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Eleonora Santi 2018/2019 |

Microbiologia e immunologia

La cellula lunedì 25 febbraio 2019 09: Cellula: unità isolata dall’ambiente esterno da una membrana (ed una parete per i batteri) contente organelli immersi nel citoplasma. Tutta la materia vivente è composta da:

• Proteine
• Acidi nucleici
• Lipidi
• Polisaccaridi

I microrganismi sono esseri viventi monocellulari, aggregati cellulari o non strutturati e non organizzati (virus).

La cellula microbica può realizzare autonomamente tutti I processi vitali. I microrganismi si dividono in 6 gruppi principali:

1. Batteri (procarioti unicellulari)
2. Protozoi (eucarioti unicellulari)
3. Funghi (eucarioti pluricellulari)
4. Alghe (eucarioti pluricellulari)
5. Cianbatteri (procarioti unicellulari)
6. Virus (acellulari) In base all'organizzazione cellulare sono divisi in:

• PROCARIOTI: senza nucleo ne membrana cellulare. Il nucleoide è costituito da DNA libero nel citoplasma. Tutti sono microrganismi unicellulari si divisono In due categorie:
• Batteri
• Archeobatteri
• EUCARIOTI: c'è un nucleo delimitato da una sua membrana che racchiude I cromosomi. Comprendono sia microrganismi (protozoi, alghe e funghi) che organismi animali e vegetali. In comune presentano un citoplama ed una membrana plasmatica che delimita l'intera cellula. Si differenziano per dimensioni e per metodo di divisione cellulare (scissione binaria e mitosi). Tutti gli organismi derivano da un procariote primordiale non autonomo (progenitore comune). I procarioti sono le forme viventi più antichi, quando le risorse dell'ambiente sono calate si sono evoluti in parte in organismi eucarioti (autonomi del sintetizzare le risorse organiche). I batteri sono mobili ed unicellulari con:
• Una parete cellulare rigida composta da peptidi e polisaccaridi
• Una membrana plasmatica impermeabile
• Un DNA sparso nel citoplasma confinato in un nucleoide
• Ribosomi dispersi nel citoplasma

Gli organuli e le membrane interne della cellula lavorano in singergia fino al rilascio delle sostanze da espellere per esocitosi. Tutte le funzioni della cellula eucariote necessitano di energia per essere svolte: mitocontri e cloroplasti. (La cellula vegetale presenta anche una parete cellulare esterna alla membrana plasmatica, I vacuoli ed I:

• Cloroplasti: organuli che catturano l'energia e producono carboidrati tramite il processo della fotosintesi. La sintesi dei carboidrati avviene all'interno della doppia mebrana che racchiude lo stroma. La luce solare invece è catturata dalla clorofilla
• Plasmodesmi: sottili canali che connettono cellule adiacenti) Caratteristiche generali dei microrganismi mercoledì 27 febbraio 2019 12:
• Utili → (^) mutualistici Le due specie vivono assieme traendo benefici reciproci: l'animale fornisce nutrimento e fattori di crescita, il microrganismo aiuta la digestione degli alimenti (batteri ruminali), produce luce (batteri luminescenti nei pesci di profondità) o previene dai patogeni.
• Innocui → (^) commensali Solo una delle due specie trae beneficio, ma senza recare danno ne beneficio all'altro (es. Batteri della pelle)
• Dannosi → parassiti o patogeni Una delle due specie trae beneficio a danno dell'altra. Comprendono batteri, virus (parassita obbligato perchè privo di una struttura cellulare), protozoi o funghi che diventano patogeni se in grado di trasmettere una malattia. Il termine SIMBIOSI è un concetto generale che racchiude sia il mutualismo, che il commensalismo che il parassitismo. La simbiosi può essere esocellulare o intracellulare. Il simbionte produce metaboliti importanti per l'ospite o tossine da utilizzare come meccanismo di difesa dall'ospite. RUOLO DEI MICRORGANISMI
• Ruolo NOCIVO : agenti di malattie e contaminanti alimentari (l'alimento è un ottimo terreno colturale per I batteri che possono causare tossine e danni)
• Ruolo BENEFICO
• DECOMPOSITORI di materiale organico in metaboliti semplici ed utilizzabili
• FISSATORI DI AZOTO convertendo l'azoto atmosferico in azoto ammoniacale utilizzato dalla pianta (es. Rhizorium)
• CELLULOSO-DIGESTORI di microrganismi che digeriscono la cellulosa, l'amido e la pectina nei ruminanti
• ALIMENTARE per la produzione di formaggio, lievitazione, birra
• PRODUTTORI DI FARMACI come addiviti, stabilizzanti alimentari e supplementi
• DECONDAMINATORI degradanti prodotti di scarto trasformandoli in sostanze utili per la produzione di energia e lo smaltimento dei rifiuti
• APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE E IN INGEGNERIA GENETICA

Osservazione e studio dei microrganismi lunedì 11 marzo 2019 10: I microrganismi sono esseri invisibili ad occhio nudo. Per I batteri sono sufficenti I microscopi ottici, per I virus servono invece quelli elettronici. MICROSCOPIA OTTICA Sono microscopi composti da più parti intercambibili e sostituibili: lenti OBBIETTIVO e lente OCULARE → l'immagine ingrandita che si osserva è il risultato dell'ingrandimento delle due lenti insieme (es. oculare 10x + obbiettivo 40x = ingradimento di 400 volte). Questi microscopi hanno un blocco portante più lenti obbiettivo intercambiabili per rotazione (obbiettivi a secco). Ci sono poi obbiettivi ad immersione che, se usati a contatto con una goccia di olio di legno di cedro sul preparato da osservare, aumentano la risoluzione della lente. I microscopi più utilizzati sono:

MICROSCOPIO A CAMPO ILLUMINATO

Il più utilizzato in microbiologia. I dettagli sono poco visibili a causa della lunghezza d'onda della luce utilizzata. La risoluzione si può aumentare con la colorazione che però causa l'uccisione della cellula. Il campione è osservato grazie alla luce che passa dal condensatore al vetrino. Gli ingrandimenti tra cui scegliere sono 10x (intero campione), 40x (microrganismi grandi) e 100x (batteri, miceti e dettagli morfologici).

MICROSCOPIO IN CAMPO OSCURO

In questi microscopi il sistema di lenti è modificato: il condensatore fa in modo che la luce non raggiunga direttamente il campione, ma in modo diffuso ed obliquo → immagine luminosa su campo scuro. La risoluzione è 10 volte maggiore e consente di vedere I batteri più sottili. Lo svantaggio è che la luce non attraversando il campione non permette di vedere l'interno del microrganismo.

MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FASE

Consente di vedere I dettagli interni del campione perchè quando la luce raggiunge il vetrino questi vengono ritardati e si trovano "fuori fase" rispetto al resto dei raggi luminosi.

MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

La fonte luminosa è a luce UV → maggiore risoluzione perchè la lunghezza d'onda è dimezzata. Questo microscopio permette di vedere solo campioni fluorescenti (naturalmente o artificialmente). La colorazione artificiale avviene con anticorpi marcati o con coloranti.

MICROSCOPIO INVERTITO

Si usa per vedere le cellule infette da virus e non I batteri. La fonte luminosa si trova sopra il campione e non sotto. Permette di visualizzare cellule viventi o organismi contenuti in flask e non in vetrini.

STRUTTURA E FUNZIONE La cellula batterica procariote ha:

• Informazione genetica (DNA)
• Ribosomi
• Membrana citoplasmatica
• Molto spesso la parete cellulare
• Alcuni hanno capsula, appendici ed inclusioni citoplasmatiche STRUTTURE DI SUPERFICIE Capsula → parete → membrana citoplasmatica - Appendici CAPSULA (rara) La capsula è un manicotto mucoso che avvolge il batterio costituita da polisaccaridi e polipeptidi. Polisaccaridi e polipeptidi sono diettamente secreti dal batterio, poi si depositano all’esterno della parete formando il manicotto ben aderente. Se il materiale non aderisce bene alla parete si forma un GLICOCALICE che costituisce un biofilm che permette adesione su superifici solide e protezione dagli antibiotici al batterio. L’osservazione al microscopio della capsula è possibile solo dopo aver effettuato colorazione negativa (si colora lo sfondo). La capsula è un fattore di patogenicità dei batteri e serve per:
• Favorire l'adesione e la colonizzazione delle mucose
• Proteggere la cellula dagli antibiotici naturali (batteriofagi, colicine, complemento, lisozima)
• Proteggere il batterio dall'ingestione e dalla distruzione operata dal^ sistema fagocitario dell'ospite GUARDO LA SUA COLORAZIONE PARETE CELLULARE (in tutti tranne nei micoplasmi) Posta al di sotto della capsula, la parete riveste la membrana citoplasmatica e conferisce forma al batterio. È distrutta dal lisozima. Le sue funzioni sono di :
• Proteggere fisicamente la cellula dall'osmosi
• Conferire rigidità alla cellula È costituita da sostanze che si trovano SOLO nei microbi (diversa da tutte le altre pareti cellulari). In alcuni casi conferisce patogenicità ed è l'oggetto bersaglio degli antibiotici. La sua composizione è utilizzata per la distinzione in batteri GRAM+ e GRAM-

È costituita da ripetizioni di PEPTIDOGLICANO : un polisaccaride amminoacidico costituito da 2 aminozuccheri

ed una catena di 4/5 amminoacidi. I due aminozuccheri sono ad alto peso molecolare e si alternano per consentire l'aggancio delle catene peptidiche laterali formando il MURAMILPEPTIDE. Nei GRAM+ le catene peptidiche sono ulteriormente legate ad altre catene peptidiche. I batteri hanno un diverso numero di strati di peptidoglinano legati in modo diverso a seconda che siano + o - → nei GRAM+ I legami sono più forti e più numerosi

• GRAM POSITIVI → La parete è costituita da 20 strati di peptoglicano uniti da ponte amminoacidici. Tra le maglie della parete sono trattenuti materiali non mucopeptidici che vanno a costituire le COMPONENTI ANTIGENICHE responsabili della risposta anticorpale. la parete è costituita da 20 strati di peptidoglicano uniti da ponti amminoacidici (intreccio di fibrille). Il peptidoglicano occupa il 95% della parete, nelle maglie è trattenuta una piccola parte di altro materiale che va a conferire alla parete caratteristiche antigeniche (risposta immunitaria).
• GRAM NEGATIVI →il peptidoglicano che costituisce la parete è più sottile rendendola meno resistente agli insulti meccanici. La restante porzione di parete è costituita dalla PSEUDOCAPSULA, un riversimento esterno costituito da un doppio strato fosfolipidico con proteine, lipoproteine e lipopolisaccaridi. I lipopolisaccaridi esterni (40% della pseudocapsula) comprendono gli antigeni, il core polisaccaridico ed il lipide A che rende I batteri gram negativi tossici (endotossine). Nella parete di tutti I batteri ci sono enzimi autolitici che degradano alcune parti di essa affinchè il batterio possa dividersi per moltiplicarsi. Alcune colonie batteriche invecchiando perdono la gram-positività a causa del mal controllo di questi enzimi idrolitici → troppa distruzione della parete ed assottigliamento. È possibile distruggere la parete con il LISOZIMA:
• I gram positivi diventano PROTOPLASTI;
• I gram negativi mantengono il manicotto della pseudocapsula mantenendo una certa resistenza alla lisi diventando SFEROPLASTI.

BATTERI PRIVI DI PARETE → I MICROPLASMI sono pleomorfi (senza una forma) ed hanno una membrana

plasmatica ricca di steroli per proteggersi dalla lisi dovuta dall'osmosi. Gli ALOFILI sono microrganismi che vivendo in luoghi ad alta concentrazione salina, non necessitano di una parete per la protezione dall'osmosi. Tutti I batteri privi di parete sono più fragili: non hanno una forma, si moltiplicano più lentamente; ma sono più resistenti nei confronti degli antibiotici che attaccano la parete. GUARDO LA COLORAZIONE MEMBRANA CITOPLASMATICA Separa il citoplasma dall’ambiente esterno ed ha una struttura simile a quella degli eucarioti. È costituita da un doppio strato fosfolipidico e da proteine di superficie e transmembrana. La composizione è invece diversa in quando NON CONTIENE STEROLI, ma può contenere OPAINOIDI che rendono la membrana più solida → molecole esclusive del mondo microbico. Le funzioni della membrana sono:

• Trasporto di molecole all'interno/esterno della cellula Permeabilità selettiva: la cellula sceglie che sostanze nutritizie assorbire eliminando all'esterno le sostanze di scarto del metabolismo; Trasporto attivo recettore-mediato: sulla membrana ci sono dei recettori (proteine) che attirano le molecole che la cellula vuole assorbire Diffusione passiva per osmosi
• Secrezione di enzimi extracellulari
• Respirazione e fotosintesi a livello dei mesosomi (ripiegature della membrana che supportano gli enzimi del metabolismo energetico)
• Regolazione della riproduzione: le proteine si legano al DNA replicato per favorire la separazione dei cromosomi neoformati
• Sintesi della parete cellulare: polisaccaridi e polipeptidi sono sintetizzati nel citoplasma, poi sono trasportati ed assemblati all’esterno.

SPORE Alcuni Gram positivi hanno nel citoplasma spore in grado di resistere ad agenti chimici e fisici. I batteri in grado di produrre spore si dicono SPORIGENI: in caso di necessità si trasformano in queste strutture quiescenti e mantenersi senza crescere nè riprodursi anche per lungo tempo. SPORULAZIONE: produzione di una sporta da parte di un batterio. Quando le condizioni di vita non sono più ottimali i geni SPO sintetizzano proteine sporulatrici. La membrana cellulare si invagina ed ingloba al suo interno DNA e ribosomi → CORE. Da questo core rivestito di membrana viene estratta l’acqua e prodotto l’acido dipicolinico per conferire resistenza al calore. GERMINAZIONE: al ritorno di condizioni ambientali favorevoli il batterio torna in fase vegetativa. Si ha l’assunzione di acqua e l’eliminazione di acido dipicolinico, la sintesi di RNA e la disintegrazione degli involucri di protezione della spora. Le endospore sono resistenti a calore e soluzioni alcoliche e sono in grado di resistere anche per moltissimi anni. Possono essere distrutte solo da tinderizzazione. Presenza, forma e dimensione della spora nel corpo batterico permettono di identificare il tipo batterico: ▪ BATTRIDI: spora equatoriale grande quanto il batterio ▪ CLOSTRIDI: spora equatoriale più grande del batterio ▪ PLETTRIDI: spora terminale grande più del batterio. Le spore sono visibili al microscopio ottico con colorazione specifica. Gli sporigeni sono Bacillus e Clostridium e spesso di trovano nel terreno (e sono patogeni). Batteri: riproduzione mercoledì 13 marzo 2019 11: La riproduzione è sempre asessuata e avviene per SCISSIONE BINARIA: cellula madre identica a quelle figlie. Eccezioni: lieviti → gemmazione; batteri filamentosi → frammentazione Il tempo di replicazione dipende dal tipo di batterio: o (^20) - 30 minuti → coltivazione in lab e condizioni ottimali o (^) 18 ore → micobatteri in laboratorio I batteri sono visibili ad occhio nudo solo quando organizzano una colonia di almeno 10^6 - 107 cellule: 18-24 ore nel primo caso, 30-40 giorni nel secondo. La scissione binaria avviene in fasi successive:

1. Duplicazione del cromosoma: ogni cellula figlia ha lo stesso patrimonio genetico della "madre"
2. Allungamento della cellula ed estensione della membrana plasmatica a livello del mesosoma
3. Formazione del setto trasverso
4. Separazione in due cellule figlie identiche (un cromosoma per cellula)
5. Rstringimento anulare della parete e formazione della parete trasversa
6. Separazione fisica delle due cellule figlie. [I lieviti si riproducono per gemmazione: si forma una protuberanza nella cellula madre che aumentando di volume arriva a staccarsi creando un nuovo individuo. Sulla cellula madre restano visibili I segni della cicatrizzazione]

In laboratorio, I batteri si possono moltiplicare sia in terreni solidi che in terreni liquidi. Per riuscire ad osservare il movimento dei batteri su usa il terreno di agar molle che essendo più lasso lo permette. Se il movimento non è permesso, la crescita della colonia si osserva solo in corrispondenza del punto di inoculo; Se il batterio è flagellato si osserva una patina data dall’aggrovigliarsi delle appendici, se mancano invece si osserva tutto torbido.

• Colonie H^ con flagelli^ →^ pellicola frastagliata
• Colonie O senza flagelli → patina opaca
• Colonie S con capsula --> superficie liscia (smooth)
• Colonie R senza capsula --> superficie rugosa (raf) In terreno liquido si riesce ad osservare la curva di crescita dei batteri. Contando il numero di batteri cresciuti in un determinato intervallo di tempo si ottiene la : CURVA DI CRESCITA È un grafico semilogaritmico che indica le 4 fasi di crescita: ognuna diversa a seconda del tipo di microrganismo in coltura e delle caratteristiche ambientali/nutrizionali.

1. Fase LAG : Finito l’inoculo il numero rimane stabile perchè il batterio deve adattarsi al nuovo substrato. La fase LAG diminuisce se l’inoculo avviene da un batterio prelevato al momento di crescita logaritmica. È più lunga se invece il prelievo avviene in fase stazionaria.
2. Fase LOG : La crescita/riproduzione è costante → minimo tempo di replicazione e crescita esponenziale.
3. Fase STAZIONARIA : Il numero di cellule morenti e di cellule in divisione sono in equilibrio → rallentamento della crescita perchè si modifica il terreno di coltura, si riduce lo spazio biologico ed esauriscono le sostanze nutritive (plateau di crescita)
4. Fase di MORTE : I batteri muiono con ritmo logaritmico. La crescita batterica è influenzata da:

• In NATURA: I batteri sono diffusi ovunque e devono adattarsi a vivere in ogni condizione
• In^ LABORATORIO: necessità di riuscire a ricreare la miglior condizione speficia per il singolo tipo di batterio. Lo studio dei batteri in laboratorio serve per isolare un patogeno a fine identificativo per la giusta cura antibiotica o per crescere elevati batteri da "struttare" (birra). Solo in laboratorio è possibile ottenere la crescita microbica ottimale: minimo tempo di replicazione. Ad occhio nudo I batteri sono visibili solo se presenti in colonie.

• OSSIGENO

RESPIRAZIONE = ottenimento dell’energia con l’ossigeno con l’enzima catalasi. FERMENTAZIONE = produzione di energia in assenzia di ossigeno o (^) AEROBI OBBLIGATI: (catalasi positivi) Crescita SOLO in presenza di ossigeno o (^) ANAEROBI OBBLIGATI: (catalasi negativi) vivono SOLO in assenza di ossigeno come ad esempio I batteri intestinali. Sono ossigeno intolleranti e anche la minima presenza del gas è in grado di ucciderli. In laboratorio la completa assenza di ossigeno è garantita dalla coltivazione in cappe per anaerobiosi sigillate e riempite di azoto o altri gas. o (^) ANAEROBI FACOLTATIVI: (catalasi positivi) vivono ANCHE senza ossigeno, ma preferiscono crescere in ambiente aerobico. o (^) MICROAEROFILI: (poca catalasi positiva) vivono MEGLIO a basse concentrazione di ossigeno (2-18%) perchè non hanno abbastanza catalasi per scindere l'acqua ossigenata.

• UMIDITÀ OSMOFILI = si moltiplicano in condizoni ipertoniche (sia saline che zuccherine) ALOFILI = tollerano alte concentrazioni saline L’acqua influenza l’osmosi e la concentrazione salina. I micoplasmi, dato che sono privi di parete, devono stare in ambienti a pressione osmotica adeguata in modo da non richiamare troppa acqua all’interno. CELLULE QUIESCENTI Bloccano le proprie attività metaboliche anche per lungo tempo. Cosi si possono conservare ceppi:
• In frigorifero (4°)
• Liofilizzati: essicatura sottovuoto di materiale congelato. Poi messo in sospensione con latte, albumine e zuccheri.

Batteri: coltivazione mercoledì 20 marzo 2019 11: Per identificare e studiare un batterio è necessario ISOLARLO e COLTIVARLO. Le indagini sono fatte su colture pure → composte da una sola specie di microrganismo. Necessario:

1. Eliminare i contaminanti
2. Usare materiale sterile
3. Ottimali condizioni ambientali Procedura per arrivare ad una COLTURA PURA :
4. Campionare riducendo al minimo i contaminanti
5. Inoculare in terreno solido e sterile
6. Rispettare le condizioni di coltura ottimali
7. Prelevare dalla colonia isolata la coltura pura
8. Da strisciamenti successivi purificare la coltura su nuovo terreno
9. Rinnono e conservazione dei ceppi puri su piastre TERRENI DI COLTURA I principali costituenti dei terreni sono:

• Peptone → proteine idrolizzate
• Carne
• Estratto di carne e di lievito
• Sangue defibrinato (o plasma, siero)
• Gelatina
• Agar → se voglio un terreno solido, metto il terreno in autoclave perchè l’agar si solubilizza ad alta temperatura
• Sali minerali → nutrimento I terreni sia solidi che liquidi devono essere sterilizzati in autoclave per 20 minuti a 121° al fine di eliminare ogni microrganismo già presente. L'alternativa per la sterilizzazione in autoclave per I soli terreni liquidi è la filtrazione (poco utilizzato in batteriologia perchè più costoso). I contaminanti ambientali indesiderati crescono bene nei terreni di coltura base, mentre I patogeni richiedono un terreno più arricchito quindi difficilmente daranno "fastidio" alla coltivazione. TERRENI DI COLTURA DI BASE
• Brodo di carne → acqua + proteine + carboidrati + enzimi + integratori + vitamine
• Brodo nutritivo → acqua + sale + peptone + estratto di carne se aggiunto di agar diventa agar nutritivo
• Agar-sangue → agar nutritivo + sangue defibrinato (rosso intenso)
• Agar-cioccolato →agar sangue + enzimi che lisano I globuli rossi (l'emoglobina viene liberata) In questi terreni crescono tutti I batteri, ma anche I contaminanti ambientali indesiderati.

Procedimenti per l'isolamento e l'identificazione dei batteri in laboratorio:

1. SEMINA

PER STRISCIAMENTO CONTINUO

Con ferro ad ansa riutilizzabile. Con l’ansa prelevo la colonia e la poggio sul nuovo agar. Poi striscio senza mai premere ne staccare il ferro a zig-zag. Poi chiudo la piastra e la capovolgo prima di metterla in incubazione. Ad inizio linea avrò un ammasso di batteri, alla fine le colonie ben isolate.

PER SPATOLAMENTO

Con spatola di plastica o metallo con impugnatura e parte terminale piegata a 90°. Con la spatola prelevo e cominicio a spatolare sul nuovo terreno su tutta la superficie. Si può prelevare anche da terreni liquidi versando il contenuto della pipetta e poi spargendola con la spatola. Dopo la chiusura ed il ribaltamento si incuba. Si osserva una distribuzione omogenea del batterio senza aree isolate.

PER INFISSIONE

Con un oggetto appuntito. Si infila in un terreno solito contenuto in una provetta (NON piastra). L’ago viene poi rimosso e la crescita si vedrà attorno al punto di infissione.

PER INCLUSIONE

Si prepara il terreno solido, poi si versa sull’agar tutto il preparato. La colonia si svilupperà non solo sulla superficie del terreno, ma in tutta la massa. L’inclusione viene fatta quando l’agar uscito dall’autoclave non è ancora solito ma arriva a 40-50°.

PER STRISCIAMENTO A QUADRANTI

Con l’ansa divido idealmente in 4 quadrando e striscio il campione prelevato a zig-zag in un solo quadrante. Dopo aver sterilizzato l’ansa ripeto per ogni quadrante. Dopo l'incubazione si osserva nel primo quadrante tantissime colonie confluenti, sul secondo ancora troppe, sul secondo un po' meno e sull'ultimo delle colonie isolate utilizzabili per la coltivazione della linea pura. COLONIA = cellule cloni derivanti da un solo microrganismo tutte identiche. Il prelievo si può fare da qualsiasi liquido biologico con diversi tamponi di trasporto, provette sterili o siringhe. Dopo il prelievo si procede col trasporto in laboratorio e la semina su terreno adatto. Dopo la crescita si fa il prelievo di una singola colonia e generalmente la singola colonia prelevata sul terreno di base viene trasferita in un terreno liquido per consentirne una maggiore crescita per prove successive (con agitatori se batteri aerobi).

2. IDENTIFICAZIONE Partendo da una coltura pura si valutano: o (^) Caratteristiche MORFO-COLTURALI del batterio isolato Aspetto, forma e dimensioni della colonia, consistenza, presenza di capsula o flagelli, comportamento verso le colorazioni. o (^) COMPORTAMENTO su terreni selettivi e differenziali

1. (^) Caratteristiche BIOCHIMICHE Produzione di enzimi, comportamento verso l’ossigeno, modalità di produzione dell’energia. Le prove verificano se il batterio è in grado di ottenere un prodotto in presenza/assenza di un dato enzima. 2. MOBILITÀ
2. (^) Caratteristiche IMMUNOLOGICHE Capacità di scatenare una reazione su un organismo.

Il batterio può essere riconosciuto come un’antigene → TEST

L'agglutinazione rapida → Si stempera la colonia con un siero iperimmune per quel batterio. Se ci sono anticorpi il batterio si agglutina. L'immunofluorescenza → Si utilizzano composti fluorescenti per identificare il legame Ag-Ab. L’Ab si lega alla sostanza. Se si vede il fluo è perchè l’anticorpo ha riconosciuto il batterio come suo antigene. La tecnica ELISA → Con un enzima che cambia il colore. Si utilizza la piastra a 96 pozzetti per rilevare la risposta dell’anticorpo ad un dato antigene. Metto l’anticorpo sul fondo del pozzetto. Il giorno dopo svuoto la piastra e ci inoculo la soluzione batterica. Se il batterio è riconosciuto come Ag questo si attacca al fondo della piastra insieme all’Ab. Più il colore è intenso più antigene è presente. La tecnica AGID (agargel immunodiffusione) → con una piastradi agar resa a pozzetti. In ogni pozzetto inoculo l’anticorpo o l’antigene. Se i due sono specifici migrano uno verso l’altra incontrandosi a circa metà strada. Sul terreno si osserveranno le bande di migrazione.

4. Tipizzazione FAGICA Quale tipo di fago attacca il batterio. La tipizzazione fagica permette il riconoscimento del microrganismo tramite I diversi batteriofagi che possono intervenire → Ogni tipo di batterio è sensibile al suo specifico fago. Si semina il ceppo su una piastra petri con agar. Si inoculano gocce di sospensione fagica e dpo l’incubazione di osserva la crescita ed i punti in cui il fago ha prodoto lisi.
5. (^) Tecniche MOLECOLARI Le tecniche molecolari permettono di identificare il genoma del batterio: - PCR a scopo diagnostico - Plasmid fingerprinting: si fa solo per I batteri perchè solo loro hanno I plasmidi come "conservante" di DNA speciale. Si taglia un plasmide e si riesce a capire di che batterio si tratta. - RAPD: il DNA è amplificato causalmente, le bande vengono poi osservate e si confrontano - Ibridazione con sonde a DNA marcato - Caratterizzazione del DNA ribosomiale batterico - NGS

ESAME CON COLORAZIONE Oltre a forma, dimensioni, mobilità,.. mostra anche comportamento col colorante e componenti batteriche. → utile per l’identificazione. La colorazione avviene in fasi:

1. DISTENSIONE Il materiale viene stemperato schiacciandolo tra 2 vetrini. 2. ESSICAMENTO il materiale disteso viene fatto essicare con un blando riscaldamento col fiamma Bunsen. 3. FISSAZIONE Il materiale viene fatto aderire al vetrino con fissanti chimici o fisici (passaggio dei vetrini su becco Bunsen → fase 2 e 3 coincidono 4. COLORAZIONE Semplice o differenziale (due colori) 5. ASCIUGAMENTO Con carta bibula o calore moderato 6. OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO Si copre il vetrino con porta-oggetti e si osserva. Se si utilizza un microscopio ad immersione si aggiunge una goccia di olio di cedro. COLORAZIONI CARICA del colorante = carica che il principio attivo del colorante acquisisce dopo che si solubilizza. I coloranti ACIDI → in soluzione ionizzano dando carica elettrica negativa (rosso congo). Sono affini col CITOPLASMA. I coloranti BASICI → in soluzione ionizzano dando carica elettrica positiva (blu di metilene, cristalvioletto). Sono affini con il NUCLEO Per i batteri lavorano meglio i coloranti basici perchè non hanno un nucleo ben delimitato, ma è disciolto nel citoplasma. METACROMASIA = il colorante da un colore da quello proprio. Es. Bacillus Antrachis: corpo blu, capsula rossa con Blu di Loffler. MORDENZANTI = facilitano la fissazione del colorante al batterio. Modalità di colorazione:

• SEMPLICE Si utilizza un solo colorante → blu di metilene, fuxina, cristalvioletto. Si osserva morfologia, dimensione e disposizione dei batteri. Il colorante colora il batterio (colorazione POSITIVA) o ciò che lo circonda (colorazione NEGATIVA) per vedere meglio la capsula. Distensione → essicamento → fissazione → colorazione → incubazione (1-5 minuti) → lavaggio → asciugatura
• (^) DIFFERENZIALE Più coloranti e reagenti per osservare parete, flagelli, capsula e spore.
• Colorazione di GRAM o (^) Stesura, essicamento e fissazione o (^) Colorazione con violetto di genziana per 2-3 minuti o (^) Lavaggio e trattamento con ioduro di potassio per 2 min → TUTTI I BATTERI DIVENTANO VIOLETTO o (^) Decolorazione con mix alcol-acetone per 1 min o (^) Lavaggio con acqua → I Gram NEGATIVI PERDONO IL COLORE o (^) Colorazione con fuxina per 1 min → TUTTI DIVENTANO ROSSI o (^) Lavaggio ed asciugatura → I GRAM - SONO ROSSI - I GRAM + SONO VIOLETTI Questa colorazione permette di classificare i batteri a seconda della colorazione acquisita.

MECCANISMO : lo strato di peptoglicano della parete è diversa nei due tipi batterici (spessore, porosità). Dopo la decolorazione con alcool i pori del peptoglicano dei gram positivi si rimpiccioliscono ed il colore violetto viene trattenuto. Nei gram negativi invece lo spessore è minore ed i pori più grandi, il colorante esce e la parete riesce a colorarsi di rosso con il nuovo colorante.

• Colorazione per BATTERI ACIDO-RESISTENTI (Ziehl Neelsen) Identificazione dei MICOBATTERI → trattengono la fuxina e resistono al decolorante acido/alcolico. o (^) Stesura, essicamento e fissazione del materiale o (^) Colorazione con fuxina per 5 min scaldando lentamente o (^) Lavaggio con acqua → TUTTI I BATTERI SONO ROSSI o (^) Decolorazione con acido+alcol per 30s o (^) Lavaggio con acqua → I batteri NON acido resistente perdono il colore o (^) Colorazione con blu di metilene per 1min o (^) Lavaggio ed asciugamento → ACIDO-RESISTENTI ancora IN ROSSO, NON ACIDO RESISTENTI IN BLU MECCANISMO : i micobatteri hanno più lipidi e sono generalmente difficili da isolare. Tra i lipidi ci sono anche cere e steroli (resistenti a vaccini e complemento). La decolorazione acida altera la parete dei batteri “normali” allontandando la prima colorazione. Nei batteri acido-resistenti invece la fuxina fissata col calore non riesce ad estrarsi e quindi rimangono del primo colore. o (^) Colorazione di Ziehl Neelsen MODIFICATA Identificazione delle BRUCELLE → parzialmente acido-resistenti Rispetto alla normale Ziehl Neelsen si utilizza una fuxina più diluita ed un decolorante meno acido. Le brucelle appaiono come dei coccobacilli ROSSI, gli altri microrganismi blu.

1. Colorazione delle SPORE Identificazione delle SPORE. o (^) Stesura, essicamento e fissazione del preparato o (^) Colorazione con verde di malachite per 30s con fiamma per sviluppare vapori (penetrazione nelle endospore) o (^) Lavaggio con acqua → TUTTI I BATTERI SONO VERDI o (^) Colorazione safranina per 30s o (^) Lavaggio e asciugamento → SPORE VERDI - FORME VEGETATIVE ROSA-BRUNO