microbiologia
sterilizzazione
processo mediante cui avvine l'uccisione di
tutte le forme di vita (sia virus che batteri) metodi
calore
per tutti gli organismi esiste una T max oltre la
quale la crescita è impossibile (proteina
degrata o stuttrure cellulari distrutte)
calore umido
maggiore efficacia, una riduzione del n di
organismi maggiore
quello del vapore saturo (cioè a 100°C o più
con pressione), che trasmette il calore
attraverso l’umidità.
Un’autoclave sfrutta vapore saturo ad alta
pressione
è in grado di uccidere anche le ENDOSPORE
batteriche
sono forme di resistenza, con pareti spesse e
disidratate e con sostanze speciali che aiutano
a conferire stuttura stabilità al calore
CONDIZIONI OPERATIVE
0,5 atm, 111°C, 30 min
1 atm, 120°C, 15 min
è L'ELEVATA TEMPERATURA AD UCCIDERE I
MICRORGANISMI CHE PUO ESSERE
RAGGIUNTA QUANDOIL VAPORE è POSTO IN
PRESSIONE
fasi
Innalzamento della temperatura e
formazione del vapore (100°C).
Rimozione aria e saturazione con
vapore.
Chiusura della valvola e innalzamento
della pressione (1atm)
Raggiungimento temperatura di
sterilizzazione (121°C) e mantenimento
per tempo stabilito (15min)
Rimozione vapore, calo temperatura e
pressione
calore secco
quello del forno ad aria calda, che usa l’aria per
trasmettere il calore.
STUFA
vetreria o struenti metallici
CONDIZIONI OPERATIVE
150°C, 3h
160°C, 1h
filtrazione
metodo per gas e liquidi termolabili
viene passato in un filtro con pori
sufficentemente piccoli da intrappolare
qualsiasi cellula presente, di 0, 22 o 0,45
micrometri
esempi
filtri HEPA usati per purificare l'aria in ambienti sterili
trattenendo il 99,97% delle particelle
membrane filtranti
filtri porosi usati per sterilizzare soluzioni
termolabili servono alla sterilizzazione di liquidi
Realizzate in materiali come nitrocellulosa,
policarbonato
radiazioni
i raggi UV, X e Y sono efficaci agenti che
distruggono la crescita microbica ogni energia ha un modo di azioen differente
2 tipologie
non ionizzanti
Non rompono direttamente i legami chimici, ma
possono danneggiare il DNA o altre strutture.
raggi UV disinfezione di aria e superfici
ionizzanti
Hanno energia sufficiente per ionizzare le
molecole: cioè, possono strappare elettroni
dagli atomi.
rottura dei legami chimici, mutazioni genetiche
e formazione di radicali liberi
x e Y
Disinfezione: Processo rivolto alla distruzione di
forme vegetative
(non di endospore), normalmente di patogeni,
presenti in un
determinato materiale inanimato (superfici).
coltivazione in laboratorio
Per coltivare i microrganismi è fondamentale
conoscere le loro necessità:
Nutrienti: carbonio (C), azoto (N), fosforo (P),
zolfo (S), ioni metallici (Fe, Mg, K, Na, ecc.)
macro
micro
fattori di crescita come le vitamine che svolge il
tuolo di conezima PARTE NON PROTEICA
DELLA VITAMINA
Fattori di crescita: vitamine, amminoacidi,
purine, pirimidine
Energia:
Fototrofi → dalla luce
Chemiotrofi → da sostanze chimiche (es.
chemiolitotrofi usano H₂, H₂S, NH₃, Fe²⁺)
Ossigeno: obbligato/aerobio, anaerobio,
microaerofilo...
Acqua
Temperatura
pH
Forza ionica
tipi di coltura batteri che vengono fatti crescere su un terreno
in lab
Coltura mista: contiene più specie (tipica dei
campioni naturali)
Coltura pura (axenica): contiene una sola
specie → ottenuta tramite tecniche di
isolamento
terreni di colura
In base allo stato fisico:
Liquidi → crescita di grandi quantità (uso in
beuta/provette)
Semisolidi → con <0,5% di agar → usati in test
di motilità
Solidi → aggiunta di agar (1-1,2%)PER FERLI
SOLIDIFICARE → isolamento, osservazione
colonie (in piastre Petri)
In base alla composizione:
Complessi (completi) → composizione non nota
in dettaglio (es. Brodo LB, Nutrient Agar)
crescita rapida
crescita abbondante
crescita di microrganismi con particolari
esigenze
Definiti (minimi) → composizione chimica nota
(es. Brodo M9)
studi di metabolismo
selezione di mutanti
dosaggi microbiologici
In base alla funzione:
Elettivi e arricchiti → permettono crescita della
maggior parte dei batteri contengono in più
fattori di crescita
Differenziali → contengono indicatori per
evidenziare differenze biochimiche
Selettivi → contengono inibitori per
microorganismi indesiderati (es. antibiotici, sali
biliari)
tecniche di coltivazione
Tecnica asettica: Evita contaminazioni usando fiamma (becco
Bunsen), strumenti sterili (ansa, spatola, pipette)
Tecniche di inoculo:
Terreno liquido: inoculo diretto con
sospensione o colonia
Provetta con terreno solido: striscio su becco di
clarino
Terreno solido (piastra Petri):
Spatolamento (spread plate)
Inclusione (pour plate)
Strisciamento (streak plate)
TIPI
metodi di conta
con il termine conta batterica è il numero di batteri presenti per unità
di misura
Determinare la curva di crescita di un dato
microorganismo
Conoscere il numero di batteri
misurazione diretta Si contano direttamente le cellule batteriche
presenti in un campione.
conta totale
determinare il numero di cellule batteriche
totali (vive e morte) in una sospensione liquida,
osservandole direttamente al microscopio con
l’uso di una camera di conta.
rapido e semplice
Scarsa sensibilità: servono almeno 10⁶
cellule/mL, le cellule molto piccole possono
sfuggire, non ce distinzione tra cellule vie e
morte e la conta è fatta manualmente quindi
soggettiva
conta vitale/conta su piastra
ermette di contare solo le cellule vive, ossia
quelle capaci di replicarsi e formare colonie
visibili su terreno agarizzato.
Ogni colonia deriva da una cellula viva → si
parla di UFC/mL (Unità Formanti Colonia)
passaggi
In un campione naturale, la maggior parte dei
microrganismi non cresce in laboratorio.
conta solo quelli vivi e sottostima la reale
quantità perche tiene conto solo di quelli
coltivabili
lento, conta solo le coltivabili e diluizioni
corrette
misurazione indiretta Si misura un effetto della crescita, non le
cellule direttamente.
turbidometria
per stimare la densità batterica in una
sospensione liquida, senza contare
direttamente le cellule.
misura la torbidità dell'acqua
le particelle bloccano, deviano o riflettono la
luce → quindi meno luce riesce ad attraversare
il liquido
Lo spettrofotometro misura quanta luce riesce
a passare attraverso il campione.
MPN – Most Probable Number (Numero Più
Probabile)
Metodo statistico usato per stimare quanti
microrganismi vitali sono presenti in un
campione liquido, soprattutto quando la
concentrazione è bassa e non si possono
contare direttamente.
Sotto-argomento 1
introduzione alla diversià
metabolica La vita degli organismi si fonda su
riproduzione
rappresenta la capacità di ogni cellula o
organismo di generare nuove cellule. A livello
microbico, la riproduzione coincide con la
divisione cellulare, che porta alla crescita della
popolazione.
evoluzione
avviene attraverso modificazioni genetiche
(mutazioni, ricombinazioni) che, se vantaggiose,
conferiscono nuove proprietà utili
all’adattamento.
l’evoluzione è una conseguenza della selezione
naturale e rappresenta un meccanismo chiave
della biodiversità.
per svolgere le prime due serve ENERGIA
Il metabolismo è il processo che permette agli
organismi di estrarre energia dal cibo e
utilizzarla per svolgere tutte le funzioni
necessarie alla sopravvivenza, come respirare,
muoversi, crescere e riprodursi.
catabolismo
degradano i nutrienti (es. zuccheri, lipidi,
proteine) per ottenere energia, spesso sotto
forma di ATP
Reazioni con ΔG < 0: reazioni esoergoniche, che
liberano energia → spontanee
anabolismo
Sono le reazioni che costruiscono le
componenti della cellula (membrane, proteine,
DNA, ecc.) utilizzando l’energia prodotta dal
catabolismo
Reazioni con ΔG > 0: reazioni endoergoniche,
che richiedono energia
molte reazioni sono di tipo ossido-riduttivo
(redox)
formate da due semireazioni:
una di ossidazione (perdita di elettroni)
una di riduzione (acquisto di elettroni)
torre degli elettroni
possono essere ordinate in base al loro
potenziale di riduzione standard
la tendenza a guadagnare elettroni.
In cima si trovano le coppie con potenziale più
negativo → buoni donatori di elettroni (tendono
ad ossidarsi)
In fondo ci sono le coppie con potenziale più
positivo → buoni accettori di elettroni (tendono
a ridursi)
strategie metaboliche per ottenere energia
CHEMIORGANOTROFIA
Fonte di energia: composti organici
eterotrofi usano composti organici come fonte di
carbonio
le 3 vie
glicolisi
Il glucosio (6C) viene convertito in 2 acido
piruvico (3C) Si producono:
2 ATP netti (4 prodotti – 2 consumati)
2 NADH
fermentazione
Accettore finale di elettroni = una molecola
derivata dal substrato stesso
Energia prodotta: solo 2 ATP per glucosio
respirazione
Ciclo dell’Acido Citrico
Il piruvato viene completamente ossidato a CO₂
Produzione: 4 NADH, 1 FADH₂, 1 GTP per ogni piruvato
catena di trasporto degli elettroni
Il NADH e il FADH₂ trasferiscono elettroni a una
serie di trasportatori di membrana
L’energia viene usata per pompare protoni (H⁺)
all’esterno della membrana → forza proton-
motrice
I protoni rientrano tramite ATP sintasi,
generando ATP (fosforilazione ossidativa)
Resa energetica:
1 NADH → 3 ATP
1 FADH₂ → 2 ATP
Totale per 1 glucosio: fino a 38 ATP
CHEMIOLITOTROFIA
Fonte di energia: composti inorganici (es. H₂,
NH₃, Fe²⁺)
Questi composti fungono da donatori primari di
elettroni, che vengono trasferiti lungo una
catena di trasporto elettronico, generando ATP
e potere riducente (NADH o NADPH).
autotrofi fissano il carbonio atmosferico sotto forma di
CO₂, principalmente attraverso il ciclo di Calvin
i microrganismi chemiolitotrofi possono
colonizzare ambienti poveri di materia organica
e con risorse non utilizzabili da altri organismi,
riducendo così la competizione.
condizioni aereobiche on O₂ come accettore finale di elettroni
condizione anereobiche
tilizzando altri accettori come nitrati (NO₃⁻),
solfati (SO₄²⁻), o ferro ossidato (Fe³⁺).
Thiobacillus denitrificans: un solfobatterio
anaerobio che ossida composti solforati e
utilizza il nitrato come accettore finale di
elettroni, partecipando alla denitrificazione.
FOTOTROFIA Fonte di energia: luce solare
fotoautotrofi
fotoeterotrofi
avvengono grazie agli enzimi catalizzatori biologici.
abbassando l’energia di attivazione
L’attività enzimatica dipende da variabili
ambientali, come la temperatura, il pH e la
concentrazione del substrato. Un enzima può
essere denaturato o inattivato se esposto a
condizioni non ottimali.
crescita batterica
l’aumento del numero di cellule in una
popolazione microbica
scissione binaria
dalla cellula madre si divide per forare due
cellule figlie identiche
Il tempo necessario affinché ciò avvenga si
chiama tempo di generazione o tempo di
duplicazione
dinamica esponenziale:
il numero di individui che compongono
la popolazione (cellule batteriche) raddoppia
ad ogni generazione
citochinesi
crescita in coltura
Fase di latenza (lag): non si osserva divisione
cellulare, ma le cellule si adattano alle nuove
condizioni metaboliche.
Fase esponenziale (log): la popolazione cresce
esponenzialmente, con raddoppio regolare e
rapido del numero di cellule.
Fase stazionaria: la crescita si arresta perché il
numero di cellule vitali rimane costante; la
riproduzione e la mortalità sono in equilibrio.
Fase di morte: il numero di cellule vitali
diminuisce poiché la mortalità supera la
riproduzione. A volte segue una fase di
sopravvivenza in cui alcune cellule resistono in
condizioni difficili.
in ambienti naturali
risorse disponibili limitate
distribuzione dei nutrienti disomogenea
popolazioni miste di microrganismi che
competono o collaborano
fattori ambientali che influenzano la crescita
DOVE PER OGNI PARAMETRO HO UN RANGE
DI TOLLERANZA
macro e micronutrienti, energia,
ph
ossigeno
aereobi
anaerobi
aerobi facoltativi
temperatura
termofili caldo
mesofili medio
psicrofili freddo
leggi fondamentali che regolano la crescita
Legge di Liebig (del minimo): la biomassa totale
è determinata dal nutriente presente in
concentrazione più bassa (fattore limitante).
Legge di Shelford (della tolleranza): ogni
fattore ambientale ha limiti di tolleranza al di
sopra o al di sotto dei quali la crescita
microbica non è possibile
regolazione metabolica
è la capacità del microrganismo di modificare il
proprio metabolismo per adattarsi alle
condizioni ambientali.
2 adattamenti
adattamento fisiologico
il microrganismo modifica il proprio
metabolismo per rispondere a cambiamenti
ambientali (come la presenza o assenza di
nutrienti).
adattamento genetico
che avviene su tempi più lunghi tramite
selezione naturale e mutazioni.
Comporta modificazioni del genoma e può
portare alla comparsa di nuove specie.
È il motore dell’evoluzione microbica.
Richiede una pressione selettiva ambientale →
sopravvive il fenotipo con fitness più alta
meccanismi
mutazioni
cambiamenti casuali nella sequenza di badi del
DN
ricombinazione genetica
Scambio di materiale genetico tra cellule
diverse, anche non correlate, attraverso:
TRASFORMAZIONE
Assorbimento di DNA libero da una cellula
donatrice lisata, morta.
Un profago è il DNA di un fago temperato
integrato nel genoma batterico.
Per introdurre in modo preciso e stabile nuovi
geni nel batterio, sfruttando i meccanismi
naturali
TRASDUZIONE
generalizzata
Avviene durante il ciclo litico.
Qualsiasi pezzo del DNA batterico può essere
trasferito.
🔹
Succede durante il ciclo litico (quando il
virus distrugge la cellula).
🔹
Il fago prende per errore DNA batterico
anziché il proprio.
specializzata
Solo alcuni geni vicini al profago vengono
trasferiti.
🔹
Succede durante il ciclo lisogeno (quando il
DNA del virus si integra nel batterio come
profago).
🔹
Quando il fago si riattiva, porta con sé pezzi
di DNA batterico vicino al punto di inserzione.
è un trasferimento di DNA da un batterio a un
altro mediato da un virus, chiamato
batteriofago (o semplicemente fago).
CONIUGAZIONE
Trasferimento diretto di DNA tramite ponte
citoplasmatico (es. pili sessuali).
i geni del batterio donatore F+ passeranno a
quello ricevente f-
viaggai il plasmi che viene prima passato e
duplicato e viene passato al fattore - che
nonha il plasmide inizlamnete, una volta che gli
è stato donato diventa f+
i plasmidi sanno duplicare autonomamante
plasmidi F
DANNO AL BATTERIO LA CAPACITA DI
EFFETTUARE LA CONIUGAZIONE E QUINDI LO
SCAMBIO DI MATERIALE GENETICO
plasmidi R
DENTRO I PLASMIDI SONO PRESENTI DELLE
INFORMAZIONI CHE SONO I N GRADO DI
ANNULARE L'EFFETTO DI UN ANTIBIOTICO
sono i fattori di resistenza
è importante per evitare sprechi di energia e
devono regolare quindi
La produzione di enzimi (quando farli e in che
quantità)
L’attività degli enzimi (come e quando farli
funzionare)
avviene su due livelli
Regolazione dell’espressione genica
la cellula decide se attivare o no i geni che
servono a produrre certi enzimi. ( produce gli
enzimi solo quando servono)
Regolazione dell’attività enzimatica (post-
traduzionale)
l’enzima può essere attivato o inibito tramite:
regolazione allosterica
inebizione da feedback
esempio: CRESCITA DIAUXICA (terreno di
coltura con 2 zuccheri)
Il batterio consuma prima il glucosio, perché è il
substrato preferenziale e gli enzimi per la sua
degradazione sono costitutivi (sempre presenti).
Solo dopo l’esaurimento del glucosio, inizia la
degradazione del lattosio, ma per farlo la
cellula deve attivare l’espressione di nuovi
enzimi, processo che richiede tempo e
regolazione.
cellula batterica
IL CITOPLASMA
l citoplasma batterico è una matrice acquosa
che occupa l’interno della cellula
non è compartimentalizzato, non contiene
organanelli delimitati da membrane
Componenti principali
Genoma batterico (cromosoma e plasmidi)
il cromosoma batterico è unico a singola copiaDNA circolare superaravvolto
plasmi
elementi accessori, con vantaggi selettivi
conposti da dna circoalre
presenti in più copie e replicarsi in modo
autonomo (replicazione sigma).
RNA (mRNA, rRNA, tRNA)
mRNA (RNA messaggero)
trasporta l’informazione genetica dal DNA ai
ribosomi per la sintesi proteica.
rRNA
parte strutturale e funzionale dei ribosomi,
contribuisce alla catalisi della formazione del
legame peptidico
tRNA
trasporta i singoli amminoacidi ai ribosomi
durante la traduzione, leggendo i codoni
dell’mRNA.
Ribosomi
sono complessi formati da due subunità
(maggiore e minore) composte da rRNA e
proteine
Enzimi coinvolti nel metabolismo
Metaboliti e composti di riserva
corpi di inclusione
depositi intracellulari di sostanze che la cellula
accumula quando sono in eccesso e può
riutilizzare quando necessario
Granuli di glicogeno/amido: riserva di carbonio
ed energia.
PHB (poli-β-idrossibutirrato): riserva lipidica.
Polimetafosfati: riserva di fosfato.
Zolfo: riserva energetica nei batteri
solfossidanti.
vescicole gassose
Strutture proteiche vuote e rigide, presenti in
alcuni batteri acquatici. Permettono il
galleggiamento, regolando la posizione del
batterio nella colonna d’acqua per ottimizzare
la fotosintesi o l’accesso a nutrienti
la membrana
è una barriera sottile e flessibile che separa il
citoplasma dall’ambiente esterno.
Composizione lipoproteica: circa 40% lipidi e
60% proteine.
fosfolipidi con una testa idrofila (verso
l’esterno) e due code idrofobe (verso l’interno)
i fosfolipidi e le proteine si muovono
lateralmente all'interno del doppio strato,
conferendo fluidità e dinamismo alla membrana.
i lipidi di membrana sono fosfolipidi formati da
acidi grassi legati al glicerolo tramite legami
estere. Esistono anche glicolipidi (con zuccheri).
gli opanoidi svolgono una funzione analoga,
stabilizzando la struttura membranosa.
proteine
Proteine integrali: attraversano o penetrano la
membrana,
Proteine periferiche: associate alla superficie
interna o esterna della membrana
trasporto
attivo
passivo
parete cellulare
conferisce forma e rigidità alla cellula.
Gram-positivi (Gram +): parete spessa, ricca di
peptidoglicano., colore viola
Gram-negativi (Gram -): parete più sottile, con
uno strato esterno aggiuntivo (membrana
esterna) che contiene lipopolisaccaridi (LPS).
colore rosa
LPS lipopolisaccaride
Lipide A (inserito nella membrana): parte
tossica → endotossina.
Core polisaccaridico
Antigene O (catene polisaccaridiche variabili)
funzioni
Determina la forma della cellula.
Protegge dalla lisi osmotica, conferendo
resistenza alla pressione interna.
È presente in quasi tutti i procarioti
costituita da PEPTIDOGLICANO
È un polimero a forma di rete composto da
subunità ripetute di N-acetilglucosamina (NAG)
e acido N-acetilmuramico (NAM), unite da
legami β-1,4-glicosidici
LE CATENE SONO LEGATE ATTRAVERSO UNA
COMPONENTE PEPTIDICA
Al NAM sono legati tetrapeptidi con
amminoacidi specifici
strutture superficiali
flagelli
Appendici lunghe e sottili utilizzate per la
motilità.. Funzionano come eliche propulsi
grazie alla forza proton‐motrice,
fimbreservono per adesione a superfici
pilicoinvolti nella coniugazione batterica
sporulazione
per sopravvivere in ambienti ostili o poveri di
nutrienti
strategie di adattamento morfologiche e
metaboliche.
strategie
dormienza
la cellula riduce drasticamente la sua attività
metabolica, rimanendo viva ma senza riprodursi.
Così consuma pochissima energia.
sporulazione
alcuni batteri formano strutture resistenti
chiamate spore, che possono sopravvivere a
condizioni ambientali estreme.
resistenti a
alte temperature,
radiazioni UV,
disidratazione,
sostanze chimiche tossiche
struttura
core
Contiene DNA, ribosomi, enzimi in piccola
quantità, ioni calcio, SASPs (Small Acid Soluble
Proteins) e acido dipicolinico (DPA).
DPA e Ca²⁺ proteggono il DNA dalla
denaturazione.
Presenza di 3-P-glicerato come riserva
energetica.
cortex
Strato amorfo tra la membrana interna ed
esterna.
Composto da peptidoglicano corticale atipico
con NAM in forma lattamica e acido
mesodiaminopimelico (DPM) al posto della
lisina.
Funzioni: conferisce termoresistenza, elasticità
e resistenza al lisozima.
coat
Riveste la corteccia.
È rigido, compatto, multistrato, con proteine
cheratino-simili ricche di legami S-S.
Garantisce impermeabilità chimica, resistenza
enzimatica e protezione dalle radiazioni UV.
esosporito
strato esterno lipidico e polisaccaridico che
aggiunge un’ulteriore barriera protettiva.
sequestro dei nutrienti
vengono attivati meccanismi per trattenere e
immagazzinare i nutrienti in modo più efficiente.
cappe a flusso laminare. quando non è in uso
luce UV, quando si usa filtri HEPA
Downloaded by alessia lisi ([email protected])
lOMoARcPSD|6025700
