MICROSCOPIO OTTICO IN FLUORESCENZA
Un modo per contrastare i campioni è tramite l’uso di sostanze fluorescenti.
COS è LA FLUORESCENZA?? È una proprietà intrinseca di alcuni materiali che se stimolati da un fascio di
luce, emettono una propria luce con una determinata lunghezza d’onda.
•LUCE DI ECCITAZIONE= luce stimolante
•LUCE DI EMISSIONE=luce emessa
La luce di emissione ha una lunghezza d’onda maggiore di quella di eccitazione POSTULATO DI
GEORGE STOCKES
Egli notò che nel momento in cui si eccitava una sostanza fluorescente con un onda corta (ad alta
frequenza),essa diventava un onda lunga in quanto si aveva una perdita di energia.
Per capire il perché di questo fenomeno, si fece riferimento al fatto in cui l’onda di eccitazione induce lo
scatto di un elettrone che va in un orbitale più esterno per poi ritornare nell’orbitale più interno. per
spostarsi nell’orbitale più esterno ha bisogno di energia, mentre quando torna nell’orbitale di partenza
emette energia; l’energia emessa si va ad addizionare all’onda di emissione che quindi avrà lunghezza
d’onda maggiore di quella di eccitazione.
In base alla lunghezza d’onda di emissione, a ciascuna sostanza si attribuisce un colore:
VERDE per lunghezza d’onda di 520/530nm colorazione della F-actina
BLU per lunghezza d’onda di 440/450nm colorazione dei mitocondri
ROSSO per lunghezza d’onda intorno ai 600nm colorazione del DNA
Tuttavia essendo lo spettro del visibile limitato (400-700nm), non si riescono a separare bene le varie
curve, di conseguenza gli spettri potrebbero sovrapporsi creando il problema dell’OVERLAPPING con
conseguente formazione di colori intermedi come l’arancione; quindi NON possiamo usare più sostanze
fluorescenti sullo stesso campione altrimenti non abbiamo buone immagini. è un LIMITE
Esistono inoltre delle sostanze naturali nelle cellule che possono renderle fluorescenti, parliamo quindi di
AUTOFLUORESCENZA. un esempio è la clorofilla nelle cell.vegetali che emette nel rosso(600nm), quindi
non posso usare altre sostanze fluorescenti che rientrano in quel range di lunghezza d’onda.
Anche gli animali marini sono in grado di emettere fluorescenza a causa di proteine tra cui la GFP il DNA
può essere trattato con la GFP che viene inserita nel genoma,e la cell. diventa fluorescente.
Una sostanza fluorescente è il TC1 che quando viene eccitata a 490nm, emette due picchi:
-uno a 530nm che equivale al colorante non aggregato;
-uno a 590nm che equivale al colorante aggregato.
COS è IL FLUOROCROMO?? È un colorante caratterizzato da fluorescenza con una sua ex ed em.
Esempi di fluorocromi sono: FITCH, DAPI(colora il DNA nelle cell. morte), TEXASRED(colora il nucleo),
ARANCIODIACRINA(colora i nuclei).
La caratteristica è che alcuni fluorocromi riconoscono i loro target su cui agire tramite: potenziale di
membrana, acidità,affinità ecc.; in altri casi invece questo non si ha e si ricorre
all’IMMUNOFLUORESCENZA.
Il MICROSCOPIO A FLUORESCENZA è un microscopio ottico con 2 lampade led (EPIFLUORESCENZA)
piuttosto potenti.
NOTA!! in passato veniva usata la lampada a mercurio che era molto forte ma si riscaldava facilmente.
Esso tuttavia non ha una risoluzione maggiore rispetto al microscopio ottico perché in entrambi i casi
usiamo la luce visibile. il microscopio a fluorescenza serve solo per mettere in evidenza strutture in
modo ben visibile in quanto si va ad eliminare tutte le interferenze che creano le altre componenti.
PERCHÉ BISOGNA AVERE UNA LAMPADA MOLTO POTENTE?? Perché il fascio di luce che usiamo per la
fluorescenza viene tagliato in quanto alcune frequenze sono dannose.
PERCORSO OTTICO: luce fluorescente(ex)FILTRO DI ECCITAZIONEdeviata dallo specchio
campione emFILTRO DI EMISSIONE oculare
