produzione di tossina emetica avviene ad una T° compresa fra 12-37 °C con un optimum di 12-15 °C, pertanto tale processo è coerente con le tossinfezioni derivate da alimenti insufficientemente refrigerati. La manifestazione della patologia avviene solitamente dopo 5 ore dall’ingestione dell’alimento contaminato; la tossina emetica può essere prodotta da ceppi di B. cereus con cariche pari ad almeno 10^5 cfu/g di alimento mentre le enterotossine che causano la sindrome diarreogena sono di solito prodotte da cariche pari a 10^6 cfu/g di alimento e le altre tossine sono sintetizzate poi dal microrganismo nell'intestino tenue dell'ospite. Bacillus cereus : Fonti di Contaminazione e Fattori di Rischio Bacillus cereus è stato isolato da un amplia varietà di alimenti tra cui: latte e prodotti lattiero caseari, carne e prodotti a base di carne, uova liquide pastorizzate, riso, verdure pronte al consumo e spezie. Sulla base della natura ubiquitaria dell’organismo è impossibile ottenere materie prime libere da spore di Bacillus cereus se non sterilizzate. Le malattie alimentari associate a Bacillus cereus si verificano quando le condizioni di conservazione favoriscono la crescita attiva dell'organismo, ciò può avvenire a causa di una inadeguata refrigerazione, di un raffreddamento troppo lento o inadeguata conservazione di alimenti cotti che vengono mantenuti a temperature >10°C o < 60 °C. Negli alimenti refrigerati inoltre possono moltiplicarsi ceppi psicrotrofici di B. cereus che possono crescere a 7°C. I prodotti a base di latte in polvere compreso il latte artificiale, risultano frequentemente contaminati da spore di Bacillus cereus; tali spore possono germinare nel latte ricostituito e conservato a temperatura ambiente. La germinazione e la moltiplicazione delle cellule germinative possono determinare la produzione di tossina nell’alimento, è stato raccomandato che in tali alimenti la carica delle spore di Bacillus cereus sia la più bassa possibile. Diversi alimenti sono dei veicoli per la trasmissione della sindrome diarroica da Bacillus cereus; il primo focolaio ha coinvolto una salsa alla vaniglia, successivamente numerose epidemie sono state collegate a diversi alimenti quali piatti a base di carne, verdure, panna, spezie, pollame e uova. La sindrome emetica associata a Bacillus cereus è stata identificata a seguito del consumo di riso fritto contaminato; gli episodi legati alla sindrome emetica sono quasi sempre associati al consumo di alimenti amidacei in quanto l’amido favorisce la crescita di B. cereus e la produzione di tossina emetica. Il veicolo di circa il 95% di tutti i casi di sindrome emetica è stato il riso alla cantonese bollito e lasciato raffreddare a temperatura ambiente per diverse ore prima della successiva frittura con uovo sbattuto; questo perché le spore di Bacillus cereus sopravvivono al processo di cottura, germinando poi nel riso cotto mantenuto a T° ambiente, di conseguenza le cellule vegetative possono poi proliferare rapidamente producendo la tossina emetica nell’alimento. Alcune epidemie sono inoltre state collegate a: altre preparazioni di riso, prodotti di pasticceria freschi, panna pastorizzata, budino di latte, pasta cotta. Nel settore lattiero-caseario il suolo, il mangime e la lettiera degli animali da latte attraverso l’escrezione di spore nelle feci costituiscono la principale fonte di contaminazione da Bacillus cereus del latte. Anche l'attrezzatura usata per la mungitura può essere una fonte di contaminazione per il latte crudo; nel latte pastorizzato sono state riportate cariche di B. cereus fino a 10^4 ufc/ml di latte. Le superfici maggiormente responsabili della contaminazione del latte pastorizzato possono essere: i serbatoi di stoccaggio del latte pastorizzato, le macchine per il confezionamento e le superfici dei dispositivi per la formatura delle confezioni. Bacillus cereus può essere associato alle superfici dei recipienti per lo stoccaggio del latte e sulle superfici di lavorazione del latte, l’adesione dei batteri con successiva formazione di biofilm negli ambienti per la caseificazione risulta essere una contaminazione per i prodotti finiti con una riduzione del tempo di conservazione e della qualità igienica. Bacillus cereus forma biofilm in maniera più efficiente sulle superfici in acciaio inox rispetto a quelle in polistirene, tale comportamento sembra dovuto alla maggiore disponibilità di ferro; l’adesione avviene più facilmente su superfici più ruvide, pie idrorepellenti e rivestite di film organici che sono costituiti da residui organici di latte; l’adesione aumenta con l’aumentare della temperatura, del pH e del tempo. La capacità delle spore di Bacillus cereus di aderire alle superfici e dare inizio alla formazione di biofilm negli impianti di trasformazione degli alimenti è ben conosciuta, una glicoproteina (la BclA) svolge un ruolo importante
Staphylococcus aureus è un batterio gram-positivo, di forma coccica, anaerobio facoltativo, catalasi positivo, immobile e con scarse esigenze nutritive. Questo microrganismo fermenta gli zuccheri con produzione di acido lattico oppure gli può metabolizzare attraverso la catena respiratoria; esso è resistente al sale (fino al 20%) ed al saccarosio (fino al 60%), di conseguenza ha valori di aw minimi compresi fra 0,86 e 0,9 mentre se il microrganismo si trova in condizione di anaerobiosi l’aw per il suo sviluppo è intorno a 0,9. In alcuni casi cresce anche a valori di aw di 0,83 e per la sua resistenza a sale e saccarosio viene definito microrganismo alofilo che è una caratteristica unica per un microrganismo alimentare. Il pH massimo di sviluppo è pari a 8,0 (minimo 4,8 mentre) ed è differente se ci troviamo in aerobiosi (pH4,8) o anaerobiosi(pH5,5); ha un optimum di temperatura tra 30 °C e 37 °C con un minimo pari a 10 °C ed un massimo pari a 45 °C. Questo microrganismo viene anche definito coaugulasi positivo e temonucleasi positivo e queste sue particolari caratteristiche vengono sfruttate nei test di laboratorio per diagnosticarne la presenza ad esempio negli alimenti. Essendo un agente di intossicazione alimentare è in grado di produrre tossine preformate nell’alimento, le Emolisine α e β e poi abbiamo una serie di enterotossine fortemente termostabili e sono 13 ma le principali sono 7: A, B1, C1, C2, C3, D, E; queste tossine sono proteine globulari termoresistenti, quindi inattivate da trattamenti termici riservati agli alimenti. Queste tossine resistono anche agli enzimi proteolitici ma si inattivano ad un pH pari a 2; queste tossine sono causa di gastroenterite quando preformate nell’alimento, ed essendo correlata alla °T una maggior produzione di tossine avviene a circa 40°C. La dose minima di cellule di Staphylococcus aureus sufficiente a causare l’intossicazione è variabile ma di solito è compresa fra 10^5 e 10^8 ufc/g di alimento, questa quantità di cellule vitali presenti ci indica che la probabilità di produzione di tossine è alta, quindi anche il rischio per il consumatore. Anche altri stafilococchi oltre l’aureus possono essere produttori di enterotossine ma la specie Staphylococcus aureus risulta la più nota per quanta riguarda la causa di gastroenterite staffilococcica. Di solito è il 50% dei ceppi di Staphylococcus aureus ha possedere i determinanti genici della enterotossinogenesi quindi questi ceppi vengono definiti enterotossinogeni; il gene è cromosomico, ma alcuni ceppi hanno bisogno di plasmidi per l’espressione. L’intossicazione staffilococcica è una gastroenterite e si manifesta dopo un breve periodo di incubazione che viene definito come il tempo che intercorre tra l’ingestione dell’alimento contaminato e la comparsa dei sintomi e questo tempo va da 30 minuti a 3 ore ed è correlato alla quantità di tossina assunta con l’alimento ma anche della sensibilità individuale alle enterotossine; nonostante non sia una patologia grave, essa è molto diffusa. Staphylococcus aureus è in grado di colonizzare gli ambienti più svariati ma non è in grado di svilupparsi nell’intestino di uomo e animali, pertanto è comunemente riscontrato al livello delle mucose nasali, del cuoio capelluto e dell’epidermide dell’uomo e di animali dove il microrganismo può essere responsabile foruncoli. Questi microrganismi quando presenti sulla cute o sulle mucose dell’uomo o animali può andare a contaminare gli alimenti e quindi , una volta contaminati, possono essere fonte di intossicazione qual ora il microrganismo gli si moltiplichi e sia in grado di produrre le tossine; pertanto va posta una grande attenzione in fase di manipolazione degli alimenti da parte degli operatori del settore alimentare. La trasmissione attraverso gli alimenti può dare luogo ad intossicazione che si sviluppa quando si consumano alimenti che contengono le enterotossine che sono sintetizzate dal microrganismo e rilasciate nell’alimento durante la replicazione di Staphylococcus aureus. Gli alimenti che con maggior frequenza possono rendersi responsabili di intossicazione, sono soprattutto quelli ricchi di nutrienti, sottoposti a manipolazioni da parte dell’uomo e non adeguatamente refrigerati dopo la preparazione; pertanto alcuni alimenti indicati come fonte di intossicazione e come veicolo di enterotossine sono: uova e prodotti di pasticceria (specie se ripieni di crema pasticcera), paste farcite, gelati, latte non pastorizzato e conservato in abuso termico (perché Staphylococcus aureus non produce spore e non resiste al trattamento termico), prodotti ittici trasformati, carni macinate, polpettoni. Quindi una particolare attenzione va posta agli alimenti cotti e successivamente ricontaminati, conservati a temperature permissive per la replicazione di S. aureus e serviti dopo diverse ore dalla preparazione (carni fredde, polpettoni, insalate miste contenenti carne, ecc.). In questi alimenti Staphylococcus aureus può replicare velocemente in quanto questi alimenti, già sottoposti a trattamenti termici, risultano ricchi di nutrienti ma anche poveri di flora microbica antagonista cioè altri gruppi microbici che potrebbero competere per i nutrienti con Staphylococcus aureus; i competitori non possono essere presenti in quanto l’alimento è stato già risanato con la cottura per cui il microrganismo reintrodotto in un alimento già risanato non trova competizione e trova numerosi nutrienti. Infatti, generalmente S. aureus non è un microrganismo competitivo in alimenti ricchi di una normale flora microbica autoctona e non riesce a competere per i nutrienti dell’alimento e lo sviluppo di altri gruppi microbici (es. batteri lattici) causa poi una serie di cambiamenti delle condizioni ambientali tali per cui la crescita di S. aureus viene inibita. Un alimento che spesso viene coinvolto nei casi di intossicazione da Staphylococcus aureus può anche essere il prosciutto crudo, perché essendo un microrganismo alofilo riesce a replicare in elevate concentrazioni di sale come quelle che potremmo trovare nel prosciutto crudo. Analizzando le numerosissime epidemie da intossicazione stafilococcica avvenute nel tempo sono state identificate 5 possibili cause comuni che possono rendere l’alimento non sicuro dall’intossicazione da Staphylococcus aureus che sono: una scarsa igiene e impropria manipolazione degli alimenti da parte di operatori in ambito alimentare infetti o portatori sani di S. aureus, una refrigerazione inadeguata degli alimenti, un trattamento termico inadeguato degli alimenti, abusi di temperature cioè l’alimento contaminato viene lasciato in caldo a temperature che favoriscono lo sviluppo del microrganismo e infine busi di tempi in quanto l’alimento a rischio da S. aureus viene lasciato a temperature permissive per lo sviluppo del patogeno per oltre 4 ore. La prevenzione dell’intossicazione causata da Staphylococcus aureus si basa su una serie di attenzioni volte ad impedire lo sviluppo del patogeno negli alimenti prodotti e il mancato sviluppo del microrganismo è conseguente ad una sua mancata produzione di tossine. Quindi è necessario mantenere gli alimenti cotti da servire caldi come quelli serviti dalla ristorazione collettiva a temperatura al di sopra della quale Staphylococcus aureus non può moltiplicarsi, quindi sopra dei 60- 65°C. la pastorizzazione del latte è necessaria ad inattivare il microrganismo ed è necessario raffreddare rapidamente gli
alimenti e conservarli in condizioni idonee di refrigerazione per tanto al di sotto dei 10°C per determinati alimenti o al di sotto dei 4°C per paste fresche o latticini. Per alimenti da ristorazione è necessario ridurre i tempi tra preparazione e la sua somministrazione ed è importante un’adeguata formazione del personale che opera nelle aziende alimentari e nell’ambito della ristorazione collettiva dove a causa della somministrazione di molti pasti possono verificarsi lunghi tempi di sosta tra cottura e somministrazione di alimenti per cui la formazione: assicura che le fasi di produzione e di mantenimento vengono effettuate in maniera idonea e assicura la corretta igiene durante le fasi di preparazione. Clostridium botulinum I membri del genere Clostridium appartengono alla famiglia delle Bacillaceae e sono bastoncini gram positivi, sporigeni, mobili grazie a ciglia peritriche o immobili, catalasi negativa, anaerobi obbligati, fermentativi con produzione di gas. A questo genere appartengono microrganismi mesofili e termofili, talvolta psicrotrofi e agenti patogeni e di alterazione degli alimenti (principalmente per fenomeni putrefattivi). Alcune specie del genere Clostridium sono patogene per via alimentare, in particolare Clostridium botulinum e Clostridium perfringens , mentre altre specie non hanno gli alimenti come veicolo e, tra queste la più nota è Clostridium tetaniche vive nel suolo ed è l’agente del tetano. Clostridium botulinum è responsabile della malattia chiamata botulismo, è sensibile a pH inferiore a 4,5 e la specie è composta da ceppi con diverse caratteristiche colturali e fenotipiche, ma tutte accomunate dalla capacità di produrre tossine ad azione neurotossica. I ceppi di Clostridium botulinum sono designati in base al tipo di tossina prodotta con le lettere A, B, C, D, E, F, G (7 sierotipi); i sierotipi A,B,E,F sono quelli responsabili del botulismo umano, i ceppi C,D sono agenti del botulismo animale mentre i ceppi G non sono stati ancora associati a botulismo. Generalmente un ceppo produce una singola tossina e in alcuni casi lo stesso ceppo può produrre più di una tossina. L’habitat del Clostridium botulinum è generalmente il suolo, ma anche l’intestino di uomo e animali e quindi anche le loro feci; le spore dei clostridi sono resistenti al calore e agenti disinfettanti e sono ubiquitarie, quindi le spore presenti nell’ambiente possono arrivare al prodotto finito e, quando trovano le condizioni idonee possono andare incontro alla germinazione e alla successiva moltiplicazione delle forme vegetative. Le condizioni comuni a tutti i ceppi di Clostridium botulinum che determinano la moltiplicazione del microrganismo sono: assenza di aria (anaerobiosi); optimum di °T a 30-37°C con un minimo di 10°C, eccetto il ceppo E (rinvenuto nel pesce) che cresce anche a 3,3°C; Aw maggiore di 0,94; pH maggiore di 4,5; concentrazione di NaCl minore del 7-8%; assenza di nitrati; presenza di altre forme microbiche che, attraverso la loro attività metabolica, possono realizzare condizioni idonee alla crescita e moltiplicazione del patogeno anche in ambienti originariamente inadatti. Quando queste caratteristiche si verificano simultaneamente è possibile la crescita di Clostridium botulinum, pertanto si evince che la concomitante presenza di tutte queste caratteristiche nell’ambiente di sviluppo è estremamente rara, e in effetti la presenza di Clostridium botulinum negli alimenti risulta limitata così come l’intossicazione che ne deriva; tuttavia nonostante una bassa probabilità, la mortalità è elevata (30-60%). Clostridium botulinum è un agente di intossicazione alimentare a causa della produzione di tossine; queste tossine sono di natura proteica e sono fortemente acido resistenti per cui riescono a superare la barriera gastrica, sono resistenti a gli enzimi proteolitici gastriche ma sono termolabili (vengono distrutte in 10 minuti a 80°C). Queste tossine esercitano la loro azione patogena attraverso un azione neurotossica e sono considerate fra le sostanze più velenose al mondo. Queste tossine hanno potere antigenico e quindi stimolano la risposta anticorpale rendendo possibile la produzione di antisieri specifici e polivalenti quando inoculati in laboratorio; queste tossine sono prodotte intracellularmente in fase di moltiplicazione del microrganismo ed escrete nell’alimento in seguito a lisi cellulare al momento della sporulazione. Le tossine sono delle proteine e la più importante è la tossina A che ha un peso molecolare di 150000 Dalton, questa tossina una volta ingerita nell’alimento riesce a rimanere inalterata nonostante il basso pH dello stomaco, questo grazie a fattori proteici non tossici che rivestono la tossina e la proteggono dall’ambiente acido dello stomaco, superata la barriera gastrica la tossina raggiunge l’intestino dove si libera dei componenti non tossici. La tossina nella sua interezza presenta bassa tossicità quando è inattiva, nell’intestino viene idrolizzata dalla tripsina o altre proteasi batteriche o tissutali in due subunità: una catena leggera “L” di 50.000 Da e una catena pesante “H” di 100.000 Da, tenute insieme da un ponte disolfuro. Il processo di tripsinizzazione che avviene nell’intestino è quindi quello responsabile dell’attivazione dell’azione biologica della tossina, determinando l’aumento della tossicità della molecola che si eserciterà a livello del sistema nervoso; quindi nel lume dell’intestino, la tossina attivata si lega alla superficie apicale delle cellule epiteliali e mediante un processo di endocitosi e transcitosi è trasportata e rilasciata dalla superficie basolaterale delle cellule stesse nel torrente ematico (sangue). Una volta entrata a livello di circolazione generale, la tossina raggiunge il sistema nervoso periferico dove si trovano le cellule bersaglio rappresentate dai neuroni; in questo distretto, la tossicità della tossina si esplica secondo un modello a quattro fasi che prevede: inizialmente il riconoscimento ed il legame della subunità H ai gangliosidi, che sono dei recettori delle cellule nervose; successivamente mediante endocitosi la tossina viene inserita in vescicole e avviene l’internalizzazione nei neuroni, quindi grazie alla presenza di un ambiente acido nelle vescicole avviene la scissione del ponte disolfuro tra le due catene della tossina ed un riarrangiamento delle porzioni amminoterminali della catena H a formare dei canali trans-membrana nelle vescicole; attraverso questi canali la subunità L, a cui è dovuto l’effetto tossico, viene trasferita nel citosol dei terminali pre-sinaptici secondo un meccanismo chiamato traslocazione ; a questo punto la subunità L svolge un’ azione endopeptidasica cioè distrugge diverse proteine (chiamate “SNARE proteins”) poste a livello della sinapsi neuromuscolare e coinvolte nel rilascio dell’acetilcolina, un neurotrasmettitore che regola le contrazioni muscolari. Attraverso questa azione endopeptidasica le SNARE proteins vengono distrutte per cui non c’è il rilascio del neurotrasmettitore con conseguente blocco della sinapsi e paralisi flaccida muscolare. Il botulismo si manifesta dalle 18 alle 72 ore dopo l’ingestione dell’alimento contenente la tossina i primi sintomi sono nausea, vomito, cefalea ma in breve tempo la malattia peggiora e
della carne, di solito, non sono così elevate da riuscire ad inattivare il microrganismo o distruggere le spore. La prevenzione implica sempre una cottura adeguata e una conservazione degli alimenti a temperature idonee, evitando abusi di temperatura in fase di conservazione del prodotto; inoltre un alta qualità delle materie prime può aiutare a ridurre il rischio causata dalla tossinfezione da Clostridium perfringens. Alimenti cotti da consumare caldi devono essere mantenuti a temperature non permissive per la crescita, quindi superiori a 60°C fino al consumo che deve essere effettuati in tempi brevi oppure tali alimenti devono essere sottoposti a raffreddamento rapido con l’utilizzo degli abbattitori di temperatura e poi mantenuti sotto adeguate temperature di refrigerazione fino al momento del consumo. Muffe e Micotossine Le micotossine sono tossine prodotte da microfunghi e rappresentano un gruppo eterogeneo di sostanze chimiche a basso peso molecolare prodotte dal metabolismo secondario di microfunghi appartenenti principalmente ai generi Aspergillus, Penicillium, Fusarium e tossiche per l’uomo ed animali. Sono conosciute poco più di 400 micotossine di cui circa il 10% rischiose per l’uomo ed è importante dire che la stessa specie può produrre più micotossine (ad es. A. fumigatus ne produce 3 o 4) e la stessa micotossina può provenire da varie muffe (ad es. le Aflatossine possono essere prodotte da specie appartenenti ai generi Penicillium e Aspergillus). Le micotossine producono danno al consumatore per accumulazione cioè una singola dose di micotossina non è in grado di produrre un danno diretto al consumatore ma, siccome le micotossine vengono smaltite con difficoltà dall’organismo, il loro effetto si svolge per accumulazione cioè il consumatore nel tempo può accumulare all’interno del proprio organismo quantità via via maggiore di micotossine, consumando alimenti che sono contaminati con basse quantità di micotossine ma che nel tempo si accumulano nell’organismo e provocano danni. La produzione di micotossina avviene prevalentemente quando c’è lo sviluppo fungino e generalmente nei prodotti di origine vegetale, ed in particolare: cereali, semi oleaginosi, frutta, legumi, spezie, caffè e cacao. Sono necessarie precise condizioni ambientali per consentire al fungo di moltiplicarsi e di produrre la micotossina infatti i funghi si sviluppano molto bene sulle cariossidi essiccate dei cereali, soprattutto se ci sono condizioni di stoccaggio non idonee tipo con presenza di umidità. La contaminazione dei prodotti agro- alimentari per prima cosa avviene in campo poi è necessario che si verifichino le corrette condizioni climatiche di temperatura e umidità; anche le condizioni geografiche influenzano la produzione di micotossine (area continentale, tropicale); anche le pratiche di coltivazione (tecniche agronomiche) e di conservazione (insilamento, trasporto nelle stive) possono prevenire lo sviluppo di micotossine; ricordiamo che quando il fungo si sviluppa sull’alimento e produce la micotossina, l’alimento non è più risanabile e deve essere distrutto. Abbiamo anche dei fattori biologici oltre che ambientali a influenzare lo sviluppo di micotossine come la suscettibilità del raccolto e la compatibilità del vegetale con il fungo che produce la micotossina; le materie prime più suscettibili sono i cereali, i semi oleaginosi, la frutta, il caffè, il cacao e le spezie quindi da ciò ne deriva che i prodotti realizzati con materie prime di questo tipo possono produrre micotossine. Le micotossine più riscontrate negli alimenti sono l’Aflatossina B1, G1, B2, G2, l’Aflatossine M1 M2, Acido penicillico o Tossine tremorgeniche; queste non da sapere ma bisogna sapere che esistono diverse micotossine prodotte da diversi funghi e localizzate su diverse materie prime. Ci sono studi che indicano che il consumo di alimenti contaminati da micotossine può produrre un amplia varietà di malattie sia acuti che cronici, e queste patologie sono di difficile diagnosi; la malattia derivante dalla Aflatossine è denominata aflatossinosi che colpisce il fegato e rende l’ospite più suscettibile ad altre problematiche tipo infezioni. I funghi tossinogenici possono attaccare i vegetali in campo (le micotossine possono essere coinvolte nella fitopatia, avere cioè anche azione fitotossica) e possono anche contaminare le derrate in fase di raccolta e/o post-raccolta, in questo caso le micotossine si accumulano nelle derrate nella fase di trasporto, trasformazione e stoccaggio. Pertanto, possiamo suddividere le muffe tossinogene in muffe di campo che si possono trovare sulle piante già durante il periodo di crescita e prima del raccolto e muffe di stoccaggio che si sviluppano in fase di immagazzinamento dei prodotti dell’agricoltura (soprattutto cereali: mais, frumento, riso, orzo, segale, semi oleaginosi: arachidi, girasole, semi di cotone…, frutta secca, legumi, spezie, caffè e cacao) destinati ad uso alimentare umano (farine, pasta fresca, prodotti da forno e dolciari) o ad uso zootecnico (mangimi). Le muffe di campo si insinuano nella infruttescenza delle piante e le ritroviamo nelle granaglie già prima della raccolta; sono funghi cellulolitici appartenenti ai generi: Fusarium, Alternaria, Cladosporium, Epicoccum, Trichoderma e si sviluppano con un alto livello di umidità; lo sviluppo di muffe da campo è fortemente dipendente dalla stagionalità quindi da condizioni climatiche, regime idrico e dall’umidità dell’aria. Le muffe di stoccaggio si sviluppano durante la fase di stoccaggio perché nei silos la flora fungina di campo regredisce e sviluppa una nuova flora fungina: funghi meno cellulolitici, richiedono più bassa umidità (13%- 14%) e provocano acidificazione del substrato; queste muffe sono anche dette “da ferita” perché penetrano e colonizzano i grani se presentano lesioni; i generi delle muffe di stoccaggio sono Aspergillus e Penicillium e le Aflatossine sono le principali micotossine riscontate durante lo stoccaggio. Con queste muffe dobbiamo provvedere a controllare che lo stoccaggio avvenga in maniera controllata ed è necessario controllare le materie prime destinate alle trasformazioni in farine, in preparazioni a base di cereali e di mangimi. I fattori che influenzano la crescita dei funghi tossigeni e la sintesi delle micotossine nei prodotti, in preraccolta e in post-raccolta sono fattori: fisici, chimici e biologici. I fattori fisici sono: umidità temperatura, andamento climatico, danni meccanici, miscelazione e tempo; i fattori chimici sono: ossigeno, anidride carbonica, atmosfera controllata, pH e trattamenti chimici come fitofarmaci e preservanti; tra i fattori biologici abbiamo: l’interazione fungo-pianta (intesa come: parassitismo, stress della pianta, nutrizione minerale, traslocazione delle tossine), tossigenicità del fungo (può essere specifica o variabile), inoculo cioè la quantità di muffa che attacca il vegetale, presenza di insetti vettori e l’interazione con la microflora. Un tema molto importante è la contaminazione fungina delle farine perché le farine non vengono consumate come tali ma entrano a far parte di numerose lavorazioni tipo pasta o pane. Questa contaminazione parte dalle cariossidi già
contaminate, che verranno lavorate e private di pericarpio e perisperma che sono le parti più contaminate dal fungo; però possiamo avere contaminazioni successive come ad esempio nei locali di stoccaggio, nei silos o nei macchinari di lavorazione; la contaminazione è spesso più elevata delle granaglie a causa della macinazione che provoca frammentazione del micelio e dispersione delle spore; la micoflora si evolve in funzione della durata e condizioni di conservazione (umidità) infatti buone condizioni di conservazione: stoccaggio prolungato e condizioni di disidratazione implicano una riduzione delle specie fungine. La presenza di muffe in una farina contribuisce alla modificazione delle qualità chimiche e organolettiche, nonché igienico- sanitarie originali attraverso: aumento dell’acidità organica legata alla liberazione di acidi grassi, riduzione del valore nutritivo (utilizzo di nutrienti e vitamine) e formazione di micotossine (aflatossine e ocratossine); di conseguenza paste farcite e paste fresche possono essere contaminate da micotossine tramite contaminazione delle materie prime e inoltre negli ambienti di lavorazione possiamo avere condizioni non idonee o non infatti ad esempio il caldo umido del pastificio ne aiuta lo sviluppo di muffe, quindi di solito per evitare l’ammuffimento si applicano trattamenti chimici con aggiunta di additivi antifungini (sorbati), confezionamento in atmosfera modificata perché essendo aerobi sottraendo l’ossigeno limitiamo lo sviluppo fungino, inoltre la conservazione in modalità refrigerata ostacola lo sviluppo di muffe. Un altro alimento soggetto a contaminazione fungina è il pane che dopo qualche giorno di conservazione ammuffisce, quindi per evitare questo nella grande distribuzione il pane può essere confezionato con materiali di diverso tipo come il confezionamento a caldo con materiale termoretraibile forato (PVC); inoltre in Italia per inibire lo sviluppo di muffe è permesso l’utilizzo di etanolo al 2% sul peso secco esclusivamente per il pane in cassetta (pancarrè). Anche i prodotti dolciari possono risultare contaminati da muffe già all’uscita dai forni durante il raffreddamento e prima del confezionamento a causa di veicolazioni di polveri e materie prime (farine, cacao, spezie, frutta secca, latte in polvere, lievito) ma anche perché l’ambiente di lavorazione non è sterile, quindi le muffe presenti nell’aria possono cadere sul prodotto per poi moltiplicarsi e produrre muffa e anche in questo caso la legge ci permette di usare additivi chimici come acido sorbico e propionico e relativi sali e l’alcool etilico che pur non essendo autorizzato può essere utilizzato solo per veicolare aromi naturali come la vanillina. Anche i mangimi possono essere contaminati dalle micotossine per poi essere ingeriti dagli animali e poi le micotossine prodotte vengono trasferite nell’alimento che ne deriva; le principali vie di contaminazione fungina dei mangimi durante lo stoccaggio e la trasformazione sono: le materie prime, ambiente di stoccaggio, ambiente ed attrezzature di lavorazione, mezzi di trasporto ma anche di insetti e roditori. Se la materia prima è contaminata anche i mangimifici interni agli allevamenti risultano contaminati e le principali vie di contaminazione fungina sono: acqua (mezzo di trasporto e problema del ristagno), animali (ad es. conigli o polli: deiezioni nelle lettiere che diventano pericolo anche per mangimi) e insilamento cioè una tecnica che crea un ambiente sterile, anaerobio e con pH ~ 4,0, grazie a fermentazione lattica. Per questo problema possiamo intervenire già in campo utilizzando piante resistenti ad un determinato tipo di muffa, possiamo applicare trattamenti chimici (uso di pesticidi, fumiganti, fungicidi, antibiotici), possiamo applicare le corrette pratiche agronomiche e possiamo assicurare un rapido essiccamento quindi un abbassamento di umidità. A seguito della raccolta è importante mantenere l’essiccamento a determinati parametri evitando che l’umidità penetri di nuovo controllandola e mantenere un corretto stato igienico dei locali con le dovute procedure di pulizia e sanificazione. Riguardo le micotossine è importante sottolineare che possono resistere ai trattamenti termici come alla cottura a vapore, in autoclave o a pressione, delle materie prime che sono utilizzate per la preparazione dei mangimi; ma trattamenti termici adottati (per breve tempo a temperature estreme fino ai 600 °C) non riescono ad eludere completamente la presenza di micotossine o loro derivati ancora attivi, i quali possono persistere dopo la morte del micete, sebbene alla vista il prodotto alimentare non sembri mostrare alcuna traccia di muffa o degradazione organica (ad es: l’aflatossina delle arachidi resiste a 150°C per 30 minuti). Le strategie per l’eliminazione delle micotossine sono: metodi fisici, chimici e biologici; e in ogni caso questi metodi non garantiscono un successo al 100% e possono essere applicati per far in modo che un alimento contaminato o materia prima contaminata rientri nei parametri di legge, in effetti la quantità di micotossine è normata per legge, pertanto a volte questi trattamenti possono essere utilizzati per cercare di far rientrare il livello di micotossine entro il parametro di legge. La separazione fisica delle aflatossine da una determinata matrice alimentare comprende la pulizia ed il lavaggio, la separazione dei semi contaminati da quelli sani ed il trattamento con il calore (inattivazione termica), il successo di queste tecniche dipende dal livello iniziale di contaminazione e dalla distribuzione delle micotossine nei semi. Nei metodi chimici sono state utilizzate numerose sostanze che per la loro capacità di decontaminare derrate contaminate da micotossine, queste sono: Idrossido di Calcio, Metilamina, Bisolfito di Sodio, Ozono, Ammoniaca, Cloro. Nei metodi biologici bisogna minimizzare l’effetto delle tossine nell’animale modificando la sua dieta con aggiunta di sostanze chimiche che influenzano il metabolismo della micotossina nell’organismo dell’animale; Impiego di enzimi specifici in grado di degradare quelle micotossine che presentano nella loro struttura gruppi funzionali attaccabili, esempi di questo tipo sono le epossidasi e le lattonasi, in grado rispettivamente di eliminare il gruppo epossido presente in tutti i Tricoteceni e il gruppo lattone presente negli Zearalenoni; oppure l’uso di microrganismi, come i batteri, in grado di metabolizzare la tossina e di formare derivati non tossici; e la fermentazione alcolica, utilizzata in particolar modo per il vino. Queste separazioni possono essere applicate singolarmente, accoppiate o tutte e tre insieme ma comunque l’alimento o mangime che ne deriva non sarà di alta qualità.
HACCP
HACCP: Panoramica sulla Normativa Il primo atto normativo che ha reso obbligatoria in Europa l’applicazione del sistema HACCP a tutto il settore alimentare con la sola esclusione della produzione primaria, è stata la direttiva 43/93 CE sull’igiene dei prodotti alimentari del 14 giugno 1993. Questa direttiva è stata recepita in Italia con il decreto legislativo del 26 maggio 1997 n. 155, attualmente tali atti risultano
