MICROSCOPIO A CONFOCALE
Il microscopio a confocale permette di visualizzare e mettere a fuoco più piani focali grazie ad una
scansione puntiforme del campione.
Esso viene chiamato anche MICROSCOPIO LASER a CONFOCALE a causa della sua sorgente luminosa: il
LASER che è caratterizzato dall’avere onde luminose non caotiche, coerenti e unidirezionali. inoltre ha un
elevata penetrabilità percorrendo distanze molto ampie con un intensità luminosa molto potente.
Esso ha anche un elevata energia e un intensità luminosa molto elevata.
Ovviamente questo microscopio NON HA GLI OCULARI in quanto l’immagine è tutta ricostruita e
per metterla a fuoco si usa la luce trasmessa(lampada normale) o la luce a fluorescenza.
Il laser viene ristretto ad un punticino detto PINHOL che dovrà passare attraverso i filtri di emissione e di
eccitazione, quindi il punticino viene ristretto ancora di più e alla fine la luce che andrà ad eccitare il
campione sarà molto piccola e a sua volta la luce che ci restituisce il campione sarà piccola ma potente.
Questo punticino può anche ingrandirsi e più apro il punticino e più trasformo il microscopio confocale in
un microscopio elettronico il limite massimo del microscopio a confocale è il microscopio a
fluorescenza.
Quindi:
-se apro troppo il punticino ottengo il microscopio a fluorescenza (se apro il diaframma ad 1)
-se lo apro poco ottengo immagini nitide ma deboli.
Quindi devo trovare il giusto compromesso tra intensità luminosa e pinhol.
Con un punticino così piccolo, la sostanza fluorescente si eccita poco, perciò bisogna amplificare il segnale
della luce di emissione, per fare questo metto nel percorso ottico un FOTOMOLTIPLICATORE che amplifica
il segnale.
Tale punticino non può essere applicato ad una luce normale in quanto essendo molto piccolo, con la luce
normale svanirebbe.
Quindi i tre elementi principali del confocale sono: LASER, PINHOL e FOTOMOLTIPLICATORE.
PRO:
▪risolve il BLUR della fluorescenza= toglie le sbavature consentendo di distinguere due punti ancora più
vicini rispetto al microscopio a fluorescenza.
Inoltre è più veloce della deconvoluzione perché l’immagine viene ricostruita dopo pochi secondi.
▪permette di collezionare le immagini in pacchetti di immagini (STACKS) ricostruendo l’immagine in 3D
▪riduce il bleaching in quanto se la zona in questione viene bruciata ci si può spostare su un’altra zona.
▪permette il FRAP cioè una cofluorescenza: un fluorocromo agisce attivando il fluorocromo vicino.
CONTRO:
▪è costoso
▪può indurre FOTOTOSSICITÀ creando calore nella zona colpita dal laser
▪può indurre FOTOBLEACHING nella zona osservata facendo decadere la fluorescenza.
▪immagine molto definita rispetto alla fluorescenza
APPLICAZIONE…
Si possono usare fluorocromi sensibili agli ioni calcio in modo da valutare il calcio intracellulare.
In alcuni casi devo iniettare nelle cellule la sostanza fluorescente, mentre in altri casi posso usare il gruppo
acetil-metile (=fa da carrier) che entra in cellula andando a trasportare il colorante. in cellula ci saranno
delle ESTERASI che staccano il colorante dal gruppo a-m e la sostanza fluorescente viene trattenuta nelle
cellule.
