LO SPLICING DELL’RNA

L’RNA messaggero eucariotico prima di essere tradotto in proteina deve

essere modificato; esso infatti nel trascritto primario contiene sequenze

codificanti (esoni) intervallate da sequenze non codificanti (introni). in seguito

alla trascrizione gli introni devono essere rimossi e gli esoni legati per creare

l’RNA messaggero maturo. Per esone si intende qualunque regione che si

trova nell’RNA maturo indipendentemente dal fatto che sia codificante o

meno. Gli esoni non codificanti includono: le regioni non tradotte al 5’ e al 3’

come 5’ UTR, 3’ UTR; tutte le porzioni processate e stabili di RNA non

codificanti come (Xist) e le regioni che portano alla sintesi di RNA funzionali

come i microRNA.

Il numero di introni presenti in un gene può variare molto, da 1 a 50. Il numero

medio di introni è aumentato nel corso dell’evoluzione per cui è minore negli

organismi meno evoluti e maggiore in quelli più evoluti come l’uomo.

Spesso gli introni hanno dimensioni più grandi degli esoni. Generalmente un

esone ha una grandezza di 100-200 coppie di basi, mentre gli introni possono

essere lunghi anche 800 kilobasi ( 800'000 nucleotidi).

Nei batteri e nei fagi nella maggior parte dei casi la sequenza codificante è

continua e viene trascritta in una singola molecola di RNA. Negli eucarioti

avviene lo stesso, cioè anche se ci sono delle interruzioni, tutto il gene alla

fine è trascritto in un’unica molecola di RNA. Lo splicing dell’RNA rimuove gli

introni e lega insieme gli esoni convertendo così il pre-mrna in rna maturo.

Alcuni pre-mrna possono essere tagliati in modi diversi; quindi a partire da un

unico gene e quindi da un unico pre-mrna tramite splicing alternativo si

possono avere rna messaggeri maturi diversi che quindi origineranno

proteine differenti.

Come avviene lo splicing

I confini tra introni ed esoni sono marcati da sequenze nucleotidiche

specifiche all’interno dei pre-mrna; queste sequenze specificano dove avverrà

lo splicing. Il confine esone-introne, o meglio l’estremità 5’ dell’introne è

marcata da una sequenza chiamata sito di splicing 5’ che in genere inizia con

GU. L’estremità 3’dell’introne è marcata da una sequenza chiamata sito di

splicing 3’ che inizia generalmente per AG. All’interno dell’introne si trova

un’altra sequenza chiamata punto di ramificazione (di solito più vicina

all’estremità 3’ dell’introne) ed è seguita da un segmento di polipirimidina.

Anche questa sequenza presenta una A conservata. Se lo splicing avviene

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LO SPLICING DELL’RNA

L’RNA messaggero eucariotico prima di essere tradotto in proteina deve essere modificato; esso infatti nel trascritto primario contiene sequenze codificanti (esoni) intervallate da sequenze non codificanti (introni). in seguito alla trascrizione gli introni devono essere rimossi e gli esoni legati per creare l’RNA messaggero maturo. Per esone si intende qualunque regione che si trova nell’RNA maturo indipendentemente dal fatto che sia codificante o meno. Gli esoni non codificanti includono: le regioni non tradotte al 5’ e al 3’ come 5’ UTR, 3’ UTR; tutte le porzioni processate e stabili di RNA non codificanti come (Xist) e le regioni che portano alla sintesi di RNA funzionali come i microRNA. Il numero di introni presenti in un gene può variare molto, da 1 a 50. Il numero medio di introni è aumentato nel corso dell’evoluzione per cui è minore negli organismi meno evoluti e maggiore in quelli più evoluti come l’uomo. Spesso gli introni hanno dimensioni più grandi degli esoni. Generalmente un esone ha una grandezza di 100-200 coppie di basi, mentre gli introni possono essere lunghi anche 800 kilobasi ( 800'000 nucleotidi). Nei batteri e nei fagi nella maggior parte dei casi la sequenza codificante è continua e viene trascritta in una singola molecola di RNA. Negli eucarioti avviene lo stesso, cioè anche se ci sono delle interruzioni, tutto il gene alla fine è trascritto in un’unica molecola di RNA. Lo splicing dell’RNA rimuove gli introni e lega insieme gli esoni convertendo così il pre-mrna in rna maturo. Alcuni pre-mrna possono essere tagliati in modi diversi; quindi a partire da un unico gene e quindi da un unico pre-mrna tramite splicing alternativo si possono avere rna messaggeri maturi diversi che quindi origineranno proteine differenti. Come avviene lo splicing I confini tra introni ed esoni sono marcati da sequenze nucleotidiche specifiche all’interno dei pre-mrna; queste sequenze specificano dove avverrà lo splicing. Il confine esone-introne, o meglio l’estremità 5’ dell’introne è marcata da una sequenza chiamata sito di splicing 5’ che in genere inizia con GU. L’estremità 3’dell’introne è marcata da una sequenza chiamata sito di splicing 3’ che inizia generalmente per AG. All’interno dell’introne si trova un’altra sequenza chiamata punto di ramificazione (di solito più vicina all’estremità 3’ dell’introne) ed è seguita da un segmento di polipirimidina. Anche questa sequenza presenta una A conservata. Se lo splicing avviene

correttamente tutti gli introni vengono rimossi e gli esoni sono legati. se lo splicing non avviene in modo corretto potrebbero essere rimosso un esone. TIPI DI SPLICING

Splicing nucleare
Splicing di introni di tipo II
Splicing di introni di tipo I
Splicing di t-RNA di lievito SPLICING NUCLEARE un introne viene rimosso grazie a due reazioni di transesterificazione, in cui alcuni legami fosfodiesterici all’interno del pre-mrna vengono rotti e ne vengono formati di nuovi; in queste due reazioni due legami fosfodiesterici vengono rotti e due ne vengono formati per cui si tratta solo di uno scambio di legami che di per sé non implica un dispendio energetico. Durante lo splicing però è consumata ATP, non per la reazione chimica ma per il corretto assemblaggio e funzionamento del macchinario dello splicing. Meccanismo:
La prima reazione è avviata dal 2’OH della A conservata al punto di ramificazione. Questo gruppo si lega al fosfato della G conservata nel sito di splicing 5’. Come conseguenza viene tagliato il legame fosfodiesterico tra lo zucchero e il fosfato alla giunzione introne-esone all’estremità 5’ e l’estremità 5’ libera dall’introne si lega alla A del punto di ramificazione formando un legame 5’-2’.
Nella seconda reazione il 3’OH libero dell’esone 5’ lega un fosfato di un nucleotide al sito di splicing 3’. Questo comporta il legame tra i due esoni e il rilascio dell’introne che quando viene liberato ha una forma a cappio. SPLICEOSOMA Le reazioni di transesterificazione sono mediate dallo spliceosoma. Questo complesso è costituito da circa 150 proteine e 5 RNA e ha dimensioni simili a quelle di un ribosoma. I cinque RNA sono chiamati piccoli RNA nucleari (snRNA). Ciascuno di questi RNA forma complessi con proteine (ogni RNA

Nello splicing nucleare è coinvolto un complesso proteico chiamato spliceosoma. Lo splicing di introni di tipo I e II invece è detto self-splicing perché in alcuni casi gli introni si auto-processano con un meccanismo che non prevede l’intervento di complessi come lo spliceosoma quindi essi stessi si auto-rimuovono; quindi sono una specie di catalizzatori di questo processo anche se non si possono considerare enzimi in senso stretto. Gli introni capaci di self-splicing sono quelli di tipo I e II

Gruppo I: presenti negli RNA ribosomiali dei protozoi
Gruppo II: presente nei geni mitocondriali e cloroplastici. In questi casi è molto importante la sequenza per la rimozione senza l’intervento di fattori proteici. Nel caso degli introni di tipo II il processo è uguale a quello dello splicing nucleare con la differenza che non è coinvolto lo spliceosoma. gli introni di tipo I invece seguono un percorso diverso. Non hanno un residuo A nel sito di ramificazione, ma utilizzano una guanosina G. questa G è legata all’RNA e il suo gruppo 3’OH lega il sito di splicing 5’ ( lo stesso tipo di reazione che porta alla formazione del cappio nello splicing nucleare solo che qui non è coinvolto il 2’OH dell’A ma il 3’OH di G). la seconda reazione di transesterificazione poi procede uguale. Maturazione del trna La maturazione richiede una serie di passaggi: ci sono delle forcine sia al 5’ che al 3’ che devono essere tolte e quindi intervengono delle esonucleasi. Quindi avviene la
modifica delle estremità 5’ effettuata dalla RNasi P che identifica e taglia l’estremità 5’ rimuovendo così la forcina in più.
Modifica dell’estremità 3’. Dopo la rimozione della forcina (dalla RNasi E/F) si ha la rimozione di un tratto di trna dall’RNasi D. Poi avviene:
Aggiunta di una sequenza all’estremità 3’ che è CCA che è quella riconosciuta dall’amminoacil trna sintetasi per trasferire sul trna l’amminoacido corrispondente.
Modifica di una serie di basi come la formazione della pseudouridina.
La formazione di diidrouridina
Metilazione specifica e selettiva di alcune basi, in genere delle guanine

Rimozione di una sequenza interna (introne) si tratta di uno splicing vero e proprio anche se ha un meccanismo diverso dagli altri; è più che altro una modifica post-trascrizionale mediata da endonucleasi e RNA ligasi. L’introne nel pre-trna si appaia con l’ansa dell’anticodone mediante un appaiamento di basi CG. Gli introni possono trovarsi non solo nei trna degli eucarioti ma anche nei trna dei procarioti. La rimozione dell’introne richiede l’intervento di endonucleasi specifiche che riconoscendo grazie a delle strutture particolari ben precise le estremità dell’introne effettuano dei tagli lasciando un OH all’estremità 5’ e un’estremità 2’-3’ fosfato (il gruppo fosfato forma un intermedio ciclico che lega sia il 2’ che il 3’ della base). A questo punto ci sono una serie di altri passaggi. Una fosfodiesterasi specifica dovrà aprire l’anello 2’-3’ lasciando il fosfato sul 2’ e il 3’OH libero. Nel frattempo la struttura secondaria dell’RNA ha subito un ripiegamento che porterà le due estremità 5’OH e l’estremità 3’OH in adiacenza. L’intervento di una chinasi la quale utilizzando il fosfato presente sul 2’OH andrà a fosforilare il 5’OH del precursore del trna, sarà necessario per consentire poi ad una ligasi di agire mediante il classico legame tra il 3OH e il 5’ fosfato. A questo punto avremo il trna maturo dal quale è stato rimosso l’introne che viene rilasciato con un 2’- 3’ fosfato e un 5’OH. Struttura di un mRNA maturo di eucarioti L’mrna maturo presenza il cap al 5’, la coda poli-A al 3’. Presenta regioni trascritte ma che non vengono tradotte ma hanno un ruolo regolatorio quali 5’UTR e 3’UTR. Nella 3’UTR c’è il segnale di poliadenilazione. Dopo il cap 5’UTR c’è una codone di inizio che generalmente è AUG. Poi c’è la regione CDS che è quella codificante e termina con uno dei tre codoni di stop es. UAA. Come fa lo spliceosoma a riconoscere con esattezza i siti di splicing?? I siti legittimi di splicing si trovano vicino agli esoni. Il sistema di splicing è sul CTD della RNA polimerasi ed interagisce sequenzialmente con l’RNA neosintetizzato. Quindi l’RNA polimerasi mentre trascriva trasporta diverse proteine che servono per la maturazione dell’RNA. Queste proteine dette SR ricche in serina e arginina, riconoscono e si legano a delle sequenze all’interno degli esoni dette ESE (enancher di splicing esonico) e così reclutano U2AF al 3’ e U1 al 5’.

di poli adenilazione che negli eucarioti superiori è AAUAAA (si trova nel 3’ UTR). Poi una endonucleasi taglia il trascritto e la poli-A polimerasi sintetizza la coda poli-A. inizialmente vengono aggiunti circa 10 nucleotidi, poi la PABP lega la coda poli-A nascente, e questo simola la poli-A polimerasi ad aggiungere altri nucleotidi con adenina fino ad una lunghezza media di 200 nucleotidi. La presenza della coda poli-A è importante per la stabilità dell’MRNA, stimolo la sua uscita nel citoplasma e stimola l’inizio della traduzione aumentando l’efficienza di reclutamento della subunità 40S del ribosoma. Maturazione RNA ribosomiali Anche i precursori degli RNA ribosomiali subiscono delle modifiche. Essi derivano da un unico trascritto iniziale, l’RNA 45 S. questo RNA viene prima metilato su 100 dei suoi 14000 nucleotidi sul 2’ OH dei ribosi, e poi in seguito a scissione enzimatica vengono rilasciati il 28 S il 18 S e il 5,8 S. La scissione enzimatica richiede l’intervento di piccoli RNA nucleolari che insieme ad altre proteine costituiscono un complesso simile allo spliceosoma. Durata degli mRna La vita degli mRna dura da 15-20 minuti ad alcune ore a seconda del livello di adenilazione. Quando la coda poli-A diventa + corta di 15 basi viene tolto anche il CAP e l’RNA messaggero viene degradato. Possibili errori commessi durante lo splicing

Ci può essere il salto di un esone che avviene quando i componenti dello spliceosoma legati al sito di splicing 5’ di un esone, interagiscono con i componenti dello spliceosoma legati al 3’ non dell’esone successivo ma di uno più a valle.
Può succedere che i componenti dello spliceosoma riconoscono pseudo siti di splicing, che sono simili ai siti di splicing ma non sono siti di splicing. Questi pseudo siti si possono trovare all’interno di un esone e quindi durante lo splicing per errore viene tagliato anche un pezzo di esone insieme agli introni. Splicing alternativo A partire da un pre-mRna si possono ottenere + rna messaggeri maturi grazie all’unione in modo diverso degli esoni. Lo splicing alternativo sta alla base della diversità delle proteine nei vertebrati. Esistono almento 5 tipi diversi di splicing:

Lo splicing come lo abbiamo già descritto in cui vengono rimossi tutti gli introni e vengono uniti tutti gli esoni
Può esserci il salto di un esone
Può essere mantenuto un introne
Può esserci un esone esteso ( ovvero mantiene un pezzo di introne)
Si possono ottenere due trascritti a partire dallo stesso pre-mrna; in un ho degli esoni e in un altro ho altri esoni. Un esempio di esone esteso si ha con il gene che codifica per l’antigene T del virus SV40 della scimmia. Il gene per l’antigene T codifica due prodotti proteici: l’antigene T maggiore e l’antigene t minore. Le due proteine sono il prodotto di uno splicing alternativo del pre-mrna dello stesso gene. Il gene possiede due esoni e gli RNA maturi sono il risultato dell’utilizzo di due siti di splicing 5’ diversi. Nell’mRna che codifica il T maggiore l’esone 1 viene fuso direttamente con l’esone 2, eliminando tutto l’introne che si trova nel mezzo. Invece l’mRna dell’t minore si forma attraverso l’utilizzo di un sito di splicing 5’ alternativo. Quindi in questo secondo caso l’rna maturo include anche una parte dell’introne. Questo RNA così grande codifica per una proteina più piccola perché c’è un codone di stop all’interno dell’introne mantenuto. Entrambe le forme vengono prodotte in una cellula infettata con il virus SV ma hanno due funzioni differenti. La T maggiore induce la trasformazione e il reingresso nel ciclo cellulare mentre la t minore blocca la risposta apoptotica delle cellula avviate in questo processo. Il rapporto delle due forme prodotte è diverso a seconda dei livelli della proteina regolatrice SF2/ASF. Quando questa proteina è presente in grande quantità viene prodotto più antigene t minore. La proteina SF2/ASF è una proteina SR, che quando è abbondante si lega ai siti all’interno dell’esone 2 e aiuto l’assemblaggio dello spliceosoma in quel punto. Siti per l’aggiunta poli-A A partire dallo stesso pre-mRna posso ottenere due rna messaggeri maturi diversi se il trascritto primario conteneva ad esempio 2 siti di poliadenilazione; in questo caso posso ottenere un RNA maturo che ha la coda poli-A aggiunta ad un sito, e un RNA maturo che ha la coda aggiunta in un altro punto per cui a partire dallo stesso pre-mrna ottengo due RNA maturi diversi tra loro. Se ho un sito di poliadenilazione più interno e uno più esterno, l’rna messaggero maturo che deriva dall’unione della poli A al sito più interno sarà più corto dell’altro che ha la coda poli a legata al sito più esterno.

Via dipendente dalla deadenilazione
Via indipendente dalla deadenilazione La via indipendente dalla deadenilazione invece comporta la rimozione del CAP al 5’; a quel punto può intervenire una esonucleasi che funziona in direzione 5’-3’. Nella deadenilazione è la rimozione della coda poli A che porta alla degradazione dell’RNA messaggero. Quasi tutti gli RNA vengono degradati così. inizialmente la coda è accorciata fino a 50-60 nucleotidi (in modo lento) poi quando la coda è + corda il processo diventa + veloce. quindi una volta rimossa la coda si può avere una degradazione ad opera di una esonucleasi in direzione 3’-5’.
Un terzo meccanismo poco utilizzato negli eucarioti è la degradazione ad opera delle endonucleasi (che sono + utilizzate nei procarioti). Si potrebbe avere a prescindere dalla coda poli A, l’intervento di una endonucleasi che producendo un’estremità libera permette alle esonucleasi di degradare l’RNA. Gli RNA messaggeri degli istoni L’RNA messaggero degli istoni ha nella 3’UTR una forcina che viene riconosciuta e legata dalla proteina SLBP. Questo legame si ha durante la fase S e non fa avvenire la degradazione dell’RNA messaggero. Al termine della fase S invece, la concentrazione di questa proteina diminuisce e essa è allontanata dalla forcina e così l’RNA messaggero può essere attaccato dalle ribonucleasi (una endonucleasi rimuove la forcina, e una esonucleasi 3’ degrada l’RNA). La sequenza ricca di A e U presente nel 3’ UTR rende questa regione il bersaglio di una rapida degradazione. Questo fatto è stato dimostrato mediante un esperimento fatto sull’RNA messaggero della globina che è molto stabile. Si è visto che inserendo al terminale 3’ di questo RNA una sequenza ricca in A e U, questo RNA messaggero diventava altamente instabile e veniva degradato. le sequenze nel 3’ UTR nel complesso sono indicate dall’acronimo ARE’s che significa AU rich elements. Sono di due tipologie
AUUUA ripetuti + volte e separati da sequenze ricche di U
UUAUUUAUU ripetuto in tandem con differenze strutturali e differente cinetica di degradazione e deadenilazione.

In conclusione…

Gli m-RNA contengono nella loro sequenza le informazioni necessarie per la loro stabilità nella cellula
I segnali di destabilizzazione risiedono in regioni come la 3’UTR o anche la 5’UTR.
Molti elementi destabilizzanti richiedono per la loro attività che il messaggio sia impegnato nella traduzione
Ci sono proteine implicate nella attivazione o nel mascheramento di tali elementi cioè quando si tratta di sequenze che producono instabilità ci sono dei fattori che si legano a queste sequenze e richiamo esonucleasi, mentre nei messaggeri stabili non ci sono sequenze ricche di AU ma ricche di GC perché queste sequenze richiamano fattori che promuovono la protezione del messaggero con un meccanismo opposto. Per vedere dove ci sono dei motivi di instabilità si possono fare delle delezioni progressive e analizzare per ogni costrutto la stabilità del trascritto.

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