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TECNICHE MICROBIOLOGICHE
Esistono vari metodi per controllare la crescita microbica: metodi fisici, chimici e con l’uso di antibiotici. Un microrganismo può essere inattivato o impedendone la moltiplicazione o uccidendolo. Se si tratta di un batterio, si parla di effetto batteriostatico (arresto della moltiplicazione) nel primo caso, e di effetto battericida (morte del batterio) nel secondo caso.
- ASEPSI : aggettivo asettico, pratica che previene la contaminazione di microrganismi indesiderati. Ad esempio dopo aver pastorizzato il latte, viene confezionato in contenitori sterili in modo che non venga ricontaminato.
- ANTISEPSI : riduzione del numero di microrganismi su una superficie dice costituita da tessuto vivente. Ad esempio strofinare la salute con un batuffolo di cotone imbevuto di alcol prima di eseguire un’iniezione intramuscolare.
- DISINFEZIONE : disinfettante, riduzione del numero di microrganismi su una superficie inanimata. Ad esempio strofinare la superficie piano di lavoro, un tavolo, con un batuffolo di cotone imbevuto di alcol.
- STERILIZZAZIONE : processo che distrugge ogni forma vitale (comprese le spore batteriche) in o su un determinato oggetto. Ad esempio sterilizzazione dei terreni di coltura in autoclave.
- SANITIZZAZIONE : eliminazione di microrganismi patogeni da oggetti o luoghi utilizzati dal pubblico. Ad esempio utilizzo di sostanze chimiche per disinfettare i piatti di un ristorante o le pubbliche toilette. Sanitizzazione è sinonimo di disinfezione, riferito a cose pubbliche. Per i funghi si parlerà di fungistatico, quando, cessata l'azione inibente, il microrganismo riprenderà moltiplicarsi. Un termine generico che si può applicare a tutti i tipi di microrganismi e germicida.
AGENTI FISICI : diversi agenti fisici possono essere utilizzati per il controllo della crescita microbica. Ad esempio le alte temperature e le radiazioni hanno un effetto microbicida; altri come la filtrazione, rimuovono fisicamente i batteri senza ucciderli. Alte temperature : l'esposizione alle alte temperature comprende l'utilizzo di calore umido calore secco. La morte dei microrganismi è di tipo esponenziale, cioè i microrganismi calano di numero di un logaritmo per ogni unità di tempo. Le forme vitali più resistenti sono le tendo spore batteriche, per essere tutte richiedono temperature superiori a 100°. Le cellule vegetative sono molto più sensibili delle spore al calore umido e si va dai tre minuti a 50° per Neisseria spp. i 60 minuti a 60° per disattivare Staphylococcus aureus. Le forme vegetative dei batteri sporigeni hanno la stessa termosensibilità delle cellule vegetative dei batteri non sporigeni e le forme (vegetative) patogene non sono più resistenti delle non patogene. I virus sono sorprendentemente resistenti al calore con un range di tolleranza debba dai 55 °C per cinque minuti fino ai 60 °C per 600 minuti. Ad eccezione delle spore, tutti i batteri (forme vegetative), lieviti, muffe, protozoi e virus sono distrutti dopo un'esposizione al calore umido di 80 °C per 20 minuti. Calore umido : ad una temperatura di 100 °C per 15 minuti, virtualmente, tutti i microrganismi, ad eccezione delle endospore batteriche, vengono uccisi. Altre spore resistono per più di cinque ore a 100 °C infine altre (come le spore dei batteri termofili) possono sopravvivere nell'acqua bollente per più di 20 ore. Questo metodo è raccomandato per la disinfezione (ad esempio dell'acqua da bere) ma non è raccomandato per una vera sterilizzazione. Vapore acqueo sotto pressione : per effettuare una sterilizzazione necessario portare il vapore acqueo sotto pressione per innalzare la temperatura al di sopra di 100 °C, si utilizza la autoclave. Sperimentalmente è stata determinata la temperatura di 121 °C per 10 minuti, come necessaria per distruggere ogni forma vitale comprese le spore. Per avere un margine di sicurezza maggiore, il materiale da sterilizzare viene mantenuto per 15 minuti o più sempre a 121 °C. Le sostanze che non possono essere sterilizzate ad alte temperature, perché potrebbero andare incontro ad una
denaturazione, vengono sterilizzate con la cosiddetta tindalizzazione , consiste nel sottoporre ad un flusso di vapore acqueo gli oggetti da sterilizzare per un tempo di 30-60 minuti. Una prima singola esposizione non uccide le spore, ma elimina solo le forme vegetative. Assumendo che le spore sopravvissute germinerà hanno trasformandosi in cellule vegetative termosensibili dopo essere state opportunamente incubate a 37 °C, si ripete l'operazione per due giorni successivi. Alla fine del terzo ciclo si è molto certi che tutte le spore esistenti saranno germinate e quindi distrutti attraverso la tindalizzazione, chiamata anche sterilizzazione frazionata. Viene usato per sterilizzare terreni di coltura contenenti sostanze come siero, tuorlo d'uovo o carboidrati, che facilmente potrebbero idrolizzare a una temperatura superiore ai 100 °C. Pastorizzazione : in questa tecnica il calore umido e applicato ai liquidi per eliminare i germi patogeni o alternativi, conservando nello stesso tempo la qualità nutrizionale e organolettica. Serve per eliminare i microrganismi responsabili delle alterazioni ad esempio del vino e della birra. Con la pastorizzazione a 72° centigradi per 15 sec sul latte, distrugge il 97-99% dei batteri e dei funghi ma non vengono eliminate le endospore o i cosiddetti batteri termodurici (non patogeni). Perciò il latte dopo essere pastorizzato non si può considerare sterile. Calore secco : non è versatile come quello umido, si può utilizzare sotto forma di aria calda o di fiamma (incenerimento). Aria calda : viene usata per gli oli, le polveri o determinati metalli e possono essere danneggiati da una ripetuta esposizione al vapore. Vengono utilizzate speciali stufe. Anche la vetreria viene sterilizzate in questa maniera esponendola per 2 ore a 160 °C. Incenerimento : utilizzato per distruggere carcasse, animali da laboratorio in effetti o altro materiale infetto del quale ci si deve liberare. Viene usato il becco di Bunsen o l'inceneritore a infrarossi. Basse temperature : rallenta l'attività enzimatica e quindi il metabolismo microbico. Se la temperatura si abbassa oltre un certo limite, l'attività metabolica cessa completamente la cellula smette di moltiplicarsi. Le basse temperature vengono utilizzate perciò per controllare la crescita microbica. Le alte temperature hanno un effetto microbicida, quelle basse hanno un effetto microbiostatico. Il congelamento viene usato in laboratorio per conservare i microrganismi (liofilizzazione). Radiazioni : vengono utilizzate per il controllo microbico le radiazioni ionizzanti e i raggi UV. Radiazioni ionizzanti hanno una piccolissima lunghezza d'onda ma un elevato contenuto energetico, provocano perdita di elettroni (quindi formazione di ioni). Le radiazioni ultraviolette, i raggi infrarossi e le onde radio costituiscono le radiazioni non ionizzanti, perché hanno bassa energia per far allontanare un elettrone dalla sua orbita. Nel caso delle radiazioni ionizzanti, si ha un'esclusione degli elettroni periferici degli atomi che vengono "bombardati". Sono molto sensibili le molecole del DNA, che facilmente si frattura non si colpite da raggi gamma. I batteri gram- positivi e i funghi sono più resistenti dei gram-negativi. Filtrazione : si usa per eliminare i microrganismi dei liquidi o dall'aria. Vengono utilizzati filtri che permettono il passaggio del liquido e dell'aria, impedendo il passaggio dei microrganismi. Questi quindi non vengono uccisi ma trattenuti nei filtri. Quando i liquidi contengono enzimi o vitamine e potrebbero essere alterati dal calore o dalle radiazioni, si usa soltanto questo metodo. Anche l'aria può essere contaminata da microrganismi patogeni, mediante l'uso di cappe a flusso laminare.
AGENTI CHIMICI : esistono fondamentalmente otto gruppi di sostanze chimiche che possono esser utilizzate come agenti antimicrobici. Sono: fenoli, gli alcoli, le aldeidi, i detergenti cationici, gli agenti ossidanti, gli agenti gassosi, gli alogeni e i metalli pesanti, vi rientrano anche gli acidi acetico, lattico, sorbico, benzoico. Questi ultimi usati nella conservazione degli alimenti. FENOLI : prima il fenolo veniva usato per ridurre le infezioni post-operatorie. Poi si è scoperto
AGENTI FARMACOLOGICI : comprendono chemioterapici e antibiotici. Per chemioterapici si intende un gruppo di sostanze chimiche dotate di azione antibatterica a scopo terapeutico. Gli antibiotici sono sostanze naturali prodotte da microrganismi e caratterizzate dal fatto di possedere una tossicità selettivamente diretta contro determinati gruppi batterici. I chemioterapici sono prodotti di sintesi, gli antibiotici sono prodotti da microrganismi. Gli antibiotici li dividiamo a seconda del loro meccanismo d'azione. Quelli che agiscono sui componenti cellulari (peptidoglicano e membrana esterna) e in farmaci che agiscono sulla duplicazione del DNA, sulla sua trascrizione e traduzione. Tra i farmaci che agiscono sulla parete batterica dobbiamo ricordare i β-lattamici (penicilline e cefalosporine), la vancomicina e la ciclocisteina. Le penicilline prodotte dal Penicillum chrysogenum , hanno tutte in comune un anello centrale β-lattamico, al quale da un lato è attaccato un anello tiazolidinico e dall'altro una catena laterale R. Questa può essere modificata, ottenendosi così le varie penicilline semi sintetiche (ampicillina, oxacillina, piperacillina, ecc.) più attive resistenti rispetto alle penicilline naturali come la penicillina G.
MORFOLOGIA E CITOLOGIA DELLE CELLULE BATTERICHE : I batteri si dividono forma cilindrica o forma sferica. Quelli di forma cilindrica sono chiamati bacilli , mentre quelli di forma sferica cocchi. Queste definizioni sono però molto riduttive. Le cellule cilindriche ad esempio, possono avere dimensioni ridotte in lunghezza tanto da sembrare dei cocchi, in questo caso vengono definiti coccoidi , oppure essere anche estremamente allungate. Quando i bacilli assumono forme ricurve a, sono chiamati vibrioni , mentre quando sono allungati e spiraliformi, sono chiamati spirilli se rigidi, o spirochete se flessibili. L'estremità della cellula cilindrica possono essere piatte, arrotondate o biforcute. Ci sono dei batteri detti pleomorfi , che hanno la capacità di modificare la morfologia delle cellule, in questa maniera resta difficile definire per questi microrganismi, una forma caratteristica. Sia i cocchi sia i bacilli possono presentarsi al microscopio come cellule isolate, ma molto più frequentemente possono dare origine a catene di cellule di varia lunghezza. La formazione di queste catene dovuta ad una incompleta separazione durante la mitosi. Una catena costituita da due cellule sferiche è detta diplococco , se la catena è più lunga si chiama streptococco , mentre se si ha un aggregato disordinato di cellule si chiama stafilococco. Una divisione cellulare un po' particolare porta alla formazione delle sarcine in questo caso la divisione cellulare avviene lungo tre assi perpendicolari, dando un aggregato a forma di cubo con quattro occhi per lato. Queste particolarità vengono usate per l'identificazione dei batteri. Anche i bacilli possono formare catene costituite da due cellule, i diplobacilli , o catene formate da un numero superiore di cellule, gli streptobacilli. Dimensioni cellulari : il diametro delle cellule procariotiche è compreso tra 0,1 - 2 μm; mentre la lunghezza è compresa tra 0,1 - 8 μm. C'è un'enorme variabilità anche nelle dimensioni della cellula. Considerando il diametro delle cellule eucaristiche (2-200 μm) e evidente che le dimensioni delle cellule batteriche sono molto ridotte, questa caratteristica è responsabile di alcune importanti proprietà biologiche. Il rapporto superficie/volume nelle cellule batteriche è molto elevato rispetto a quello delle cellule eucariotiche, cioè le cellule procariotiche hanno una superficie maggiore disponibile per effettuare gli scambi in entrata o in uscita con l'ambiente esterno. I batteri rispondono così molto rapidamente al variare delle condizioni ambientali esterne, poiché la velocità con cui avvengono gli scambi è molto elevata rispetto a quella richiesta da cellule di maggiori dimensioni.
STRUTTURA DELLA CELLULA Possiamo dividere la struttura delle cellule procariotiche intere regioni:
- la regione più esterna rappresentata da appendici attaccate saldamente alla superficie, come i flagelli, i pili e le fimbrie
- una regione costituita dalla membrana, da una parete cellulare, in alcuni casi da una membrana esterna, da una capsula e da uno strato S
- un acido plasmatica contenente il genoma, gli organuli, ecc. tutte le cellule batteriche anche se con differenze strutturali, possiedono la parete cellulare, la membrana cellulare, il citoplasma, il genoma e il ribosomi. Solo alcune cellule possiedono flagelli, capsula, strato mucoso, strato S. I microrganismi vengono divisi in due gruppi fondamentali sulla base di una diversa risposta alla colorazione di Gram: i batteri Gram-positivi e i batteri Gram- negativi. La divisione in questi due gruppi è legata alla diversa struttura dell'involucro della cellula. Tutti i gram-negativi possiedono una membrana esterna, assente nei gram-positivi, che ricopre la parete cellulare.
MEMBRANA CITOPLASMATICA : tutte le cellule la hanno. Doppio strato fosfolipidico, 8 μm. Separa l'interno della cellula dall'ambiente esterno, adibita al trasporto e alla trasmissione dei segnali, funzione biochimiche. I fosfolipidi hanno il gruppo fosforico idrolifilico, e gli acidi grassi idrofobici. Regioni polari all'esterno e acidi grassi all'interno. I fosfolipidi sono stato liquido-cristallino fluido, esso consente alla membrana di mantenere il corretto grado di fluidità. Questo stato è essenziale per il mantenimento della struttura per assolvere alle sue funzioni biochimiche. La temperatura influisce molto sulla fluidità della membrana. Quando la temperatura si abbassa, la cellula risponde aumentando la proporzione di acidi grassi con basso punto di fusione nel doppio strato fosfolipidico. Ci sono tre meccanismi di adattamento alla diminuzione della temperatura:
- accorciamento della catena degli acidi grassi dei fosfolipidi
- formazione di acidi grassi ramificati
- introduzione di doppi legami nella membrana cellulare sono presenti molecole proteiche con funzioni metaboliche ed enzimatiche. Sono caratterizzate da regioni idrofobiche le permette loro l'ancoraggio sulla membrana cellulare. Si definiscono proteine integrali di membrana quelle situate nel doppio strato fosfolipidico e proteine periferiche quelle localizzate solo in uno dei due strati della membrana.
FUNZIONI DELLA MEMBRANA CELLULARE :
- consente alla cellula di mantenere elevate concentrazioni dissoluti nel citoplasma
- Sede dei processi di trasporto delle molecole e di secrezione ed esporto
- coinvolta nei processi di crescita e divisione cellulare
- sede dei processi di trasformazione e mantenimento dell'energia, come la catena di trasporto degli elettroni, la fotosintesi e il mantenimento della forza proton-motrice.
È scarsamente permeabile ai soluti. Solo molecole idrofobiche di piccole dimensioni hanno capacità di attraversare il doppio strato fosfolipidico. È fortemente impermeabile agli ioni e alle molecole polari di elevata massa molecolare. Le proteine all'interno della membrana sono in grado di far passare singole molecole, la presenza nella struttura di α-eliche, permette le proteine di trasporto di stare all'interno della membrana. Ci sono due vie con quelle proteine permettono il passaggio di specifici soluti:
- la struttura terziaria delle proteine forma un canale che attraversa la membrana cellulare grazie alla presenza di numerose α-eliche.
- Oppure le proteine assumono con formazioni diverse che consentono specifiche molecole di essere trasportate dall'esterno all'interno.
Il trasporto attraverso la membrana è regolato dalle leggi della termodinamica, dividiamoli:
Deve avere la parete, un'adeguata porosità per gli scambi tra la cellula dell'ambiente ed una rigidità sufficiente a far fronte alle alte pressioni intracellulari. Il materiale che fornisce tali caratteristiche alla parete cellulare nei batteri è la mureina o peptidoglicano.
PEPTIDOGLICANO : è caratteristico solo delle cellule batteriche. La composizione, spessore di questo strato, elasticità, possono essere studiate dopo adeguati trattamenti effettuati sulle cellule batteriche allo scopo di ottenere i sacculi ; questi ultimi sono pareti cellulari ottenute per rottura meccanica delle cellule, trattate in modo tale da allontanare tutte le molecole associate al peptidoglicano. Una volta purificati, i sacculi sono composti esclusivamente da peptidoglicano, che può così essere analizzato per le sue proprietà fisiche e chimiche. Il peptidoglicano contiene due derivati polisaccaridici, l’N-acetil glucosamina e l'acido N- acetilmuramico, uniti da un legame glicosidico β-1-4. Questa porzione glicanica del peptidoglicano è comune a tutti batteri. Al gruppo carbossilico dell'acido N-acetilmuramico si lega un tetrapeptide composto di L-alanina, acido D-glutamico, acido diaminopimelico e D-alanina. Questo aminoacido può essere sostituito da L-lisina, come avviene nella maggior parte dei grampositivi. Il disaccaride e il tetrapeptide legato all'acido N-acetilmeuamico costituiscono un'unità che viene ripetuta fino a formare una sottile lamina. La rigidità e la robustezza della parete cellulare sono produce legami crociati che uniscono un aminoacido di un tetrapeptide con un aminoacido del tetra peptide adiacente, stabilizzando la struttura. Così si costituisce una sorta di rete che può essere più o meno fitta. Nei batteri gram-negativi il gruppo carbossilico della D-alanina, di una catena peptica, e il gruppo amminico dell'acido diaminopimelico, della catena adiacente, sono coinvolti in un legame peptidico. Nei gram-positivi , anziché un legame peptidico crociato diretto si forma un ponte peptidico costituito da aminoacidi, quali la glicina, la treonina, la serina e l'acido aspartico. In Staphylococcus aureus ad esempio, il ponte peptidico è costituito da un peptide composto da cinque molecole di glicina. Il numero delle grandi crociati diretti e dei ponti peptidici varia da un peptidoglicano all'altro, cioè da un microrganismo a un altro. Ovviamente il numero dei legami o dei ponti peptidici è elevato, maggiore sarà la compattezza e la rigidità della parete cellulare batterica. Anche il numero di strati di peptidoglicano influenza notevolmente la robustezza della struttura della parete cellulare. Un enzima fondamentale è il lisozima , presente in tessuti e in secrezione animali come la saliva e le lacrime, esso indebolisce tanto la struttura della parete cellulare batterica consentendo all'acqua per osmosi di entrare nel citoplasma e di far scoppiare la cellula. Questo enzima costituisce una difesa contro i batteri patogeni.
SINTESI PEPTIDOGLICANO : la sintesi dei precursori della parete cellulare avviene nel citoplasma e all'interno della membrana cellulare. La giunta delle unità ripetitive del peptidoglicano in crescita avviene all'esterno della membrana cellulare. La sintesi dei precursori della parete cellulare, inizia nel citoplasma e porta alla formazione dell’UDP-N acetilmuramilpentapeptide, chiamato anche pentapeptide di Pak.
DIVISIONE CELLULARE : è un processo che porta all'allungamento della cellula, alla costituzione del setto di divisione una con la formazione di nuovi poli, e al rimodellamento degli involucri cellulari, la membrana, la parete, la membrana esterna e l’S-layer, se presenti. Nella sintesi di no parete un ruolo chiave in questo processo è giocato dalle penicillin binding proteins , chiamate così perché legano alla penicillina. Il processo di allungamento e divisione cellulare necessita anche di specifici enzimi, le peptidoglicano idrolasi o autolisine. Questi enzimi tagliano i legami con la lente della mureina già presente nella parete, consentendo l'inserimento del peptidoglicano di nuova sintesi. Nelle cellule batteriche a forma bacillare esistono due vie d'incorporazione di peptidoglicano nella parete: la prima chiamata sintesi laterale , associata all'allungamento della cellula che avviene per
inserimento di peptidoglicano nuovo; la seconda via è la sintesi che avviene nella regione centrale della cellula e che porta alla formazione del setto.
MEMBRANA PERIPLASMATICA BATTERI GRAM-NEGATIVI (membrana esterna) : presentano una seconda membrana di gram-negativi composta da un doppio strato fosfolipidico, all'esterno della parete cellulare. Questa caratteristica è legata a una delle maggiori divisioni filogenetiche dei batteri, quella tra organismi con doppia membrana (i didermi ) e quelli che hanno una sola membrana citoplasmatica ( monodermi ). Questa membrana è costituita anche da lipopolisacaridi.
LIPOPOLISACCARIDI : nei batteri gram-negativi presentano una regione, il lipide A che è situata all'interno della membrana esterna. Questo è costituito da acidi grassi legati con un legame estere-aminico a un disaccaride composto da due unità di N-acetilglucosamina. La porzione esterna dei LPS è costituita dal core polisaccaridico , composto da chetodeossiottano, e da zuccheri come glucosio, galattosio ed eptosi, e dal polisaccaride O , composto da esosi. I LPS sono responsabili della reazione antigienica dei gram-negativi (antigene O). La regione compresa tra la faccia interna della membrana lipopolisaccaridica e la faccia esterna della membrana citoplasmatica è detta periplasma. In essa sono presenti enzimi degradativi la proteine coinvolte nel trasporto dei nutrienti all'interno della cellula e del metabolismo del peptidoglicano.
RUOLO MEMBRANA ESTERNA : è quella di barriera selettiva che controlla i flussi. Come quella citoplasmatica ha una scarsa permeabilità ai soluti idrofilici. Per consentire il passaggio dei nutrienti e l'uscita dei prodotti finali del metabolismo, essa presenta dei canali che consentono il passaggio non specifico di soluti idrofilici di bassa massa molecolare. Questi canali composti da proteine chiamate porine.
COLORAZIONE DI GRAM : questo tipo di preparazione consenta di raggruppare batteri in funzione di alcune proprietà fondamentali della membrana esterna. Le cellule batteriche sono prima colorate con un colorante basico il cristall violetto. Poi il colorante e allontanato con acqua e il preparato è trattato con la soluzione di Lugol , che contiene iodio e ioduro di potassio e allo scopo di rendere più stabile il cristall violetto durante la fase successiva. Le cellule sono poi trattate con una soluzione decolorante (etanolo, ecc.). Alla fine si colora il preparato con la safranina e si osserva il vetrino al microscopio. I gram-positivi risultano colorati di violetto, mentre i gram-negativi risultano essere del colore della safranina, cioè rossi. Il passaggio fondamentale della colorazione di Gram è quello della decolorazione. Nei batteri in gram-positivi la parete cellulare è costituita da numerosi strati di peptidoglicano funzionano una barriera nei confronti della soluzione decolorante, mentre i pori della membrana sottostante si chiudono e impediscono la fuoriuscita del cristal violetto. Il colorante che resta imprigionato nella cellula è il responsabile del colore violetto delle cellule dei gram-positivi. Nei gram-negativi invece, lo strato di peptidoglicano è molto sottile e il decolorante può rapidamente attraversare la membrana esterna e la parete, provocando fuoriuscita del cristal violetto. Poi questo verrà sostituito con la safranina, che darà a sua volta il colore rosso la cellula.
STRATO S (S-LAYER) : le cellule procariotiche nel corso dell'evoluzione hanno sviluppato strutture diverse a livello superficiale, determinando interazioni diverse con l'ambiente. Una di queste più importanti comuni a batteri e achea, è la presenza di strati proteici o glicoproteici che ricoprono la superficie cellulare, conosciuti come S-layer o strati S. Nei gram-positivi queste proteine ricoprono la superficie esterna del peptidoglicano, mentre nei gram-negativi aderiscono o penetrano nella
I batteri fotosintetici possono rispondere agli stimoli luminosi, fenomeno detto fototassi. In questo caso le lunghezze d’onda possono influenzare il moto dei batteri.
Antibiotici come l’eritromicina e il cloranfenicolo , agiscono sulla subunità 50S, bloccando l’attività dei ribosomi, ostacolando così la sintesi proteica. Altri antibiotici come le tetracicline , la kanamicina e la streptomicina , agiscono invece, sulla subunità 30S ottenendo lo stesso effetto
L’ENDOSPORA La spora (detta anche endospora perché si forma all’interno di una cellula vegetativa) è una forma di resistenza e sopravvivenza della cellula procariotica, che viene ad assumere uno stato di vita latente ( criptobiosi ) nel quale interrompe le proprie attività metaboliche. L’attitudine alla sporificazione o sporulazione è geneticamente codificata ed è propria di un limitato numero di specie Gram-positive.
FASI DELLA SPORIFICAZIONE : con stimoli ambientali, alla fine di un normale ciclo di crescita vegetativa, la cellula va incontro ad una divisione cellulare asimmetrica. La cellula in attività vegetativa corrisponde allo stazio 0. Nello stadio 1, detto di filamentazione assiale , i due cromosomi che vengono da una normale replicazione, assumono l’aspetto di un doppio filamento che si dispone lungo l’asse maggiore della cellula, dopodiché ( stadio 2, divisione asimmetrica ) la membrana citoplasmatica forma un setto spostato verso una delle estremità della cellula, isolando il materiale genetico della futura spora ( prespora ) da quello della restante porzione cellulare ( cellula madre o sporangio ). Insieme al materiale genetico viene catturata anche una piccola parte di citoplasma, che andrà a costituire il cosiddetto core della spora. Poi la cellula madre ingloba dentro di sé la prespora, che si trova così avvolta da una doppia membrana citoplasmatica, la propria e quella della cellula madre. Le due membrane (stadio quattro) sintetizzano nello spazio traesse uno strato di peptidoglicano definito cortex , mentre all’interno della prespora viene incorporata una grande quantità di dipicolinato di calcio. Lo stadio V vede la sintesi ulteriore rivestimento (tunica), di natura proteica, che può essere eseguito dalla formazione del cosiddetto esosporio , lipidico proteico, mentre la prespora va incontro a disidratazione.
NUTRIMENTO : una cellula microbica e costituita da carbonio, ossigeno, azoto e l’idrogeno. Il 6% è costituito da fosforo, zolfo, sodio e potassio. L’1,5% da calcio, magnesio e cloro. Lo 0,2% da ferro e il residuo 0,3% da cobalto, cromo, manganese, rame, selenio, zinco, vanadio. I terreni di coltura devono essere costituiti principalmente d’acqua e degli elementi chimici che rientrano nella composizione della cellula in quantità sia elevate (macronutrienti) si limitate (micronutrienti) Carbonio : i microrganismi hanno sviluppato la capacità di assimilare utilizzare un’enorme varietà di composti del carbonio, alcuni semplici come il monossido di ossido di carbonio, altri più complessi come carboidrati, i pentiti o gli acidi organici composti chimici di sintesi. In base alla fonte di carbonio più utilizzata questi possono essere classificati in autotrofi ed eterotrofi. Autotrofi : utilizzano prevalentemente anidride carbonica (carbonio nella forma più ossidata). Questi microrganismi per biosintetizzare il materiale organico, riducono la CO 2 consumando energia. Eterotrofi : richiedono fonti organiche di carbonio. Nella maggior parte delle specie in carbonio ricavato dal substrato organico entra nelle vie energetiche della cellula viene in parte eliminato come CO 2 (respirazione) e/o come CO 2 e altri composti organici (fermentazione). Ai terreni
colturali per questi microrganismi si devono aggiungere fonti di carbonio organiche (zuccheri, acidi organici, aminoacidi, ecc).
Azoto : un costituente di aminoacidi e basi azotate, utilizzato in forma elementare (N 2 ) dai batteri azotofissatori che lo prelevano direttamente dall’atmosfera e lo riducono (fissano) a NH 4 +. I microrganismi capaci di fissare l’azoto atmosferico invece l’utilizzano in forma combinata inorganica od organica. La gran parte dei microrganismi utilizzano azoto ammoniacale (NH 3 ) o è capace di assimilare il nitrato (NO 3 ).
Ossigeno : componente universale della cellula, alcuni microrganismi chiamati anaerobi obbligati , l’ossigeno molecolare non solo non è richiesto nel corso delle reazioni implicate nella produzione di energia ma addirittura tossico. Essi vivono in ambienti anossici e assumono l’ossigeno in forma combinata. Gli aerobi obbligati , invece, l’O 2 molecolare è un nutriente essenziale poiché, è l’accettore finale della catena di trasporto degli elettroni. Gli anaerobi facoltativi , pur richiedendo ossigeno, posso utilizzarlo meno come accettore finale degli elettroni e quindi produrre energia per via respiratoria o fermentativa, rispettivamente. Gli anaerobi aerotolleranti sono dotati di metabolismo fermentativo e pur non impiegando l’ossigeno come accettore finale di elettroni, non sono danneggiati dalla sua presenza.
Fosforo : necessario per la sintesi di acidi nucleici, fosfolipidi, ATP e altri composti ad alto contenuto energetico. La maggior parte di microrganismi utili del fosforo inorganico (PO 4 3-). Devono essere presenti nei terreni colturali.
Zolfo : ruolo strutturale in aminoacidi cisteina, metionina. Utilizzato sotto forma di solfati e solfuri. Potassio : importante cofattore di diversi enzimi, alcuni di essi coinvolti nella sintesi delle proteine. Magnesio : stabilizza ribosomi, membrane cellulari, acidi nucleici; essenziale per molti enzimi. Rientra nella composizione di clorofilla, è qnd importantissimo per microrganismi fotosintetizzanti. Calcio : stabilizza la parete cellulare, influisce sulla resistenza al calore delle endospore batteriche. Sodio : coinvolta nella regolazione della pressione osmotica.
Ferro : componente essenziale dei citocromi e delle proteine ferro-zolfo coinvolte nel trasporto degli elettroni e pertanto svolge una funzione importante nella respirazione cellulare.
FATTORI DI CRESCITA : composti organici necessari in piccole quantità, la loro presenza è indispensabile nel terreno culturale di alcuni microrganismi e non sono in grado di sintetizzarli. Comprendono vitamine del gruppo B, aminoacidi e basi azotate. Vitamine : composti organici che intervengono come gruppi prostetici o coenzimi. Alcuni microrganismi sono capaci di sintetizzare una o più vitamine e hanno quindi necessità di assorbire la molecola intera dal mezzo di crescita. Altri, possono sintetizzare la vitamina richiesta, purché siano disponibili nel mezzo di crescita intermedi di biosintesi. Aminoacidi : richiesti come costituenti delle proteine e alcune specie di batteri non sono in grado di sintetizzarli tutti. Basi azotate : necessarie in quanto costituenti degli acidi nucleici. Riguardo alle esigenze di fattori di crescita i microrganismi possono essere definiti:
- prototrofi : sono in grado di sintetizzare tutte le molecole indispensabili al proprio metabolismo a partire da composti organici o inorganici semplici in presenza di fonti energetiche. Non è necessario quindi aggiungere fattori di crescita ai terreni.
proteine e acidi nucleici si snaturano in modo irreversibile. All’abbassarsi della temperatura di processi biochimici e la velocità di crescita iniziano pian piano a rallentare fino ad arrestarsi ad una temperatura che spesso al di sopra del punto di congelamento dell’acqua. Per ogni tipo di microrganismo possiamo individuare tre temperatura chiamate temperature cardinali :
- temperatura minima ( Tmin ) al di sotto la crescita si arresta
- temperatura ottimale ( Topt ) si ha una massima velocità di crescita
- temperatura massima ( Tmax ) la crescita si arresta. In grado di sopportare aumento della temperatura siamo dividere i microrganismi in gruppi: mesofili (Topt circa 37°C), termofili (Topt tra 45 e 70° C), ipertermofili (Topt 80-115 °C), psicrofili (Topt 10-15 °C) i microrganismo che sono in grado di crescere a temperature vicine allo zero, ma anche ha una Topt tipica dei mesofili sono gli psicrotrofi.
EFFETTO DELLA TEMPERATURA SULLA MEMBRANA CITOPLASMATICA : è ben noto che la composizione della membrana cambia al variare della temperatura di sviluppo del cambiamento maggiore si ha nella composizione degli acidi grassi. Gli acidi grassi insaturi sono liquidi a basse temperature mentre si snaturano temperature modeste, quelli saturi sono stabili elevate temperature e solidi a temperatura ambiente. Questi cambiamenti hanno l’effetto di alterare l’ordine molecolare e la viscosità della membrana.
STRESS TERMICI : improvvisi abbassamenti o innalzamenti della temperatura inducono la sintesi di proteine da stress, proteine da shock da freddo (CSP) o proteine da shock termico (HSP). Risposta allo shock da freddo coinvolge l’espressione differenziale di geni per la produzione di quasi cinquanta diverse CPS, che assicurano la sintesi proteica a un’appropriata velocità anche a basse temperature. Il termine cold acclimation è utilizzato per quelle cellule che si sono adattati alle basse temperature dopo lo choc da freddo e hanno raggiunto lo sviluppo logaritmico con un nuovo tempo di generazione, più lungo. Anche in questo caso vengono espresse delle proteine CAP. Temperature non eccessivamente elevate possono portare ad un adattamento, modificando gli acidi grassi di membrana, accumulando osmoliti e possono proteggere le proteine, producendo spore e producendo HSP. Le chaperonine sono proteine che consentono il corretto ripiegamento delle proteine biosintetizzare; alcune sono prodotti in maggior misura dalle cellule nel corso di shock termici o di altra natura, con evidente funzione di riparare i danni prodotti delle proteine cellulari.
EFFETTO DEL pH SULLA CRESCITA MICROBICA : ogni microrganismi caratterizzato da un intervallo di pH entro il quale è in grado di crescere. Troviamo il pH minimo al di sotto del quale lo sviluppo non può avvenire; il pH massimo al di sopra del quale lo sviluppo non può avvenire; il pH ottimale al quale viene lo sviluppo migliore. Alcuni organismi hanno più di un pH ottimale per lo sviluppo. Dividiamo i microrganismi in neutrofili e crescono a pH neutro, basofili o alcalofili sviluppano a pH alcalino, superiore a 8,5 fino a 11,5; acidofili quelli che hanno un pH ottimale di sotto di 5, generalmente compreso tra pH 2 e 4 e possono sviluppare anche a pH 1. Il termine alcalotollerante o basofilo facoltativo è stato applicato specie e ceppi che sono capaci di sviluppare a pH 6,5-7,5 e soprammobili, cinque. Alcuni batteri sono acidofili obbligati. In questi microrganismi il mantenimento della stabilità della membrana è dovuto al elevate concentrazioni di idrogeno, ma quando il pH incrementa verso la neutralità, la membrana si disgrega e la cellula lisa.
OMEOSTASI : processo attraverso il quale le cellule mantengono un pH intracellulare relativamente costante, rispetto al valore di pH esterno molto ampi. Questo succede attraverso sistemi di trasporto di campioni la produzione di sostanze a effetto tampone. Per ottenere questo,
parete cellulare, che contiene polimeri acidi, funziona come una matrice caricata negativamente, riducendo il valore di pH sulla superficie cellulare.
OSSIGENO : gli aerobi obbligati richiedono ossigeno a concentrazione atmosferica per la crescita e per produrre energia. Concentrazioni superiori a quella atmosferica possono essere tossiche anche per gli aerobi. I macroaerofili sono quelli che, pur essendo aerobi obbligati, richiedono concentrazioni da 2 a 10%. Gli anaerobi non possono utilizzare l’ossigeno e sono distinti in anaerobi obbligati O 2 non tolleranti per i quali l’oxigen è tossico, e anaerobi obbligati O 2 tolleranti che tollerano modestamente l’ossigeno. Non potendo usare l’ossigeno, gli anaerobi ottengono energia attraverso processi fermentativi, la respirazione anaerobica e la fotosintesi. I batteri anaerobi pur essendo sensibili all’ossigeno li possiamo trovare anche in ambienti non totalmente anossici, quando vivono in associazione a batteri anaerobi facoltativi che consumano l’ossigeno. Gli anaerobi facoltativi sono organismi che possono passare da un metabolismo di tipo anaerobico ad un tipo aerobico (fermentazione o respirazione anaerobica) a uno di tipo aerobico. I lieviti possono essere a seconda della specie, aerobi obbligati o anaerobi facoltativi. Le muffe generalmente aerobi e crescono sulle superfici dei substrati. Diverse specie, tuttavia possono crescere anche in profondità o in mezzi liquidi, con basso tenore di ossigeno ( microaerofilia ).
METABOLISMO MICROBICO
Per metabolismo si definisce l’insieme delle reazioni chimiche che si svolgono a livello cellulare. Catabolismo : reazioni chimiche che portano alla produzione di energia. Anabolismo : reazioni endoergoniche che portano alla sintesi delle macromolecole complesse a partire da composti semplici (precursori metabolici). Se l’anabolismo e simile nei procarioti e negli eucarioti per molti aspetti, il catabolismo dei batteri presenta una varietà di meccanismi implicati nella conservazione dell’energia che li rende paragonabili a “catalizzatori biologici”, capaci di innumerevoli reazioni trasformazioni. Il metabolismo energetico, o catabolismo, e una parte del processo metabolico coinvolto nella conservazione dell’energia da utilizzare per la biosintesi e le altre funzioni della cellula.
RESPIRAZIONE : in questo processo metabolico il donatore di elettroni è rappresentato da sostanze organiche che inorganiche. L’accettore di elettroni è spesso una molecola inorganica.
- Respirazione aerobica: quando l’accettore terminale è l’ossigeno
- Respirazione anaerobica: gli accettore di elettroni sono sostanze inorganiche ossidate diverse dall’ossigeno, in qualche raro caso, sostanze organiche. Ogni processo respiratorio sempre caratterizzato da un flusso di elettroni, ceduti da un donatore organico o inorganico, lungo una catena di trasporto fino ad un accettore terminale. La rete energetica di questi processi dipende dalle differenze di potenziale delle coppie di ossido riduzione implicate.
Respirazione aerobica della sostanza organica : la sostanza organica funge da donatore di elettroni, questi percorrono una catena di trasportatori, vanno a ricadere sul ossigeno in qualità di accettore terminale con generazione di energia e produzione di acqua. Il mondo microbico è sempre in grado di utilizzare per la propria respirazione tutte le sostanze organiche di origine naturale, dalle più comuni e semplici, come zuccheri e aminoacidi, alle più complesse, inclusi idrocarburi alifatici e aromatici e alcaloidi. Il risultato finale di tutte queste trasformazioni è che in ogni composto organico viene convertito in composti inorganici (minerali) quali CO 2 e H 2 O, ma anche NH 3 e H 2 S. Si compie quel processo chiamato mineralizzazione della sostanza organica.
due tipi di enzimi, le transchetolasi che catalizzano il trasferimento dei due atomi di carbonio di un gruppo chetonico, e le transaldolasi , che trasferiscono un gruppo a tre atomi di carbonio. Questa tesi riconnette alla glicolisi a livello della gliceraldeide-3-fosfato (3-PGA).
Indipendentemente dalla via seguita, nei batteri aerobi il piruvato viene successivamente ossidato, in una reazione fondamentale alla quale partecipa complesso enzimatico della piruvato deidrogenasi e il coenzima A, ad acetil-CoA con produzione di un’altra mole di NADH. L’acetil-CoA entrerà successivamente nel ciclo di Krebs, che, alla pari della glicolisi, è una via metabolica fondamentale della cellula sia procariotica che eucariotica, nel cui processo ciclico si completa l’ossidazione del glucosio (1 mole) a 6 moli di CO2, con la produzione di altre tre moli di NADH, di 1 mole di FADH 2 e di 1 mol di GTP (energeticamente equivalente alla tipi).
La riossidazione di NADH e FADH 2 avverrà per trasferimento degli equivalenti di riduzione al primo trasportatore della catena avente adeguato E’ 0 e via via ai successivi trasportatori fino all’ossigeno, accettore terminale.
Catabolismo dei lipidi : dall’idrolisi del legame estere dei fosfolipidi, polimeri costituenti di tutte le membrane biologiche, vi hanno origine glicerolo e acidi grassi a lunga catena. Il glicerolo entra nelle vie metaboliche centrali in corrispondenza della fase a tre atomi di C della glicolisi, mentre gli acidi grassi vengono ossidati mediante β-ossidazione, questo implica il distacco graduale di unità a due atomi di C convogliate nel TCA come acetil-CoA.
Catabolismo delle proteine : i venti aminoacidi risultanti dall’idrolisi delle proteine, la cui demolizione converge nelle vie metaboliche centrali, a livello della glicolisi, dell’acetil-CoA o direttamente nel TCA, a dare come prodotti finali CO 2 , NH 3 e H 2 O.
Catabolismo di idrocarburi alifatici, aromatici e loro derivati : questi composti possono essere utilizzati da numerosi microrganismi eterotrofi come fonte di C ed energia. Essendo composti binari, devono subire una preventiva ossigenazione, catalizzata da enzimi che incorporano nei diversi substrati O 2 molecolare. Questi enzimi sono chiamati mono- o diossigenasi a seconda che introducano uno o due atomi della molecola dell’O 2.
Ossidazioni incomplete : la sostanza organica fonte di C ed energia non subisce una completa ossidazione a CO 2 , ma si ha un accumulo di composti solo parzialmente ossidati ancora organici. Queste ossidazioni incomplete possono essere causate da condizioni sfavorevoli, quali ossigenazione, temperature pH adeguati o condizioni nutrizionali non equilibrate come eccesso di C e carenza di N. Numerosi casi vengono sfruttati dall’uomo ad esempio per la produzione del cielo da parte di batteri ascetici, questo genere infatti manca di alcuni enzimi chiave del TCA perciò non sono in grado di completare l’ossidazione dell’etanolo: processo si arresta ad acido acetico.
Respirazione aerobica dei composti inorganici : la capacità di ricavare energia dalla sostanza inorganica è una peculiarità di alcuni gruppi microbici, che utilizzano composti organici ridotti come donatori di e-^ e generalmente l’O 2 come accettore terminale, ricavandone ATP tramite fosforilazione ossidativa. Quando la fonte di C utilizzata questi batteri è la CO 2 , questa forma di respirazione aerobica viene anche definita chemiolitoautotrofia. Per un po’ di tempo si era ritenuto che per questi singolari microrganismi la sostanza organica. Addirittura tossica capacità di ricavare elettroni dai composti inorganici fosse legata all’utilizzo della CO 2 come fonte di C (chemiolitoautotrofia obbligata). Questo concetto è stato bocciato perché molti di questi richiedono tracce di composti organici, quali fattori di crescita vitamine. Molti chemiolitotrofi hanno una flessibilità metabolica, con ricavando energia dall’ossidazione della sostanza organica, posso utilizzar come fonte di C anche la sostanza organica (chemiolitotrofi eterotrofi).
Respirazione anaerobica : processi energetici in cui l’accettore di ele, provenienti da composto org o inorg non è ossigeno, ma altra sostanza inorganica ossidata (i principali sono NO 3 -^ e SO 4 2-). Siccome in ogni caso l’accettore di ele ha E 0 meno positivo di quello dell’Oss, l’efficienza energetica della resp ana è sempre inferiore a quella della resp aerob. Ciò non sminuisce l’importanza della resp ana, perché rende possibile una completa degradazione della sostanza organica anche in assenza di ox purché sia presente un accettore di ele alternativo (mineralizzazione anaerobica). Questo particolare tipo di catabolismo è presente solo tra quei batteri anaerobi obbligati o facoltativi che sono in grado di accoppiare l’ossidazione di composti inorganici od organici (donatori di ele) alla riduzione di composti inorganici (accettori di ele) differenti dall’ox.
Metanogenesi : i metanogeni hanno la caratteristica esclusiva di usare la CO2 come accettore di ele. Questa capacità, per la quale la CO2 subisce progressive tappe di riduzione accettando equivalenti di riduzione dalla’H 2 fino alla produzione di CH 4 dipende dalla presenza nella cellula di cofattori e trasportatori di idrogeno e di unità C1, che sono stretta peculiarità di questi batteri. Gli enzimi implicati sono delle riduttasi e idrogenasi e contengono tracce di metalli che giocano ruolo fondamentale nel processo. I metanogeni che producono CH4 da CO2 e H2 si considerano chemiolitoautotrofi in quanto la CO2 è anche fonte di C.
La riduzione della CO2 richiede 8 ele, che provengono, nel caso dei metanogeni autotrofi, da 4 molecole di H2, e procede con l’intervento di trasportatori come il metanofurano, la tetraidrometanopterina e il coenzima M. La prima reazione della metanogenesi da CO2 a dare formilmetanofurano (formil-MFR), con l’intervento di MFR, come primo trasportatore, è altamente esoergonica ed è catalizzata da una deidrogenasi che riduce la CO2 a – CHO. Il gruppo formile viene poi trasferito alla tetraidrometanopterina, analogo del tetraidrofolato, e sotto forma di formil-H 4 MPT ciclizza a metenil-H 4 MPT e poi viene ridotto a metilen- e poi a metil-H 4 MPT. Queste ultime riduzioni richiedono F 420 H 2 come donatore di ele. Infine il gruppo metilico è trasferito al gruppo tiolico del coenzima M ad opera di una metil transferasi, e di qui condensato con il coenzima B. la successiva scissione riduttiva genera CH4 e un disolfuro misto. Quest’ultima reazione è catalizzata dalla metil-CoM riduttasi, il vero enzima chiave della metanogenesi, che contiene un gruppo prostetico unico, il CoM.
LA FERMENTAZIONE : processo metabolico anaerobico in cui il donatore ed accettore di ele è la sostanza organica. Il NADH prodotto dall’ossidazione di un composto organico, non può scaricarsi sulla catena di trasporto, in quanto nei microrganismi fermentanti mancano i citocromi. Pertanto, per rigenerare il pool di NAD+^ indispensabile alla cellula per il proseguimento del processo catabolico, il NADH si riossida a spese di un composto org intermedio a valle, che funge da accettore di ele: la fermentazione è quindi un processo ossido-riduttivo bilanciato al suo interno. Nella ferm non si ha completa ossidazione del composto organico di partenza, i quali mantengono gran parte dell’energia del composto iniziale, perciò la resa energ della ferm non è paragonabile a quella dei processi resp, e l’ATP viene generato soltanto per trasferimento di un gruppo fosfato, legato ad un intermedio del processo con un legame ad alto contenuto energetico, all’ADP. La ferm è caratteristica di molti microrganismi anaerobi obbligati e facoltativi. Condizione necessaria per far si che un composto sia fermentescibile è che il suo grado di ossido-riduzione sia praticamente pari a quello del materiale cellulare: composti troppo ossidati o troppo ridotti non possono essere fermentati.
Come nei processi respiratori, i polisaccaridi per poter essere utilizzati devono prima essere idrolizzati a monomeri semplici, i quali a loro volta vengono convertiti in glucosio, da cui partono tutte le vie fermentative.
anelli pirrolici. Le clorofille differiscono tra loro per alcuni dei sostituenti presenti sugli anelli pirrolici, in base a queste peculiarità assumono nomi diversi (clorofilla a , b , batterioclorofilla a , batterioclorofilla b , ecc.) e presentano spettro di assorbimento della luce diversi. Sono presenti in aggiunta alle clorofille, i carotenoidi, i quali sono caratterizzati dalla presenza di molti doppi legami coniugati e svolgono funzioni importanti per i microrganismi fototrofi: contribuiscono all’assorbimento della radiazione luminosa, trasferendo l’energia così assorbita dai pigmenti del centro di reazione, e proteggono i microrganismi fotosintetici la possibilità di causa dell’eccessiva quantità di energia luminosa che può colpire le cellule. I carotenoidi assorbono la luminosa nell’intervallo tra i 430 e i 555 nm, seconda delle loro caratteristiche chimiche, contribuendo così ad ampliare il campo di lunghezze d’onda della radiazione solare nei quali i microrganismi fotosintetici sono in grado di ricavare energia.
Fotosintesi ossigenica : microrganismi assorbono l’energia luminosa per mezzo di due fotoreazioni condotte da due diversi complessi pigmenti-proteine, denominati fotosistema I e fotosistema II , questi differiscono tra loro per la lunghezza d’onda del massimo assorbimento. Il fotosistema I assorbe a 700 nm, mentre il fotosistema II assorbe a 680 nm.
- Questi operano in serie collegati da una catena di trasporto di ele. Nel fotosistema I, l’assorbimento di due fotoni di luce e il trasferimento dell’energia dei fotoni al centro di reazione causa il passaggio di due molecole di due molecole di clorofilla P700 del centro di reazione, strettamente accoppiate tra loro, a uno strato eccitato nel quale assumono un potenziale redox molto negativo.
- la clorofilla P700 torna poi allo stato fondamentale cedendo un ele ad un accettore primario che a sua volta cede l’ele alla ferredossina (proteina presente in molti processi redox cellulari), la quale può tornare alla forma ossidata cedendo ele attraverso due possibili vie: 1° = fotofosforilazione ciclica , gli elettroni ceduti dalla ferredossina tornano alla clorofilla P donatrice. Al trasferimento di elettroni è associata l’estrusione di protoni, con conseguente formazione di una forza proton-motrice trans-membrana. Quindi gli elettroni erano stati ceduti dal pigmento P700 per effetto dell’assorbimento della radiazione luminosa, tornano ridurre il pigmento donatore attraverso quello che viene definito russo ciclico di elettroni. 2° = fosforilazione non ciclica , la ferredossina cede elettroni al NADP+^ con formazioni conseguente di NADPH. La clorofilla P700, che aveva ceduto elettroni all’inizio del processo, non può più riacquistarli per cui la riduzione della clorofilla può quindi avvenire soltanto utilizzando gli elettroni sottratti all’acqua da parte del fotosistema II, processo ossidativo ha come conseguenza sviluppo ox. L’uso dell’acqua come donatore di ele per riduzione del NADP+^ è processo termodinamicamente sfavorito, dal momento che implica che gli ele siano trasferiti da un donatore con potenziale redox estremamente positivo ad un accettore con potenziale redox molto negativo. La notevole quantità di energia necessaria per condurre questo viene resa disponibile con il coinvolgimento di ambedue in fotosistemi, dall’assorbimento di due fotoni per ogni ele trasferito dall’acqua al NADP+.
Il processo ha inizio con l’assorbimento di due fotoni da parte del fotosistema II, che li trasferisce ai pigmenti P680. Questi assorbono massimo a 680 nm e sono del fotosistema II, passano allo stato eccitato, dal quale decadono cedendo elettroni all’accettore primario, (feofitina, molecola di clorofilla priva dell’atomo di Mg centrale), il quale li cede poi a una catena di trasporto, la quale cede a sua volta gli elettroni al pigmento P700 ossidato del fotosistema I, andando così a sostituire quelli ceduti alla ferredossina. Il pigmento P680 ossidato ritorna allo stato ridotto utilizzando gli elettroni che ricava dall’ossidazione dell’acqua. Al trasporto di elettroni è associata la formazione di una forza proton-motrice, causata dall’accumulo di ioni H+^ nella faccia interna dei tilacoidi.
completare il processo, sia nella 1° che nella 2°, si ha la formazione di ATP attraverso l’attività del complesso dell’ATPasi, che sfrutta la forza proton-motrice generatasi nel trasporto degli elettroni per sintetizzare ATP a partire da ADP e Pi.
SESSUALITA’ DEGLI EUCARIOTI : i microrganismi hanno i gameti uguali fisiologicamente e morfologicamente (isogameti), l’unica differenza sta nella loro polarità sessuale, possono essere indicati come + e -.
Coincidenza di germe soma : nei lieviti non esiste una differenza fra le cellule aploidi che crescono vegetativamente e quelle che svolgeranno la funzione di gameti. La connotazione sessuale fra due isogameti avviene mediante la totale fusione del citoplasma ed i nuclei. Poiché la coniugazione riguarda l’intera cellula, l’eredità citoplasmatica non segue solo la linea “femminile” è il risultato del rimescolamento e dell’eventuale segregazione casuale dei mitocondri e dei plasmidi; è perciò impossibile distinguere il donatore e ricevente del materiale sessuale.
Riproduzione sessuale regolata dalle condizioni ambientali : la sporificazione, e la conseguente coniugazione delle cellule aploidi derivate dalle spore, avviene solo quando si verifica una serie di circostanze: scarsità nutrizionale e presenza di fonti di carbonio respirabili come il glicerolo o il glucosio a bassa concentrazione. La sporificazione e la coniugazione avvengono solo per una porzione limitata della popolazione di lieviti, si possono perciò trovare nella stessa cultura cellule di riproduzione ed altre in fase vegetativa.
Anomalie cromosomiche : le macrorganismi è essenziale che i corredi cromosomi ci parentali siano assolutamente coincidenti per evitare problemi di appaiamento con conseguenti anomalie gravi e, talvolta, letali. Nei microrganismi questo non è necessario.
Omotallismo ed eterotallismo : l’omotallismo è la possibilità da parte delle cellule di cambiare il tipo sessuale nel corso della propria esistenza, con cambiamento di tipo sessuale ad esempio da + a -. I ceppi eterotallici invece mantengono sempre lo stesso tipo sessuale. Il cambiamento di tipo sessuale degli omotallici segue due regole:
- ad ogni divisione una cellula produce due cellule dello stesso tipo sessuale
- una cellula + o - può cambiare tipo sessuale solo dopo aver gemmato almeno una volta. A partire dalla seconda generazione mitotica, le colture hanno un’età cellule + e metà cellule -, questo rende possibile molti incroci spontanei all’interno della stessa colonia con la produzione di una colonialista composta di aploidi (-), aploidi (+) e diploidi (-+)
Parasessualità : avviene la fusione di cellule con parziale scambio di materiale genetico. Spesso questo scambio asimmetrico, cioè una cellula agisce da donatore ed una da ricevente. Non avviene uno scambio di tutto il genoma, ma solo di una parte. Dopo lo scambio si ha qualche rimescolamento del DNA, producendo cellule ricombinanti però non stabili, perché possiedono una parte del DNA acquisito ad ogni generazione successiva, a meno che non siano sottoposte a selezione per mantenimento dei caratteri ricombinanti.
MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI : essenziali sono le trasformazioni della materia organica operate dai microrganismi, che attraverso il processo di mineralizzazione, viene resa disponibile per nuove forme di vita. Sintetizziamo la natura ciclica delle trasformazioni: Attraverso la conversione dell’energia solare, la CO2 e altri composti inorganici sono trasformati in organici che entrano in una catena alimentare che può interessare svariati esseri viventi. Prima di
