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Microbiologia Tecnica, Appunti di Microbiologia

Sintesi parte tecnica di microbiologia

Tipologia: Appunti

2016/2017

Caricato il 30/12/2017

Kevin1997
Kevin1997 🇮🇹

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TERRENI COLTURALI: sono necessari e utilizzati per la cultura dei microrganismi, contengono i
nutrimenti. Possono essere:
- Naturali Liquidi (mosto, l’arte, infuso di terra, ecc.)
Solidi (frutta, patate, pane, impasti di farina, ecc.)
- Sintetici Semplici, la cui formazione prevede l’uso di concentrazioni note di un numero
variabile di ingredienti chimicamente definiti. Si conosce quindi la precisa
composizione chimica. Generalmente tutti contengono una base minerale e si
differenziano per fonti di C , azoto ed energia. Fonte di C può essere costituita da
anidride carbonica per gli autotrofi, o da carbonio organico per gli eterotrofi.
L’energia può essere ricavata dalla luce solare per i fototrofi, o derivare
dall’ossidazione di fonti organiche o inorganiche per i chemiotrofi.
Complessi, quelli di cui non si conosce in maniera dettagliata la composizione
chimica. Soddisfano le esigenze nutrizionali di microrganismi chemioeterotrofi
anche molto diversi. I peptoni e gli idrolizzare di proteggi forniscono composti
organici che sopperiscono al fabbisogno di energia, carbonio, azoto e di zolfo di
molte specie microbiche. L’estratto di carne fornisce composti organici azotati,
macro e microelementi e fattori di crescita. Permettono la coltivazione di specie
con esigenze nutrizionali non note.
- Liquidi: naturali sintetici, possono essere solidificati con l’aggiunta di agar. L’agar è insolubile
in acqua fredda ma solubili in acqua a temperatura superiore a 85 °C e gelifica a 32-29 °C.
TERRENI MODIFICATI PER ISOLAMENTO: sono impiegati anche per la selezione, l’identificazione e
la caratterizzazione fisiologica di microrganismi di interesse. Li dividiamo in:
- terreni selettivi, caratterizzati dalla presenza o l’assenza di particolari sostanze, consentono
la crescita di alcuni microrganismi e/o inibiscono la crescita di altri. Usati quando si vuole
isolare o rilevare la presenza di una o più specie microbiche in un campione che li contiene
di diverse specie.
- terreni differenziali, consentono di distinguere specie microbiche diverse sulla base
dell’aspetto che le colonie assumono sul terreno o delle trasformazioni che esse impongono
al terreno su cui crescono. Un esempio è il WL Nutrient Agar che consente l’identificazione
sulla base del colore e della morfologia assunti dalle colonie dopo 3-5 giorni di crescita a
temperatura controllata.
- terreni differenziali-selettivi, coniugano alle caratteristiche dei terreni selettivi e
differenziali. Un esempio è il WL differenziale, in pratica un WL Nutrient Agar addizionato di
actidione, un antibiotico che inibisce la crescita di muffe e di alcuni lieviti, tra cui
Saccharomyces cerevisiae. Impiegato per la rilevazione e la contemporanea identificazione
presuntiva di lieviti non-Saccharomyces resistenti all’actidione.
L’isolamento di microrganismi con particolari esigenze nutrizionali viene realizzato allestendo ed utilizzando
terreni di coltura selettivi. Per l’allestimento di tali terreni è possibile intervenire sia sulla combinazione dei
nutrienti (in base alle esigenze nutrizionali specifiche del microrganismo) che sui parametri fisici che
influiscono sulla crescita (temperatura, pH, disponibilità di ossigeno, pressione osmotica).
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TERRENI COLTURALI : sono necessari e utilizzati per la cultura dei microrganismi, contengono i nutrimenti. Possono essere:

  • Naturali Liquidi (mosto, l’arte, infuso di terra, ecc.) Solidi (frutta, patate, pane, impasti di farina, ecc.)
  • Sintetici Semplici , la cui formazione prevede l’uso di concentrazioni note di un numero variabile di ingredienti chimicamente definiti. Si conosce quindi la precisa composizione chimica. Generalmente tutti contengono una base minerale e si differenziano per fonti di C , azoto ed energia. Fonte di C può essere costituita da anidride carbonica per gli autotrofi, o da carbonio organico per gli eterotrofi. L’energia può essere ricavata dalla luce solare per i fototrofi, o derivare dall’ossidazione di fonti organiche o inorganiche per i chemiotrofi.

Complessi , quelli di cui non si conosce in maniera dettagliata la composizione chimica. Soddisfano le esigenze nutrizionali di microrganismi chemioeterotrofi anche molto diversi. I peptoni e gli idrolizzare di proteggi forniscono composti organici che sopperiscono al fabbisogno di energia, carbonio, azoto e di zolfo di molte specie microbiche. L’estratto di carne fornisce composti organici azotati, macro e microelementi e fattori di crescita. Permettono la coltivazione di specie con esigenze nutrizionali non note.

  • Liquidi : naturali sintetici, possono essere solidificati con l’aggiunta di agar. L’agar è insolubile in acqua fredda ma solubili in acqua a temperatura superiore a 85 °C e gelifica a 32-29 °C.

TERRENI MODIFICATI PER ISOLAMENTO : sono impiegati anche per la selezione, l’identificazione e la caratterizzazione fisiologica di microrganismi di interesse. Li dividiamo in:

  • terreni selettivi , caratterizzati dalla presenza o l’assenza di particolari sostanze, consentono la crescita di alcuni microrganismi e/o inibiscono la crescita di altri. Usati quando si vuole isolare o rilevare la presenza di una o più specie microbiche in un campione che li contiene di diverse specie.
  • terreni differenziali , consentono di distinguere specie microbiche diverse sulla base dell’aspetto che le colonie assumono sul terreno o delle trasformazioni che esse impongono al terreno su cui crescono. Un esempio è il WL Nutrient Agar che consente l’identificazione sulla base del colore e della morfologia assunti dalle colonie dopo 3-5 giorni di crescita a temperatura controllata.
  • terreni differenziali-selettivi , coniugano alle caratteristiche dei terreni selettivi e differenziali. Un esempio è il WL differenziale , in pratica un WL Nutrient Agar addizionato di actidione, un antibiotico che inibisce la crescita di muffe e di alcuni lieviti, tra cui Saccharomyces cerevisiae. Impiegato per la rilevazione e la contemporanea identificazione presuntiva di lieviti non- Saccharomyces resistenti all’actidione.

L’isolamento di microrganismi con particolari esigenze nutrizionali viene realizzato allestendo ed utilizzando terreni di coltura selettivi. Per l’allestimento di tali terreni è possibile intervenire sia sulla combinazione dei nutrienti (in base alle esigenze nutrizionali specifiche del microrganismo) che sui parametri fisici che influiscono sulla crescita (temperatura, pH, disponibilità di ossigeno, pressione osmotica).

Es. adottiamo isolamento per arricchimento: anche qui pigiamo gli acini, ma il mosto ottenuto lo lasciamo fermentare spontaneamente dalle cellule di lievito presenti. Si ha aumento di etanolo, ciò rende condizioni di crescita selettive per S. cerevisiae, e quindi viene “arricchita”, e controselettive per tutte le altre specie che tollerano mano l’etanolo. L’isolamento dei lieviti su piastra alla fine della fermentazione (fine dell’arricchimento), quando gli zuccheri saranno consumati, consentirà di ottenere colonie di S. cerevisiae.

ISOLAMENTO SEMPLICE → per spandimento e per disseminazione ISOLAMENTO CON ARRICCHIMENTO → consiste in un isolamento semplice preceduto da un arricchimento (Arricchimento + Isolamento semplice)

ISOLAMENTO PER SPANDIMENTO :

1) con ansa si sterilizza l’ansa al becco Bunsenn, successivamente si raffredda questa è una porzione di terreno e si preleva una porzione di patina del microrganismo da isolare. Si trasferisce poi la patina del microrganismo da isolare in condizioni di sterilità, procedendo con lo spandimento della patina sul terreno agarizzato.

2) con spatola di vetro si basa su principio della diluizione progressiva di una sospensione microbica che avviene quando una goccia della stessa viene distribuita in maniera uniforme con spatola su 3 piastre contenenti opportuno terreno di coltura agarizzato. L’isolamento risulta dalla progressiva diminuzione della quantità di cellule portate dalla spatola da una piastra all’altra con ogni passaggio.

ISOLAMENTO PER DISSEMINAZIONE : effettuata mediante diluizione successiva di un’aliquota di sospensione microbica in una serie di 3 tubi con terreno agarizzato fuso mantenuto ad una temperatura per restare liquido senza danneggiare cellule (45°C). Una volta fatte le diluizioni il contenuto dei tubi verrà versato in altrettante 3 piastre vuote; poi raffreddatosi il terreno, le singole colonie cresceranno per lo più all’interno dell’agar.

CONTE VITALI : si intende la determinazione del numero di cellule vitali presenti in una sospensione microbica. Si definisce vitale una cellula capace di dividersi e dare origine ad una progenie. Risultato della conta è espresso per unità di volume (= n° cellule / ml sospensione) unità di peso (= n° cellule / g di campione). Questo tipo di conta consiste nel determinare il numero di cellule microbiche presenti in un campione in grado di formare colonie quando fatte crescere su un opportuno terreno agarizzato: per questo motivo viene anche detta conta in piastra o conta delle colonie. Il presupposto di questo tipo di procedura è che ogni colonia sia originata a partire da una singola cellula vitale. E’ opportuno esprimere i risultati di questo tipo di conta in termini di unità formanti colonia.

CONTE TOTALI

Si intende determinazione numero totale di cellule (vive + morte) presenti in una sospensione microbica. La conta totale è più rapida rispetto alla conta vitale, non comportando la crescita cellulare.

DIRETTE : Il numero di individui presente in una sospensione microbica può essere determinato contando le cellule contenute in un volume accuratamente determinato e molto piccolo. Esso implica uso di speciali vetrini chiamati camere contacellule (camera contaglobuli di Thoma-Zeiss). Un’ansata di sospensione microbica viene posta in corrispondenza dell’area depressa e ricoperta con un vetrino coprioggetto si viene così a formare un sottile ed uniforme film di liquido tra i due vetrini in cui il volume sovrastante ogni quadratino è definito in maniera accurata. Al microscopio si contano tutte le cellule presenti sui quadrati grandi (5 x 5 quadratini piccoli). Nel caso di cellule che si trovino a cavallo dei lati del quadrato vanno incluse nella conta solo quelle che stanno sopra a 2 dei 4 lati (regola della L). Per avere un valore di conta statisticamente accettabile la conta deve essere effettuata su almeno 100 quadratini elementari, vale a dire 4 quadrati grandi che devono essere presi, preferenzialmente, sulla diagonale della camera.

Nel caso dei Lieviti è possibile trasformare una conta totale in una conta vitale grazie ad una speciale colorazione vitale effettuata con il colorante bleu di metilene (rende possibile la distinzione tra cellule vive e cellule morte che, a seguito della colorazione, diventano azzurre).

INDIRETTE

Con queste tecniche di conta si risale al numero di cellule presenti in un volume noto del campione iniziale per via indiretta, attraverso la determinazione di altri parametri che sono correlati al numero di cellule. Analisi chimica di un costituente cellulare La biomassa totale può essere misurata mediante procedure chimiche analitiche finalizzate a determinare la quantità di un costituente cellulare (N totale, DNA totale, C cellulare totale, ecc).

Specifiche della camera (Thoma‐Zeiss)

  • il vetrino portaoggetti ha zona centrale più bassa di 0.1 mm (100 μm) rispetto a superficie principale; su questa area è inciso reticolo quadrettato di cui è nota area di ogni riquadro (25 quadrati grandi, ognuno diviso in 25 quadratini piccoli; lato di quadratino = 1/20 mm; area di quadratino = 1/400 di mm2;
  • volume di sospensione microbica sovrastante ogni quadratino è 1/4.000.000 di cm3 (1/10 mm x 1/400 mm2 = 1/4000 mm3 = 1/4.000. 000 di cm3); significa che il volume che insiste sulla superficie di un quadratino è un quattromilionesimo di ml.
  • diluizione rispetto ad un quadratino = 1/4.000.000 = 1/4x10^6
  • fattore di diluizione rispetto ad un quadratino = 4x10^6

- N cellulare totale : dal momento che le cellule sono costituite per circa il 14 % da N analizzando la quantità di azoto presente in un determinato campione è possibile ottenere con buona approssimazione la biomassa totale del campione Procedura : 1) Lavaggio delle cellule per eliminare il terreno residuo; 2) Digestione con acido solforico per liberare N cellulare e convertirlo in ammoniaca; 3) Aggiunta di un reagente che si combina con NH 3 +^ totale in maniera tale da dare una particolare colorazione;

  1. Determinazione della concentrazione dell’NH 3 +^ totale mediante colorimetro. - C cellulare totale : Il carbonio cellulare totale può essere determinato a seguito della digestione di un campione di cellule con un forte agente ossidante, come il dicromato di potassio in acido solforico; la quantità di carbonio presente è proporzionale alla quantità di dicromato ridotto. - Peso secco : La biomassa cellulare viene posta all’interno di un recipiente di peso noto e messa ad essiccare fino a quando il peso non si mantiene costante. - Peso umido : Un terreno liquido contenente le cellule in coltura viene centrifugato in maniera tale da concentrare le cellule sul fondo della centrifuga. Il peso umido delle cellule centrifugate viene misurato ponendole in un recipiente di peso noto e determinandone il peso reale. - La torbidità : Un metodo semplice e molto utile per stimare il numero totale di cellule di un campione consiste nell’effettuare misure di torbidità. Un liquido che contiene più di 107 cellule/ml ha un aspetto decisamente torbido. Questa opacità è provocata dal fatto che ogni singola cellula in sospensione agisce come una piccola lente che assorbe e diffonde i raggi luminosi che la investono. Quindi, maggiore è il numero delle cellule nel cammino dei raggi luminosi e maggiore è l’opacità della coltura; in altri termini, la quantità di luce assorbita e diffusa è direttamente proporzionale alla massa di cellule.

CONSERVAZIONE COLTURE MICROBICHE : nei laboratori vengono collezionati i ceppi, con questo termine si intende ogni coltura microbica mura e viva che derivi originalmente dalla riproduzione di una singola cellula. Il cerchio colture pure possono essere conservati con diversi sistemi, ci sono tre motivi principali per la conservazione:

  • mantenimento per uso proprio (per lo studio dello sviluppo)
  • la conservazione per una futura utilizzazione (applicazione industriale o biotecnologica)
  • la conservazione come germano plasma destinato alla distribuzione ad altri.

SISTEMI DI MANTENIMENTO DI COLTURE MICROBICHE : prima di tutto il terreno deve permettere la massima sopravvivenza della popolazione, consentendo solo un minimo o addirittura nessun cambiamento fisiologico genetico nel corso del tempo. È essenziale che la cultura da preservare sia mantenuto in condizioni axeniche, cioè che contenga solo cellule della medesima specie. Ringiovanimento per trasferimento periodico sul terreno di coltura Prisco, la liofilizzazione e il congelamento temperature bassissime.

Trasferimenti periodici su substrato agarizzato : sistema vecchio e universale utilizzato, per conservazione in tempi brevi. Consiste nel trasferimento di una porzione della pagina in un terreno adatto fresco nel quale le cellule possono continuare a proliferare. I vantaggi sono la semplicità, economicità e versatilità. Il terreno liquido o agarizzato tende a perdere umidità e la cultura rinfrescata attraverso un nuovo trasferimento sul terreno fresco. Liofilizzazione dei microrganismi : comporta la rimozione dell’acqua da una coltura microbica congelata (essiccamento freddo). Si congela una sospensione di cellule di una coltura fresca (24- h) a -50 °C; si collega poi il recipiente con le cellule congelate ad una pompa a vuoto e si attende che