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Sintesi parte tecnica di microbiologia
Tipologia: Appunti
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TERRENI COLTURALI : sono necessari e utilizzati per la cultura dei microrganismi, contengono i nutrimenti. Possono essere:
Complessi , quelli di cui non si conosce in maniera dettagliata la composizione chimica. Soddisfano le esigenze nutrizionali di microrganismi chemioeterotrofi anche molto diversi. I peptoni e gli idrolizzare di proteggi forniscono composti organici che sopperiscono al fabbisogno di energia, carbonio, azoto e di zolfo di molte specie microbiche. L’estratto di carne fornisce composti organici azotati, macro e microelementi e fattori di crescita. Permettono la coltivazione di specie con esigenze nutrizionali non note.
TERRENI MODIFICATI PER ISOLAMENTO : sono impiegati anche per la selezione, l’identificazione e la caratterizzazione fisiologica di microrganismi di interesse. Li dividiamo in:
L’isolamento di microrganismi con particolari esigenze nutrizionali viene realizzato allestendo ed utilizzando terreni di coltura selettivi. Per l’allestimento di tali terreni è possibile intervenire sia sulla combinazione dei nutrienti (in base alle esigenze nutrizionali specifiche del microrganismo) che sui parametri fisici che influiscono sulla crescita (temperatura, pH, disponibilità di ossigeno, pressione osmotica).
Es. adottiamo isolamento per arricchimento: anche qui pigiamo gli acini, ma il mosto ottenuto lo lasciamo fermentare spontaneamente dalle cellule di lievito presenti. Si ha aumento di etanolo, ciò rende condizioni di crescita selettive per S. cerevisiae, e quindi viene “arricchita”, e controselettive per tutte le altre specie che tollerano mano l’etanolo. L’isolamento dei lieviti su piastra alla fine della fermentazione (fine dell’arricchimento), quando gli zuccheri saranno consumati, consentirà di ottenere colonie di S. cerevisiae.
ISOLAMENTO SEMPLICE → per spandimento e per disseminazione ISOLAMENTO CON ARRICCHIMENTO → consiste in un isolamento semplice preceduto da un arricchimento (Arricchimento + Isolamento semplice)
1) con ansa si sterilizza l’ansa al becco Bunsenn, successivamente si raffredda questa è una porzione di terreno e si preleva una porzione di patina del microrganismo da isolare. Si trasferisce poi la patina del microrganismo da isolare in condizioni di sterilità, procedendo con lo spandimento della patina sul terreno agarizzato.
2) con spatola di vetro si basa su principio della diluizione progressiva di una sospensione microbica che avviene quando una goccia della stessa viene distribuita in maniera uniforme con spatola su 3 piastre contenenti opportuno terreno di coltura agarizzato. L’isolamento risulta dalla progressiva diminuzione della quantità di cellule portate dalla spatola da una piastra all’altra con ogni passaggio.
ISOLAMENTO PER DISSEMINAZIONE : effettuata mediante diluizione successiva di un’aliquota di sospensione microbica in una serie di 3 tubi con terreno agarizzato fuso mantenuto ad una temperatura per restare liquido senza danneggiare cellule (45°C). Una volta fatte le diluizioni il contenuto dei tubi verrà versato in altrettante 3 piastre vuote; poi raffreddatosi il terreno, le singole colonie cresceranno per lo più all’interno dell’agar.
CONTE VITALI : si intende la determinazione del numero di cellule vitali presenti in una sospensione microbica. Si definisce vitale una cellula capace di dividersi e dare origine ad una progenie. Risultato della conta è espresso per unità di volume (= n° cellule / ml sospensione) unità di peso (= n° cellule / g di campione). Questo tipo di conta consiste nel determinare il numero di cellule microbiche presenti in un campione in grado di formare colonie quando fatte crescere su un opportuno terreno agarizzato: per questo motivo viene anche detta conta in piastra o conta delle colonie. Il presupposto di questo tipo di procedura è che ogni colonia sia originata a partire da una singola cellula vitale. E’ opportuno esprimere i risultati di questo tipo di conta in termini di unità formanti colonia.
Si intende determinazione numero totale di cellule (vive + morte) presenti in una sospensione microbica. La conta totale è più rapida rispetto alla conta vitale, non comportando la crescita cellulare.
DIRETTE : Il numero di individui presente in una sospensione microbica può essere determinato contando le cellule contenute in un volume accuratamente determinato e molto piccolo. Esso implica uso di speciali vetrini chiamati camere contacellule (camera contaglobuli di Thoma-Zeiss). Un’ansata di sospensione microbica viene posta in corrispondenza dell’area depressa e ricoperta con un vetrino coprioggetto si viene così a formare un sottile ed uniforme film di liquido tra i due vetrini in cui il volume sovrastante ogni quadratino è definito in maniera accurata. Al microscopio si contano tutte le cellule presenti sui quadrati grandi (5 x 5 quadratini piccoli). Nel caso di cellule che si trovino a cavallo dei lati del quadrato vanno incluse nella conta solo quelle che stanno sopra a 2 dei 4 lati (regola della L). Per avere un valore di conta statisticamente accettabile la conta deve essere effettuata su almeno 100 quadratini elementari, vale a dire 4 quadrati grandi che devono essere presi, preferenzialmente, sulla diagonale della camera.
Nel caso dei Lieviti è possibile trasformare una conta totale in una conta vitale grazie ad una speciale colorazione vitale effettuata con il colorante bleu di metilene (rende possibile la distinzione tra cellule vive e cellule morte che, a seguito della colorazione, diventano azzurre).
Con queste tecniche di conta si risale al numero di cellule presenti in un volume noto del campione iniziale per via indiretta, attraverso la determinazione di altri parametri che sono correlati al numero di cellule. Analisi chimica di un costituente cellulare La biomassa totale può essere misurata mediante procedure chimiche analitiche finalizzate a determinare la quantità di un costituente cellulare (N totale, DNA totale, C cellulare totale, ecc).
Specifiche della camera (Thoma‐Zeiss)
- N cellulare totale : dal momento che le cellule sono costituite per circa il 14 % da N analizzando la quantità di azoto presente in un determinato campione è possibile ottenere con buona approssimazione la biomassa totale del campione Procedura : 1) Lavaggio delle cellule per eliminare il terreno residuo; 2) Digestione con acido solforico per liberare N cellulare e convertirlo in ammoniaca; 3) Aggiunta di un reagente che si combina con NH 3 +^ totale in maniera tale da dare una particolare colorazione;
CONSERVAZIONE COLTURE MICROBICHE : nei laboratori vengono collezionati i ceppi, con questo termine si intende ogni coltura microbica mura e viva che derivi originalmente dalla riproduzione di una singola cellula. Il cerchio colture pure possono essere conservati con diversi sistemi, ci sono tre motivi principali per la conservazione:
SISTEMI DI MANTENIMENTO DI COLTURE MICROBICHE : prima di tutto il terreno deve permettere la massima sopravvivenza della popolazione, consentendo solo un minimo o addirittura nessun cambiamento fisiologico genetico nel corso del tempo. È essenziale che la cultura da preservare sia mantenuto in condizioni axeniche, cioè che contenga solo cellule della medesima specie. Ringiovanimento per trasferimento periodico sul terreno di coltura Prisco, la liofilizzazione e il congelamento temperature bassissime.
Trasferimenti periodici su substrato agarizzato : sistema vecchio e universale utilizzato, per conservazione in tempi brevi. Consiste nel trasferimento di una porzione della pagina in un terreno adatto fresco nel quale le cellule possono continuare a proliferare. I vantaggi sono la semplicità, economicità e versatilità. Il terreno liquido o agarizzato tende a perdere umidità e la cultura rinfrescata attraverso un nuovo trasferimento sul terreno fresco. Liofilizzazione dei microrganismi : comporta la rimozione dell’acqua da una coltura microbica congelata (essiccamento freddo). Si congela una sospensione di cellule di una coltura fresca (24- h) a -50 °C; si collega poi il recipiente con le cellule congelate ad una pompa a vuoto e si attende che