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Sbobina Neurobiologia Molecolare del 17/11/ U1: riconosce giunzione al 5’ U2: riconosce zona ricca in poli-pirimidine e branch site sul 3’ (non alla giunzione 3’ introne) Tri-SNRP: ripiegamento, primo taglio, contemporanea formazione legame con OH 2’ A branch point mRNA degradati velocemente da estremità 3->5’ libere. Per non essere degradati devono avere 5’ coperta
- formazione messaggero maturo+ rilascio lariat a cappio Interazioni deboli tra RNA-RNA e RNA-proteine Lievito : introni bianchi, esoni arancio Quando ci sono questo tipo di sequenze, ci saranno particelle U1 che riconoscono particelle U2: si ha quindi la formazione dello SPLICESOSOMA e può avvenire un fenomeno di splicing. I primi 7 nucleotidi (al 5’) possono in realtà variare, ma ancora di più i nucleotidi al 3’: sono consensus lasse, quindi ci sono possibilità di riconoscimento alternative che portano alla formazione di uno SPLICESOSOMA instabile.
In questa immagine, lo splicing ha tagliato fuori l’ESONE 2. A partire dall’mRNA di partenza, si possono avere due situazioni:
- l’mRNA maturo contiene ESONE1+ ESONE2+ESONE
- l’mRNA maturo contiene solo ESONE1+ESONE3 (quindi ESONE2 non riconosciuto come ESONE)
- Giunzione 5’ INTRONE
- Zona di polipirimidine al 3’ INTRONE1 (seq. riconoscimento) : riconosciuta dai FATTORI ASSOCIATI A U2, che portano dentro U2.
- Giunzione 3’ INTRONE
- Giunzione 5’ INTRONE
- Zona polipirimidine al 3’ INTRONE
- Giunzione 3’ INTRONE Le giunzioni buone sono: giunzione 5’ degli introni 1 e 2, perché sono sequenze sempre riconosciute (sia con il primo tipo di splicing, che con il secondo); Ci sono sempre delle sequenze che vengono riconosciute un po' meglio e alcune un po' peggio, non c’è mai il 100% e lo 0%, è un processo dinamico, un continuum di riconoscimento, di fattori che si legano e si slegano: se il riconoscimento si basa su questo tipo di sequenze:
- se la sequenza è perfetta U1 si legherà, ma anche se si lega in maniera perfettamente complementare, avrà comunque un’affinità di legame dovuta a queste 7-8 basi (che non è una forza di legame così straordinaria): sono 7-8 basi che formano molte A e U e quindi si formano legami a idrogeno, che conferiscono una forza di legame facilmente reversibile. Tanto più la sequenza è simile alla consensus, tanto più facilmente U1 resterà legato per più tempo. Quindi abbiamo:
- GiUNZIONE 5’ INTRONE1 BUONA, quindi LEGAME AFFINE con U
- GIUNZIONE 3’ INTRONE2 BUONA, quindi LEGAME AFFINE CON U quindi U1 sulla giunzione 5’ dell’INTRONE1 e U2 sulla giunzione 3’ dell’INTRONE2 sono molto frequenti (cioè saranno legati in maniera relativamente stabile). Vuol dire che su 100 molecole, una certa % avrà U1 legata alla giunzione 5’ INTRONE1, una certa % avrà U legata alla giunzione 3’ INTRONE2.
In questo caso, entrambe le giunzioni sono sub-ottimali. Dal punto di vista bio-informatico si può prevedere quali sequenze saranno sempre riconosciute, quali saranno riconosciute meno volte statisticamente, sapendo che in queste ultime ci sarà SPLICING ALTERNATIVO. Il tipo di riconoscimento alternativo più diffuso : DIVERSE REGIONI 3’ UNITE ALLO STESSO 5’ (ALTERNATIVITA’ MAGGIORMENTE DIFFUSA) N.B. SVILUPPO CARATTERI SESSUALI DI DROSOPHILA dovuto interamente a fenomeni di splicing alternativo Se vogliamo spostare lo splicing alternativo in maniera regolata da un tipo di splicing all’altro, possiamo agire sui meccanismi di riconoscimento implicati nel riconoscimento di questi fattori: AUMENTANDO FATTORI, COPRENDO LE SEQUENZE ACCESSIBILI, FORNENDO STRUTTURA ALTERNATIVA ALL’mRNA si può regolare quanto lo splicing vada da ESONE1 a ESONE3, quanto invece da ESONE1 a ESONE2, e da ESONE2 a ESONE3. In figura: a sinistra abbiamo geni virali, e ovviamente i virus tendono a semplificare lo splicing; a destra abbiamo Drosophila.
Questo è il gene della Tropomiosina, componente fondamentale del citoscheletro ma anche del muscolo scheletrico. Può essere quasi considerata un modello tipico di complessità dell’organizzazione del gene, ma in realtà dovete immaginarla ancora più complessa di così. In genere è presente in tutte le cellule dove partecipa alla formazione del citoscheletro; nel muscolo striato ha una funzione assolutamente fondamentale e diversa da quella che ha in altri tipi di cellule. Vediamo che: la trascrizione parte sempre dallo stesso punto, ma la terminazione del gene avviene in maniera differente, è variabile. Al trascritto originale (arancione) corrispondono una serie di siti di splicing differenti nei diversi tessuti che andiamo a caratterizzare. Il trascritto primario è sempre lo stesso per quanto riguarda l’inizio di trascrizione ma può variare al 3’. L’mRNA maturo è differente per un serie di splicing alternativo che avvengono in maniera preferenziale nei diversi tessuti. Nel muscolo striato è presente questa isoforma (predominante, non nel 100% dei casi). Nei fibloblasti esistono due isoforme presenti in quantità simili. Nel muscolo liscio c’è un’isoforma prevalente diversa da quella del muscolo striato, simile a una delle due isoforme tipiche dei fibroblasti. Nel cervello ci sono eventi di splicing alternativi, e caratterizzazione diversa delle zone regolative. Questa figura ci dice:
- Allo stesso pre-messaggero corrispondono isoforme diverse
- Splicing regolato in maniera tessuto-specifica e ciclo-cellulare specifica. La capacità di tagliare e cucire estremità diverse dipende dal contesto cellulare e nucleare in cui pre-messaggero viene prodotto
- Quando si ha un prodotto di un gene (es. tropomiosina) che ha ruoli diversi, sia lo splicing che la regolazione della stabilità e della traducibilità del messaggero (che avviene in massima parte sulle zone trascritte ma non tradotte, 5’UTR e 3’UTR ) avvengono in modo differente da cellula a cellula, da tessuto a tessuto e rappresentano la diversa funzione che questi stessi prodotti hanno all’interno delle diverse cellule. In particolare il 3’ UTR, sede di regolazione della stabilità e traducibilità, è uguale e comune nella maggior parte dei tipi cellulari ma è diverso dove la proteina ha una funzione diversa e speciale rispetto alle altre cellule. In particolare nel SNC, molti geni hanno una regolazione diversa rispetto agli stessi geni in altri tipi cellulari: il cervello ha bisogno di un grandissimo numero di geni.
Quindi, l’importanza e variabilità dello SPLICING ALTERNATIVO è enorme nei neuroni, e un mal funzionamento dei suoi meccanismi causa molte patologie neuronali del SNC. Si tratta di meccanismi fini che permettono di spostare il 5% delle molecole di trascritto primario prodotte nel nucleo: di quelle normalmente il 4% fanno un’ isoforma e l’1% un’altra. Se quelle del 4% passano al 3% e quelle dell’1% passano al 2%, avrete degli effetti. La variazione così fine degli effetti dovuti a fenomeni di splicing alternativo può rispecchiarsi nei neuroni in patologie, mentre altre cellule (non nervose) lo stesso spostamento può avere effetti meno visibili o non avere effetti visibili / rivelabili sul funzionamento cellulare. Neurone fa talmente tante altre cose rispetto ad es. a stabilire relazioni con altre cellule vicine o formare in maniera organizzata strutture neurali del SNC, che la presenza differenziale di quelle proteine, dovute a quegli eventi di splicing alternativo variati, può avere un effetto apprezzabile, e presente alla base di tantissime patologie del sistema cognitivo e del sistema comportamentale. Il mal funzionamento di un evento di splicing, che di per sé avviene già in maniera molto lassa e variabile, consiste in differenze di splicing alternativo minime e non si riflettono in maniera apprezzabile sull’elettrofisiologia della cellula e sul suo funzionamento, ma sono apprezzabili solo dal punto di vista molecolare e si riflettono in patologie che conferiscono differenze molto visibili, molto gravi in alcuni casi, al livello cognitivo-comportamentale. Notare la differenza tra esoni e introni: gli esoni sono omogenei e relativamente piccoli ; gli introni molto più lunghi e variabili. U1 che si siede qui deve trovare U2 che può essere migliaia di basi a valle, e nel frattempo potrebbe trovare decine di U2 più vicini e organizzare lo splicing alternativi continui solo basati sulla distanza molto grande che esiste tra le giunzioni di splicing che devono essere tagliate e cucite. Questo succede per la stragrande maggioranza dei geni di mammifero. In molti vertebrati in generale, c’è difficoltà da parte dei fattori nel discernere, riconoscere e tagliare le
sequenze all’interno di questo mare di trascritto. Il tutto è complicato dall’enorme trascrizione basale (trascrizione di geni che non diventeranno proteine) che esiste nel nucleo soprattutto dei mammiferi e di molti vertebrati. Diventa difficile definire ESONE e INTRONE, la distinzione è labile. La cellula riconosce le sequenze introniche, facilitata dalla presenza di proteine che coprono continuamente l’RNA, da quando questo viene prodotto a quando viene degradato. Quindi le preteine proteggono l’RNA e mettono in contatto fattori lontani l’uno dall’altro. Quindi possiamo definire l’INTRONE dalla presenza di U1 e U2. Ma se U1 e U2 sono presenti contemporaneamente e sono distanti decine di migliaia di nucleotidi, come fa U1 a sapere di trovare U2 qua giù ed a entrarci in contatto? Grazie ad un’organizzazione di proteine sedute sul pre-messaggero stesso. Qui sotto vedete indicate le PROTEINE SR , ma in realtà si tratta di tante
proteine che fanno parte della FAMIGLIA DELLE hnRNPs che svolgono in questo ruolo.
Se un introne non è molto lungo, lo posso definire tale dalla presenza contemporanea di U1 e U2, quindi dal riconoscimento delle sequenze introniche Se un introne è molto lungo, il riconoscimento dei due fattori diviene molto complicato, quindi il riconoscimento può avvenire attraverso il riconoscimento delle sequenze esoniche.
Come può variare l’organizzazione? Questo è un trascritto primario che va incontro a due destini di splicing diversi in due diverse linee cellulari. Il pre-messaggero viene tagliato e ricucito a formare il messaggero maturo (verde scuro). Nell’altra cellula il pre-messaggero può non essere spliceato. Il default è essere spliceato perché il macchinario di splicing riconosce il sito di splicing. Nella maggior parte dei casi è il sito di splicing al 3’ che ha maggiore passibilità di essere regolato, riconosciuto o “competuto”. Il sito di splicing può essere facilmente competuto e legato da un repressore, che si lega al sito e non permette l’ingresso del macchinario di splicing, e quindi non si ha lo splicing. Se l’affinità del macchinario di splicing per questo sito è molto buona, il repressore farà più fatica ad impedire questo legame. Se l’affinità è meno forte, tanto più facile sarà l’azione del repressore che entra ad inibire questo tipo di legame. Se trovate sequenze sub ottimali, su queste sequenze sarà facile che si instaurino meccanismi di splicing alternativo anche regolati. Nell’immagine B c’è un sito di splicing brutto, e normalmente il macchinario di splicing non è in grado di entrare (entrerà in percentuale minima). Se c’è però un attivatore di splicing che normalmente è presente sulle sequenze ESE esoniche, la presenza dell’attivatore facilita l’ingresso del macchinario di splicing, catalizzare lo splicing e la formazione del messaggero, dal quale è stato tagliata la parte intronica.
Da un lato c’è il riconoscimento delle sequenze introniche: possiamo avere INIBIZIONE, tramite copertura, o DISPLACEMENT del macchinario di splicing da queste sequenze, per agire su quante di queste vengono tagliate nellle isoforme del trascrittoma finale. Dall’altro lato abbiamo la possibilità di aumentare l’efficienza di splicing tramite quei fattori presenti sulle sequenze esoniche.
