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Appunti del corso Microbiologia generale
Tipologia: Appunti
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Storia microbiologia Organismi eucarioti e procarioti Influenza fattori fisici e chimici (sterilizzazione, congelazione, pastorizzazione ecc..) Studio microorganismi Ruolo microorganismi negli ecosistemi (ciclo carbonio, azoto, fosforo) Applicazioni biotecnologiche di microorganismi MICROBIOLOGIA Studio dei microorganismi: PATOGENI (colera, tubercolosi) : malattie PRO-TECNOLOGICI (metabolismo): trasformano materie prime in elementi fermentati (vino, carni fermentate, lievitazione, formaggi, yogurt) Caratteristiche PROBIOTICHE: apportano benefici all’organismo Food-grade: microorgansimi sicuri per scopo alimentare (GRAS) Biocarburanti: microorganismi usati come combustibile DETERIORANTI: portano ad un deterioramento gli alimenti (decadimento proprietà della materia) Producono CO2 in genere ORGANISMI DETERIORANTI con uso PRO-TECONOLOGICO -Clostridium (botulino): cattivo odore, organismi anaerobi, portano al deterioramento, portano alla morte Usato per BOTOX (utilizzo pro-tecnologico) -Saccharomyces cereuisiac Può causare dermatite, colonizzazione mucose (potenzialmente patogeno e deteriorante) Utilizzato per vino o farmaci RUOLO MICROORGANISMI NEL CORPO UMANO: Funzione anti-infiammatoria, metabolismo STORIA MICROBIOLOGIA 18esimo secolo: invenzione primo microscopio per analizzare la carne Dibattito generazione spontanea: Francesco Redi L’infiltrazione esterna di micro organismi in contenitori con carne, 3 diversi contenitori ( aperto, e 2 chiusi) Lazzaro Spallanzani Putrefazione brodo in 2 casi: aperto e chiuso (non bollito) Dopo ebollizione quello chiuso si conservava meglio (non andava incontro alla putrefazione)
Nicolas Francois Appert Utilizzo del calore (autoclave) Trattamento di appertizzazione Bartolomeo Bizio (alimenti che sanguinano) Produzioni di pigmenti rossi nella polenta Presenza del microorganismo della specie: SERRATIA MARCESERC, presenti in molte superfici, molto facile la contaminazione nei prodotti alimentari Produzione di pigmento rosso: prodigiusina MICROBIOLOGIA MAR 20 SET PADRE DELLA MICROBIOLOGIA MODERNA Louis Pasteur Invenzione del vaccino Scopritore della fermentazione alcolica: tramite Saccharomyces Cerevisiae (responsabile della lievitazione, fermentazione) Esperimento del contenitore chiuso ermeticamente: presenza di una doppia ansa per evitare che i microorganismi esterni andassero a degradare il contenuto (dopo bollitura) POSTULATI DI KOCH Robert Koch I postulati ci indicano quando un determinato organismo è responsabile di una determinata malattia -Il microorganismo deve essere presente in tutti gli affetti da quella malattia e assente in quelli che non hanno la malattia -Il microorganismo deve essere isolato dall’organismo affetto (tampone, prelievo del sangue) -L’inoculo di coltura pura del microorganismo in individui sani può causare la comparsa della malattia -Il microorganismo deve essere di nuovo isolato dall’individuo infettato I PRIMI ANTIBIOTICI Alexander Fleming Scopritore della penicillina: fece crescere su delle piastrine lo Staphylococus Aureus, aprii le finestre e una delle piastre si contaminò con una muffa, lo Staphylococus Aureus cresceva lontano dalla muffa (per via della produzione di penicillina) Uso della penicillina: 1929, utilizzo sui soldati. 1944, utilizzo su larga scala SCOPERTA DOPPIA ELICA DNA James Watson Francis Crick Rosalind Franklin PADRE DELLA MODERNA BIOLOGIA MOLECOLARE Kary Mullis Scoperta del microorganismo: Thermus Acquaticus: che produce enzima Taq Polimerasi (utile per lo studio del DNA)
Forme di aggregazione cellulare: COCCO: forma sferica (STREPTOCOCUS THERMOPHILUS) Struttura a catenella: catena di cellule “cocco”, deriva dalla divisione su un piano verticale Struttura a tetradi: derivano da divisione su 2 piani verticali Struttura a sarcine: derivano da divisione su 3 piani verticali Struttura a stalliococchi: derivano da aggregazione di cellule “cocco” BASTONCELLO: (bacilli): forma allungata (LACTOBACYLLUS BULGARICUS) Struttura diplobacillo: deriva da divisione del bacillo singolo Struttura streptobacillo: catena di più bacilli Struttura Coccobacillo: un bacillo composto da 2 cocchi Struttura spirochete: struttura ondulata e lunga (Tripanosoma: sifilide) Struttura vibrione Struttura Spirillo ORGANELLI SUBCELLULARI RIBOSOMI -Struttura ribosomiale: composti da molecole d rRNA + proteine -Struttura variabile nei procarioti ed eucarioti (più grande) PARETE CELLULARE NEI BATTERI (struttura peptinodicano) Presente nei procarioti e negli eucarioti Funzioni: resistenza meccanica allo stress osmotico (differenza di concentrazioni tra interno ed esterno) Struttura molto complessa formata da: Amminoacidi Carboidrati Catene formate da: alanina, acido glutammico, lisanina, alanina (in ordine) Catena che può essere rotta da alcuni composti chimici TIPI DI PARETE NEI BATTERI 2 tipi di batteri: GRAM NEGATIVI E GRAM POSITIVI GRAM NEGATIVI: Nei gran negativi il colore andava via dopo vari lagravaggi Parete formata da membrana citoplasmatica alla base Un unico strato di peptidoglicano Presenza di un’altra struttura: seconda membrana plasmatica Strato di lipopolisaccaridi GRAM POSITIVI: Nei gran positivi rimaneva il colore tipico delle cellule (pigmenti) Parete formata da membrana citoplasmatica alla base Vari strati di peptidoglicano (responsabili del mantenimento del colore) MEMBRANA CELLULARE Non ha funzione meccanica, è una struttura estendibile Catena di fosfolipidi
Strato esterno che contiene la cellula Prodotta dai microorganismi, non tutti la fanno Corrisponde spesso con l’inizio del processo di virulenza (produzione di biofilm) Capacità di organismo di essere INSENSIBILE ad antibiotici. Tempo di sospensione: dopo una fase di antibiotici all’animale, il tempo di sospensione è il tempo necessario per far sì che l’antibiotico sia assente nel latte (7 gg, 14 gg ecc..) FLAGELLI: struttura proteica che consente il movimento nei microrganismi mobili RIPRODUZIONE MICRORGANISMI (ASESSUALE E SESSUALE) La principale differenza tra la riproduzione sessuale e asessuale è che in quella asessuale non troviamo il dimezzamento del materiale genetico, dimezzamento numero cromosomi (accade in quella sessuale) In quella SESSUALE troviamo il dimezzamento del materiale genetico ASESSUALE : incremento numero di cellule, tipica dei batteri. Tipologie: fissione, gemmazione, accrescimento apicale, sporulazione Fissione binaria trasversa : divisione cellulare proveniente dalla cellula madre, formazione di due cloni perfetti. Presente nei batteri, lieviti, protozoi Gemmazione: l a cellula madre forma un estroflessione ad un'estremità che si ingrandisce fino a distaccarsi formando due cellula figlie e lasciando una cicatrice sul punto di separazione che può essere: UNIPOLARE, BIPOLARE, MULTIPOLARE Accrescimento apicale : tipico delle funghi filamentosi, espansione delle cellule che vanno a dividersi Sporulazione: tipico dei batteri e funghi, formazione delle spore (forte resistenza ai trattamenti di abbattimento) Spore che si formano quando il microrganismo quando sono presenti alcune condizioni che bloccano lo sviluppo vegetativo (es. scarsità di ossigeno) Fase successiva alla sporulazione: il core (sezione interna) andrà incontro ad un ingrandimento fino alla formazione di una nuova cellula e alla scomparsa della spora, cellula che andrà incontro alla normale divisione cellulare. TRASFERIMENTO ORIZZONTALE DEI GENI NEI BATTERI Nei batteri non c’è ricombinazione del genoma C’è però il trasferimento orizzontale del DNA, cioè il passaggio di una porzione del DNA orizzontalmente, senza passare per il meccanismo di divisione cellulare. Questo processo fa entrare nella cellula porzioni di DNA che si integrano con il DNA già presente nella cellula (formazione DNA integrato) SESSUALE : organismi che sono molto adattabili all’ambiente, tipica dei funghi SPORULAZIONE NEI FUNGHI 2 tipi principali di spore:
-Quando il glucosio termina inizia una fase di latenza -Ripresa della crescita utilizzando il lattosio INFLUENZA DELLA TEMPERATURA SULLO SVILUPPO MICROBICO Insieme al pH e l’attività dell’acqua, la temperatura rappresenta un fattore che determina il blocco o la stimolazione della crescita microbica. MICROBIOLOGIA 11 OTT 2022 INFLUENZA DELLA TEMPERATURA SULLO SVILUPPO MICROBICO Ogni microrganismo ha una propria scala di temperature cardinali (C°) Ad esempio, Escherica coli avrà una temperatura cardinale di 39°, a questa temperatura ci sarà il massimo della velocità della riproduzione Thermococcus celer avrà una temp. cardinale di 88° La temperatura cardinale dunque indica la temperatura OTTIMALE, mentre ogni organismo ha anche una temperatura MINIMA e MASSIMA per lo sviluppo microbico (che sarà comunque più lento) LEGGI DI BIGELOW: Prima legge: definisce quanto calore è necessario per abbattere i microrganismi di una quantità pari ad un ciclo logaritmico Seconda legge: definisce il rapporto tra tempo e temperatura ALTE TEMPERATURE: azione battericida/fungicida TRAMITE PASTORIZZAZIONE E STERILIZZAZIONE Temperature di pastorizzazione: 63° x 35 min (past. bassa ) / 75° x 15 sec (past. alta ): Hanno la stessa azione battericida, quella bassa però compromette il valore delle proteine, infatti si preferisce quella alta. Deve esistere un compromesso tra il tempo di esposizione ad alte temperature e la temperatura stessa Sterilizzazione : eliminazione di ogni forma vegetativa, incluse le spore BASSE TEMPERATURE: azione batteriostatica / fungistatica o battericida / fungicida -Refrigerazione (mantenimento della catena del freddo): da 0° a 5°: rallentamento sviluppo microbico -Congelamento: da -4° a -40°: possibile abbattimento carica microbica EFFETTO DEL PH SULLO SVILUPPO MICROBICO Generalmente i batteri tendono a preferire un ambiente neutro , i funghi un ambiente acido. Anche qui, ogni microrganismo ha un proprio valore cardinale, cioè pH minimo, ottimale e massimo Ph negli alimenti: Acqua pH 7 Carne bovina pH 5,6 - 6, Carne suina pH 6,2 - 6, Latte pH 6,6 - 6,
Crema (panna da cucina) pH 6, Succo d’uova pH 3,5 - 3, Al variare del pH cambia la tipologia di lavorazione di conservazione del prodotto Valori estremi pH generano ambienti difficili da colonizzare (da parte dei microrganismi) INFLUENZA DELL’ACQUA LIBERA SULLO SVILUPPO MICROBICO Chiamata anche attività dell’acqua (Aw): acqua presente non legata chimicamente Aw = P (pressione di vapore dell’alimento) / P0 (pressione di vapore dell’acqua pura) La quantità di Aw in un substrato dipende da: -umidità dell’ambiente -pH -Temperatura -Concentrazione dei soluti Una minore concentrazione di acqua in un prodotto garantisce poco sviluppo microbico, l’utilizzo di sale o zucchero negli alimenti diminuisce la quantità di Aw Ogni microrganismo ha una propria resistenza alla concentrazione di acqua libera, i più resistenti sono i funghi filamentosi che possono riprodursi in ambienti con pochissima concentrazione di Aw Mentre i batteri hanno una soglia minima leggermente più alta di Aw, cioè a loro serve più acqua per il loro sviluppo In definitiva ogni batterio, lievito o fungo filamentoso ha una soglia MINIMA e una OTTIMALE di Aw Alimenti (substrati) con Aw minore 0.50 rendono IMPOSSIBILE lo sviluppo microbico proprio per scarsità di acqua libera (es. sabbia del deserto, spezie, latte in polvere, elementi disidratati) INFLUENZA O2 SULLO SVILUPPO MICROBICO Vari tipi di microrganismi: AEROBI OBBLIGATI: O2 obbligatorio per la sopravvivenza e lo sviluppo ( esseri umani, funghi filamentosi, alcuni lieviti ) ANAEROBI FACOLTATIVI: O2 è richiesto ma non necessario per la sopravvivenza ( Staphylococcus spp, Enterobacteriaceae, Saccharomyces spp. ) ANAEROBI OSSIGENO-TOLLERANTI: O2 non richiesto ma sopravvivenza possibile anche in sua presenza ( Streptococcus thermophi-lus, Lactobacillus planta-rum) ANAEROBI OBBLIGATI: O2 dannoso/letale ( Cl. Boulinum ) MICROBIOLOGIA 18 OTT 2022 MICRORGANISMI FOTOTROFI E CHEMIOTROFI (autotrofi e eterotrofi) ORGANISMI FOTOTROFI : organismi che usano la LUCE come fonte di energia -Foto autotrofi : la fonte di carbonio è CO -Foto eterotrofi : la fonte di carbonio è C organico
L’entità tassonomica di livello più basso GERARCHIA PER L’IDENTIFICAZIONE -Ordine -Famiglia -Genere -Specie -CEPPO (individuo) Una popolazione di cellule di una coltura pura che differisce dalle altre appartenenti alla stessa specie per caratteri fisiologici e metabolici secondari COMPOSIZIONE DEI TERRENI DI COLTURA Elementi chimici: S zolfo 1% P fosforo 3% H idrogeno 8% O ossigeno 20% C carbonio 50% N azoto 14% Macromolecole: Proteine 55% Acidi nucleici 23% Lipidi e lipopolisaccaridi 11% Polisaccaridi 7% CLASSIFICAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA In funzione del tipo di ingredienti : -Complessi -Sintetici In funzione dello stato fisico : -Liquidi -Solidi (gelatina, agar ecc…) In funzione della possibilità di sviluppo dei differenti microrganismi : -Selettivi (focalizzati solo su un determinato tipo di microrganismi) Qui c’è l’uso di agenti selettivi, ad esempio antibiotici, centrimide, cloruro di sodio, cristal violetto, sali biliari, sodio azide, verde brillante) -Non selettivi (avviene lo sviluppo di tutti i microrganismi) MICROBIOLOGIA 24 OTT 2022 TECNICHE PER OTTENERE LE CONDIZIONI DI STERILITÀ Tramite agenti chimici: un composto che ha azione statica (se blocca il batterio/fungo) o azione cida (se uccide il batterio/fungo) Disinfettanti : composti usati su superfici inanimate (pavimenti, scrivanie)
Antisettici : composti che vengono usati per uso superficiale (alcol, acqua ossigenata) Chemioterapici : composto che può essere somministrato a livello interno (mal di gola) Tramite agenti fisici: Filtrazione: può essere: Di profondità: utilizzo di materiali (mepa) che hanno una porosità molto grande ma disposta in maniera irregolare per intrappolare i microrganismi Di superficie: la porosità è più piccola dei microrganismi presenti Radiazione UV : vanno a mutare il DNA dei batteri presenti sulle superfici Vantaggi: facilmente applicabile Svantaggi: formazione degli operatori, sterilizzazione non presente su superficie non colpita dalla luce Calore: Calore secco : incenerimento (brucia qualsiasi organismo in qualche secondo): usato per anse, aghi o pinze Calore umido : sterilizzazione (uccisione di tutti i microrganismi, anche le spore) o pastorizzazione (uccisione cellule vegetative, non le spore)
Differenziale di Ziehl-Neelsen: usata per differenziare i microbatteri da altre tipologie batteriche Utilizzo della CARBOFUCSINA (colorante), si colora il tutto, si decolora con alcol acido e si colora con blu di metilene per contrastare. Differenziale con Verde malachite: usata per mettere in evidenzia le endospore batteriche (colora le spore) Colorazione di tutto con verde malachite , lavaggio (decolorazione), colorazione di contrasto con safranina DETERMINAZIONE DEL NUMERO DI MICRORGANISMI Finalità: -Valutazione intensità di sviluppo di una coltura in terreno liquido -Valutazione della fertilità -Valutazione potabilità sorgente -Valutazione livello di contaminazione microbica di un alimento -Standardizzazione inoculo Tipologie: DIRETTA: Determinazione numero di cellule (conta microbica ) INDIRETTA: Misura di una grandezza di tipo fisico o chimico correlata dal numero di cellule MISURA DIRETTA SVILUPPO MICRBICO: conta Di 2 tipi: TOTALE o VITALE CONTA TOTALE: si tiene conto di ogni cellula, viva e morta Ho bisogno di un microscopio Ho bisogno di studiare su volumi noti (utilizzando vetrini Thoma-Zeiss)
CONTA VITALE: si tiene conto della crescite delle colonie, della torbidità e del viraggio degli indicatori del substrato (quindi su attività vitale) Su piastre Petri (substrato solido) : Si effettuano delle diluizioni di 1 mL di campione e mano a mano si depositano su piaste Petri, la conta viene effettuata fino a quando dopo tot diluizioni l’ultima piastra avrà 0 colonie. Su campanella di Durham (substrato liquido): metodo MPN Su membrana filtrante (cut-off o.22 um)
-Determinazione della biomassa cellulare: per pesata diretta, per turbidimetria o per determinazione dell’azoto cellulare -Determinazione attività metabolica: per produzione di CO2, consumo O2 o produzione ATP -Determinazione per via della conducibilità elettrica (variazione) DETERMINAZIONE SENSIBILITÀ AGLI ANTIBIOTICI Parliamo degli antibiotici, composti formati da “molecole ad azione antibioica”, molto importanti La maggior parte degli antibiotici sono sintetizzati da microrganismi come gli attinomiceti Negli anni gli antibiotici naturali hanno allargato la loro efficacia Sono suddivisi in: AGENTI ANTIBATTERICI e AGENTI ANTIFUNGINI Alcuni dei bersagli degli antibiotici sono: -Sintesi peptidoglicano -DNA girasi -RNA polimerasi -Metabolismo acido folico -Sintesi proteica -Struttura membrana citoplasmatica Come si può determinare la sensibilità di un microrganismo ad un antibiotico? -determinazione della MIC (minimal inhibitory concentration) di un antibiotico -determinazione sensibilità microrganismi ad un set di antibiotici -effetto battericida/batteriostatico I CICLI BIOGEOCHIMICI DEGLI ELEMENTI Forme di trasformazione degli elementi Passaggio continuo e ininterrotto da forme ossidate a forme ridotte o forme inorganiche a forme organiche Sono dei cicli continui che non si fermano mai
Microrganismi cocinvolti: funghi del marciume bianco, marciume molle e marciume bruno Enzimi coinvolti: fenolossidasi (laccasi, perossidasi, tirosinasi) MINERALIZZAZIONE HUMUS Microrganismi coinvolti: batteri e funghi mesofili 13 DIC 2022 CICLO DELL’AZOTO L’azoto è un elemento molto importante e molto diffuso nella nostra atmosfera Gli organismi in grado di assorbire l’azoto e convertirlo in azoto ORGANICO dall’atmosfera sono molto pochi, nemmeno le piante riescono Al contrario, i batteri riescono a convertire l’azoto atmosferico in azoto organico (e cioè assimilabile dalle piante) AMMONIFICAZIONE: parliamo di MICRORGANISMI AZOTOFISSATORI : convertono azoto atmosferico ( N2 ) in azoto ammonico ( NH3 ) NITRIFICAZIONE: parliamo di MICRORGANISMI NITRIFICATORI : trasformano lo ione ammonio NH4+ in ioni nitrito NO2+ Successivamente i MICRORGANISMI NITRATORI convertono gli ioni nitrito NO2+ in ioni nitrato NO3+ (dove è contenuto azoto inorganico che sarà assimilato dalla pianta che lo convertità in azoto organico) Successivamente l’azoto organico presente nelle piante passerà ai consumatori (animali) che una volta morti verranno degradati da batteri e funghi (MICRORGANISMI DECOMPOSITORI ) andranno a convertire l’azoto organico in ione ammonio NH4+ che verrà poi convertito attraverso la NITRIFICAZIONE (il ciclo ricomincia) CICLO DELLO ZOLFO Elemento importante che compone vitamine e altri componenti cellulari, è fondamentale per il funzionamento degli ENZIMI Lo zolfo elementare è ossidato in modo spontaneo da parte di batteri CHEMIOLITOTROFI E FOSINTETICI in modo da permettere un assimilazione da parte di piante e microrganismi che lo convertono in S organico Il S organico è poi ridotto da parte di BATTERI SOLFATORIDUTTORI per permettere il ritorno allo stato elementare COLONNA DI WINOGRADSKY Un dispositivo per coltura di una grande diversità di microrganismi Composta da: fango, acqua di stagno, fonte di C e fonte di S La colonna viene incubata al sole per alcuni mesi dove si può notare un gradiente di aerobiosi/anaerobiosi e concentrazione di zolfo INSILATI Metodo per la conservazione di foraggi, cereali ecc.. Hanno il vantaggio di: -minimizzare le perdite fogliari e altre parti vegetali -immagazzinare alimenti non foraggieri (trebbie di birra, polpe di bietola) -controllo date di taglio
Una delle bevande più diffuse, il paese primario che produce birra è la repubblica ceca, a seguire Germania e Austria Possono esserci diversi stili di produzione divisi in 3 grandi gruppi: LAGER: fermentazione bassa, saccharomyces carlsbergenis ALE: fermentazione alta, saccharomyces cereviseae LAMBIC: fermentazione spontanea La birra è il risultato di tanti processi chimici e biochimici (combinazione di vari ingredienti e vari enzimi) STORIA Pasteur: scoperta della fermentazione alcolica, prima non si conosceva Hansen: a lui dobbiamo la birra LAGER, scoperta del ceppo saccharomyces (lieviti) La birra LAGER: utilizzo del ceppo saccharomyces carlsbergenis , una birra più complessa rispetto alla ALE, fatta in casa dalle famiglie che invece utilizza il ceppo saccharomyces cereviseae Birrifici artigianali: movimento iniziato negli USA durante il proibizionismo DIFFERENZE TRA IMPIANTO INDUSTRIALE E ARTIGIANALE: -Dimensioni -Chiave del processo -La birra artigianale non viene pastorizzata e microfiltrata Gradi PLATO °P: indica la densità di una soluzione utilizzata nell’industria birraria INRGEDIENTI: ACQUA, ORZO, LIEVITI, LUPPOLO Acqua : i suoi sali minerali contribuiscono alla durezza e influenzano il gusto della birra. Inoltre viene usata nella lavorazione per pastorizzatori, frigoriferi, risciacquo e diluizione detergenti. Orzo : l’orzo distico è quello utilizzato per la birra, fornisce cariossidi più uniformi e grosse L’orzo è il cereale più usato perchè produce una quantità di enzimi maggiore ad altri cereali, è più resistente grazie alle protezioni coriacee e ha una equilibrata composizione (amidi, proteine, grassi) I SOSTITUTI DELL’ORZO : consentiti in molti paesi (in Italia però devono essere massimo il 40%), possono essere: riso, mais, frumento