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Continuo lez precedente.. MUTAZIONI: CONSEGUENZE MOLECOLARI (a livello proteico) Stiamo parlando di mutazioni che cadono nella regione codificante. Queste possono avere un meccanismo da aploinsufficienza, da gain of function o una dominanza negativa. La dominanza negativa è la più complicata da interpretare e non si è mai sicuri prima di fare dei saggi funzionali se la mutazione con cui abbiamo a che fare sia effettivamente una dominanza negativa, infatti, lo stesso fenotipo potrebbe essere anche dovuto a una dominanza dovuta ad aploinsufficienza. Esempio di dominante negativo Consideriamo una situazione in cui abbiamo una mutazione che colpisca un allele deputato alla formazione di una subunità di una proteina recettore transmembrana che è un omodimero. Possiamo avere le seguenti combinazioni: una subunità mutata e l’altra no, una subunità sana e l’altra mutata, due subunità non mutate, due subunità mutate. Quindi avremo il 50% dei dimeri formato da una subunità mutata e l’altra no, il 25% formato da due subunità non mutate e il 25% formato da subunità mutate. La condizione in cui l’omodimero presenta una subunità normale e una sana produce comunque una proteina non funzionante. Quindi, pur essendo l’allele colpito da mutazione uno solo, il 75% delle proteine prodotte non sarà funzionante. In questo caso la dominanza negativa sta nel fatto che il prodotto dell’allele mutato rende inattivo anche il prodotto dell’allele normale. In questa situazione è inutile quantificare le proteine, pur essendo prodotte in quantità normali il 75% di esse sarà non funzionante, diversamente dal 50% che ci si attenderebbe. Una situazione simile si ha con i recettori transmembrana attivati in seguito al legame del ligando che ne induce la dimerizzazione. Esempio di Gain of function: una gain of function si ha, per esempio, nei casi di acondroplasia ed è dovuta alla mutazione del gene FGFR3, il quale codifica, come nell’esempio precedente, per un recettore transmembrana. Questa mutazione fa si che il recettore codificato dal gene FGFR3 non si attivi solo quando è presente una certa concentrazione di ligando ma sia attivo costitutivamente, quindi anche in assenza di ligando. L’attivazione di questo legando attiva a sua volta dei fattori di trascrizione che determinano l’ossificazione da parte dei condrociti. Il problema in questo caso risiede nel fatto che anche se solo il 50% dei recettori transmembrana rimane in uno stato attivato, questa % è sufficiente a dare i segni della malattia. Quindi il problema in questo caso non risiede nella mancanza della proteina ma nel fatto che essa svolge un ruolo dannoso per l’organismo. MALATTIE MENDELIANE AUTOSOMICHE DOMINANTI Causate da un allele mutato dominante localizzato su un cromosoma autosomico. Se il quadro clinico non pregiudica la fitness (capacità riproduttiva), il pedigree è caratterizzato da una trasmissione verticale in cui ciascun individuo affetto ha uno dei due genitori anch’esso malato. Altrimenti la mutazione o è de novo, o ha una penetranza incompleta o è presente un mosaico (presenza di almeno 2 linee cellulari diverse) in uno dei due genitori. Se uno dei genitori ha un mosaico per la mutazione è possibile che non abbia alcun segno clinico di una malattia grave, perché magari ha solo poche cellule con la mutazione e possibilmente queste poche cellule sono anche confinate solo al tessuto germinale e in questo caso si parla di mosaicismo germinale. In questo caso il genitore non darà alcun segno clinico della patologia ma improvvisamente può spuntare un figlio malato che avrà ereditato la patologia dal genitore affetto da mosaicismo.
Qual è la trappola di questa situazione nel caso della consulenza genetica? Se due genitori vengono per una consulenza genetica, perché hanno avuto un figlio con una malattia dovuta ad una mutazione e vogliono sapere che probabilità c’è che se faranno un altro figlio questo avrà la stessa malattia, noi ricercheremo nel DNA dei genitori la stessa mutazione. Se non la troviamo potremmo dedurre che si sia verificata una mutazione de novo e quindi diremo ai genitori che se avranno un altro figlio la probabilità che esso avrà la stessa mutazione sarà quasi nulla. L’evento de novo infatti avviene esclusivamente per caso, quindi la probabilità che si verifichi due volte consecutive è quasi nulla. Però in questo caso potremmo commettere un errore!!! Si potrebbe trattare di un caso di mosaicismo germinale che abbiamo scambiato per una mutazione de novo dando quindi informazioni errate ai genitori che si potrebbero così ritrovare con un secondo figlio affetto. È difficile infatti distinguere fra una mutazione a mosaico germinale e una de novo. In questi casi c’è un rischio residuo di mosaicismo germinale che di solito è stimato dal 2 al 3%. Il rischio di essere affetti è uguale nei maschi e nelle femmine. Ci possono ovviamente essere delle eccezioni, es le mutazioni che danno disabilità cognitiva sono meglio tamponate nelle donne (più resistenti) rispetto ai maschi. Il rischio di ricorrenza (probabilità di un genitore affetto di avere un figlio malato) è del 50%. AUTOSOMICHE RECESSIVE Causate da 2 mutazioni presenti in entrambi gli alleli. Causate da due alleli recessivi di uno stesso gene localizzato su un cromosoma autosomico. Il gene mutato può essere omozigote (come avviene spesso in condizioni di consanguineità) oppure in eterozigosi composta (due diverse mutazioni recessive, una per ciascun allele).
- I genitori di un figlio affetto non sono malati ma portatori sani di un allele recessivo.
- Il rischio di essere affetti è uguale per i maschi e per le femmine
- Il rischio di ricorrenza (probabilità per i genitori portatori di avere un figlio malato) è del 25%.
- La probabilità per due genitori portatori di avere un figlio portatore sano è del 50% Dominanti e recessive: considerazioni Molte malattie dominanti sono più gravi (omozigote generalmente molto più grave). Mutazioni diverse sullo stesso gene possono provocare una malattia dominante o recessiva. Questo significa che non è il gene a essere dominante o recessivo ma è la mutazione ad esserlo. Per esempio in un allele può intervenire una mutazione loss of function per cui esso produce una proteina che non è funzionante o non la produce, oppure, può essere colpito da una mutazione gain of function; quindi il gene in un caso si comporta da recessivo e nell’altro da dominante (non è il gene a essere recessivo o dominante ma è il gene più la mutazione in questione a essere dominante o recessivo). Mutazioni in trans: mutazioni su alleli diversi.
oncosoppressore RB1. Il retinoblastoma può esistere o in forme sporadiche, cioè in situazioni in cui nelle famiglie di un individuo affetto non ci sono altri casi, oppure, può essere ereditaria. Nelle forme sporadiche il tumore ha un insorgenza monolaterale (cioè su un occhio solo) e c’è un solo spot (clone) da cui parte il tumore. Nelle forme ereditarie invece la patologia si presenta bilateralmente e si possono vedere punti di inizio (cloni) del tumore diversi. Nelle forme ereditarie parliamo di penetranza incompleta perché anche se questi bambini ricevono l’allele mutato dal genitore, nel 10% dei casi non sviluppano il tumore. Che differenza c’è tra l’avere la forma ereditaria e la forma sporadica? Nella forma sporadica la mutazione colpisce l’allele rb1 in una cellula della retina, affinché si sviluppi il tumore nel bambino si deve avere la mutazione dell’altro allele proprio nella stessa cellula colpita della retina, questo è un evento molto improbabile. Nelle forme ereditarie invece già c’è già una mutazione di base in tutte le cellule della retina, quindi è sufficiente che intervenga una seconda mutazione in qualsiasi cellula della retina perché si sviluppi il tumore. Quindi la differenza fra il retinoblastoma ereditario e sporadico è che mentre il primo parte con una mutazione che ha già in tutte le cellule, l’altro deve avere due mutazioni de novo. Ma, il fatto che quando un bambino riceve l’allele rb1 mutato ha il 90 % di probabilità di avere la malattia deriva dal fatto che questo tipo di mutazione da un vantaggio proliferativo, a differenza di quanto avviene per esempio in altre malattie in eterozigosi come la fibrosi cistica. Infatti se per esempio in una cellula somatica del mio corpo interviene una mutazione per la fibrosi cistica non mi succede nulla, al massimo muore quella cellula, perché tale mutazione non costituisce un vantaggio proliferativo per la cellula in questione, come invece avviene per cellule colpite da mutazione nel gene rb1. ESPRESSIVITA’ VARIABILE L’espressività variabile si riferisce al grado di severità del fenotipo di una malattia o in altre parole è il grado con cui un determinato genotipo si manifesta a livello fenotipico. Una malattia può essere a penetranza completa ed espressività variabile, può avere tutte e due le cose, o solo espressività variabile. Può dipendere da fattori ambientali (esposizione ad agenti dannosi, stile di vita ecc ecc), genetici e epigenetici. Nel caso di fattori genetici, l’EV può essere dovuta a loci genetici modificatori o a eterogeneità allelica. L’EV è un meccanismo che consente la sopravvivenza dell’allele mutato nella popolazione. Classico esempio di espressività variabile è la neurofibromatosi: La Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) è la più comune malattia genetica autosomica dominante (prevalenze 1/3000 individui). Alcuni pazienti manifestano solo macchie caffelatte (da iperpigmentazione) noduli di Lisch ( amartatomi dell’iride) e pochi neurofibromi (tumori benigni dei nervi periferici). Altri, anche all’interno dello stesso nucleo familiare, hanno manifestazioni cliniche molto più gravi con centinaia di neurofibromi, gliomi del nervo ottico, disabilità intellettive, ipertensione, scoliosi e tumori maligni (l’espressività dipende dal back ground genetico dell’individuo e da fattori ambientali per cui il grado di espressione della patologia ne risulta variabile). La penetranza della NF1 è di circa il 100% ( malattia a penetranza completa e a espressività variabile) ETEROGENEITA’ ALLELICA E DI LOCUS L’eterogeneità allelica si verifica quando mutazioni diverse sullo stesso gene causano espressività variabile. (es. mutazioni diverse del gene che codifica per la catena ß dell’emoglobina possono causare varie forme di ß-thalassemia , anemia falciforme o altre emoglobinopatie). L’eterogeneità di locus è quando ad un determinata malattia genetica o ad un determinato fenotipo possono essere responsabili molti geni diversi (es paraparesi spastiche possono essere causate dalla mutazione di più di 50 geni).
Questo può dare qualche problema a livello di diagnosi genetica. In questo caso che si fa per fare diagnosi? In passato si teneva conto dell’epidemiologia, cioè del fatto che il 40% delle forme di paraparesi spastica dominante è dovuto a un gene chiamato spastina, l’spg4. Quindi si verificava la presenza di una mutazione in questo gene ma, ovviamente, nel 60% dei casi non si trovava la mutazione. Se non si trovava la mutazione in questo gene si procedeva ad esaminare l’spg3A, la cui mutazione era presente in un altro 10% degli individui, se ancora non si trovava nulla si esaminava l’spg presente in un altro 5-6% dei casi di paraparesi spastica. Il risultato finale era che in circa il 45% dei casi, dopo aver eseguito questi test, non si riusciva comunque a capire dove fosse la causa della patologia e quindi non si poteva prevedere cosa sarebbe accaduto in eventuali figli. Ad oggi questo sistema è stato superato dalla tecnica chiamata NGS, next generation sequencing. Si parla invece di un gene con effetti pleiotropici o di pleiotropia quando mutazioni di un gene sono responsabili di molteplici effetti fenotipici. ( es. fibrosi cistica con conseguenze polmonari, ghiandole sudoripare, pancreas). CONSENGUINEITA’ E RISCHIO DI MALATTIE RECESSIVE La consanguineità aumenta il rischio di avere malattie recessive. Avendo antenati in comune, individui parenti tra loro hanno dei tratti identici di genoma. Questi tratti sono detti IBD ( identical by descent) e sono tanto più ampi, quanto è più stretta la parentela. Figlie e genitori e fratelli hanno in comune il 50% del genoma; cugini di 1° grado 1/8 del genoma, cugini di 2°, 1/32 del genoma. Un figlio avuto da un partner parente ha dunque alte probabilità di ricevere lo stesso tratto genomico IBD dai due genitori, con il conseguente rischio di avere ampi tratti di omozigosità. Ciò fa aumentare considerevolmente il rischio di malattie recessive. Esempio: Seguiamo una sola coppia di cromosomi, il resto li trascuriamo. Sono due coppie di omologhi, li rappresentiamo con colori diversi perché hanno delle piccole variazioni tra loro. Nella prima generazione abbiamo un maschio e una femmina. La femmina riceve un cromosoma marrone dal padre e uno bianco con la mutazione recessiva dalla madre con un pezzettino blu dovuto a crossing-over. Nella seconda generazione la figlia femmina eredita un grigio (che non ci interessa) dal padre e un bianco e blu con un pezzettino di marrone (dovuto ancora una volta a crossing over) dalla madre. Il figlio maschio eredita dal padre il bianco e blu con un pezzettino di verde (da crossing over). Questi ultimi due sono cugini, si piacciono e fanno 3 figli, di cui 2 affetti. Possiamo seguire la ricombinazione del materiale genetico attraverso gli STR (che sono marcatori polimorfici)e individuare così la regione in cui è presente la mutazione che da malattia. Quindi avere figli con un consanguineo aumenta la probabilità che, nel genoma di questi, siano presenti tratti di DNA con una mutazione recessiva in omozigosi che quindi darà malattia e ciò è dovuto all’elevata percentuale di DNA in comune tra i genitori. Da internet: eccessiva consanguineità porta all’omozigosi di geni letali, naturalmente presenti in una popolazione ma non pericolosi in eterozigosi. L’omozigosi, tuttavia, si può verificare anche in individui con consanguineità 0, ciò è dovuto al fatto che in una popolazione non esistono infiniti alleli per un gene. Adesso passiamo al calcolo dell’IBD: Questa situazione ci dice che la perdita di eterozigosità nel figlio è di circa il 6%: ci aspettiamo che il 6% del genoma di questo bambino abbia gli alleli perfettamente identici. Una tecnica nota come SNP array permette di fare il genotyping su tutto il cromosoma e fa risultare lampante la perdita di eterozigosità in questi individui (figli di fratelli). Il genetista quindi va a cercare le zone con
quest’ultima per esempio è assolutamente random, avviene in maniera post zigotica, nei primissimi stadi embrionali (mentre l’imprinting è pre zigotico) e avviene solo nelle donne. 4 LEZIONE: I geni coinvolti nell’imprinting ci interessano perché possono attivare alcuni meccanismi patogenici se sono associati ad alcune mutazioni geniche. Il fenomeno dell’imprinting non coinvolge tutti i cromosomi ma solo: il 6, il 7, l’11 e il 15, in particolare del 15 la regione pericentromerica. In quest’ultimo caso quando il difetto risiede nell’omologo derivante dal padre si ha la sindrome di Prader Willi, si ha l’Angelmann quando il difetto risiede sul cromosoma che proviene dalla madre. L’inattivazione del gene è controllata dalla metilazione. L’allele che deve essere silenziato è metilato a livello delle isole CpG le quali si trovano a livello del promotore. La metilazione è uno degli eventi epigenetici più frequenti nel genoma dei mammiferi ed è una modificazione chimica covalente ereditarie ma reversibile. La metilazione del DNA è un processo biochimico mediante il quale l’enzima DNA metiltransferasi (DNMT) aggiunge un gruppo metilico alle citosine, (se seguite da una guanina) trasformandola in 5-metilcitosina. La metilazione della citosina in posizione 5 del carbonio da un ingombro sterico che impedisce l’attacco dell’RNA polimerasi, per cui gli alleli soggetti a questo fenomeno non sono trascritti. N.B. l’imprinting ha luogo prima della fertilizzazione, nella cellula uovo e nello spermatozoo (cioè nei gameti) ed è diretto da un centro chiamato centro dell’imprinting. Nell’imprinting viene silenziato in modo preciso o l’allele materno o quello paterno, invece nell’x inattivazione il silenziamento avviene in modo casuale, indipendentemente dal fatto che l’x derivi dalla madre o dal padre. Inoltre l’X inattivazione non avviene a livello gametico ma nei primissimi stadi embrionali. Risultati dell’imprinting:
- L’allele di un gene è espresso, l’altro è silenziato
- L’espressione allelica dipende da quale genitore l’allele è ereditato. Meccanismi patogenetici nelle malattie legate all’imprinting:
- Difettidell’imprinting
- Mutazioni geniche I meccanismi risultano in un’inattivazione di geni che dovrebbero essere espressi. Quindi l’imprinting ci interessa perché se associato a mutazioni da luogo ad una malattia o un’altra in base al fatto che interessi un cromosoma materno o uno paterno. Si ottengono due entità cliniche completamente diverse a seconda che l’imprinting, e quindi la metilazione delle citosine, interessi il cromosoma materno o quello paterno. Un esempio è dato dalla sindrome di Prader Willi e da quella di Angelmann: entrambe dipendono da mutazioni che avvengono nelle regioni soggette a metilazione. NB: La maggior parte dei geni, immediatamente dopo la fecondazione (stadio post-zigotico), subisce un'ondata di demetilazione che interessa la quasi totalità del genoma. I geni sottoposti ad imprinting vengono esclusi da questo fenomeno, proprio perché la metilazione in questo caso serve ad indicare la provenienza parentale del gene SINDROME DI PRADER WILLY (PWS) e SINDROME DI ANGELMAN (AS): Il difetto è sul cromosoma 15 (15q11-q13) per entrambe le patologie. abbiamo un paziente con la sindrome di Algelman se l'affezione colpisce il cromosoma 15 derivante dalla madre, quindi quello materno. Invece abbiamo la patologia PWS se la mutazione colpisce il cromosoma 15
paterno. Su questo tratto del cromosoma 15 noi abbiamo dei geni che vengono espressi solo dall'allele paterno ed altri geni che sono espressi solo dal cromosoma materno. Di fatto abbiamo una diploidia, ma è come se fosse una monosomia funzionale: abbiamo entrambi gli alleli ma uno non è espresso, quindi è trascrizionalmente silente, mentre è espresso solo uno dei due alleli. Quindi questo avviene anche se abbiamo un gene completamente Wild type sull'altro cromosoma che però non viene considerato. Questo è il concetto di imprinting genomico: espressione monogenica per alcuni geni che è associata alla linea parentale. Quindi abbiamo due copie del gene, due alleli, uno può essere Wild type e invece uno mutato: se il mutato presenta il gene ANGELMAN sul cromosoma materno che deve essere espresso, basta la mutazione di quell'allele per esprimere la patologia; invece se abbiamo una mutazione sul gene ANGELMAN del padre quel gene è silente, non trascrizionalmente attivo quindi il figlio sarà assolutamente normale. (Nel cromosoma paterno può esserci il gene mutato che però non è espresso). PWS è una patologia dovuta a un gene che ha espressione paterna e in questo caso si dice che è ad imprinting materno (La cromatina dove risiede questo gene è metilata per cui trascrizionalmente inattiva). La Prader-Willi avviene x diverse cause: -Delezione di una regione, totale o parziale, sul cromosoma 15 di origine paterna. Questa particolare regione è sottoposta ad imprinting parentale e risulta attiva nel cromosoma paterno mentre è inattiva in quello materno. -Mutazioni nel centro dell’imprinting. -disomia uniparentale -mutazioni geniche Disomia uniparentale materna: presenza di due copie di origine materna su entrambi i cromosomi 15, risultando entrambe inattive anche se possono essere uguali o diverse. Mutazioni geniche. Disomia uniparentale: Con il termine disomia uniparentale si definisce l’ereditarietà di due cromosomi omologhi da un solo genitore; è causata principalmente da eventi di non-disgiunzione, seguiti da meccanismi di correzione di trisomie o monosomie. I pazienti affetti dalla sindrome di Prider Willi hanno: bassa statura, ipotonia, obesità dovuta alla mancanza del senso di sazietà, ipogonadismo e disturbi del comportamento, disabilità intellettiva (comune anche alla sindrome di Angelmann). Nella sindrome di Angelmann invece abbiamo epilessia e disturbi psichiatrici assenti nella PWS. Vediamo il meccanismo molecolare delle due sindromi: Abbiamo tra le due sindromi lo stesso difetto molecolare ma due quadri clinici diversi. Per capire come ciò sia possibile consideriamo i 4 geni evidenziati nella figura: essi sono attivi quando sono presenti sul cromosoma paterno (il fatto che sono attivi trascrizionalmente è indicato con la freccetta sopra di essi); gli stessi alleli di questi geni sul cromosoma materno invece non funzionano perché sono fisiologicamente inattivati in tutti noi. Poi c’è un 5° gene, coinvolto nei processi di ubiquitinazione, l’UBE3A, che si comporta esattamente al contrario: è attivo quando è presente sul cromosoma materno e inattivo quando è presente sul cromosoma paterno. Ora vediamo il caso delle delezioni. Primo esempio: caso della delezione paterna che avviene
TRASMISSIONE X-LINKED RECESSIVA:
Nella donna Recessiva vuol dire che i due alleli devono essere colpiti o in eterozigosi composta o in omozigosi. Da un punto di vista genetico e per un dato gene sul cromosoma X, una donna può essere omozigote per un allele normale, eterozigote oppure omozigote per un allele mutato. Da un punto di vista funzionale però l’eterozigote , essendo in ogni cellula un allele silenziato, sarà espresso o l’allele normale o quello mutato. ( la metà delle cellule esprimerà l’allele normale, l’altra metà quello mutato). La donna eterozigote produrrà quindi circa il 50% del prodotto genico atteso e spesso non dà alcun fenotipo. Il maschio mutato, avendo un solo allele, non può che esprimere la malattia. Se ne deduce che la malattie X-linked recessive sono molto più frequenti nei maschi che non nelle femmine. Consideriamo che nelle cellule autosomiche eterozigoti per una mutazione si ha il 50% del prodotto funzionante e che questo 50% è relativo al contributo che da ogni singola cellula, cioè tutte le cellule daranno il 50% del prodotto perché in tutte è presente la mutazione. Il 50% del prodotto se è presente una mutazione sull’X è invece dato dalla somma dei contributi delle cellule dove l’allele funzionante non è stato silenziato. NB.Tenendo in considerazione ciò, quando il 50% del prodotto genico è insufficiente nel caso dell’X inattivazione? Quando questo gene è necessario per la sopravvivenza cellulare, infatti, le cellule che non hanno questo prodotto muoiono. Invece, se il prodotto fosse stato per esempio un ormone, il fatto che ne sia prodotto solo il 50% non influenza la sopravvivenza cellulare perché esso entra in circolo e raggiunge tutte le cellule, anche quelle che non lo producono. Nel caso del pedigree in figura: -Nelle malattie X linked recessiva la malattia ai figli maschi non può che essere trasmessa dalla madre -L’allele X-linked recessivo può essere trasmesso attraverso una serie di donne carrier non affette saltando anche una o diverse generazioni. -L’allele può essere passato da un padre affetto ad una figlia che sarà carrier non affetta. -Il numero di maschi affetto è molto più alto di quello delle femmine affette. La malattia non impedisce la fitness, infatti, vediamo che il maschio affetto può procreare. Se il padre è affetto tutte le figlie femmine sono portatrici obbligate. Un classico esempio didattico di malattia recessiva X-linked è quello dell’emofilia A, che è stato presente nella famiglia reale inglese. È causata da mutazioni del gene X-linked F8, codificante il fattore VIII della coagulazione. È una malattia ad espressività variabile, cioè, il livello di gravità con cui si presenta può variare molto da un individuo all’altro e ciò è legato al fatto che essa può essere dovuta a mutazioni di diverso tipo. Le forme più gravi sono dovute a mutazioni missense o frameshift. L’allele mutato segrega come una classica mutazione recessiva. Era una malattia in molti casi mortale durante l’infanzia, oggi è possibile instaurare un’efficace terapia con somministrazione della proteina f8 prodotta da DNA ricombinante.
X-LINKED DOMINANTE:
Le forme dominanti legate al cromosoma X sono più rare di quelle recessive. Le femmine eterozigoti sono affette. Quando non è letale nei maschi, quelli affetti sono circa la metà delle femmine affette (i padri affetti possono trasmettere l’allele mutato solo alle figlie mentre le madri affette possono dare l’allele mutato sia a un maschio che ad una femmina). Usualmente la malattia non salta una generazione. LO SBILANCIAMENTO DELL’X-INATTIVAZIONE E SUOI RIFLESSI NEL FENOTIPO FEMMINILE Il rapporto dell’X-inattiv. tra cromosoma paterno e materno in una donna è normalmente del 50 % circa. Cioè, in metà delle sue cellule sarà inattivato il cromosoma proveniente dal padre, nella restante metà quello materno. In certe condizioni, questo rapporto può essere alterato portando ad uno sbilanciamento (skewing) tra lo stato d’inattivazione dei due cromosomi. Di norma quest’evento non ha alcuna conseguenza clinica. Nelle donne carrier di una mutazione X-linked invece, lo stato del bilanciamento dell’X- inattivazione può avere conseguenze importanti:
- Se è inattivato prevalentemente il cromosoma X in cui è localizzato l’allele mutato, la donna può risultarne protetta in quanto nelle sue cellule si esprime solo l’allele sano. In questo caso alleli che sarebbero dominanti segregano con modalità recessive.
- Se invece è inattivato prevalentemente il cromosoma X in cui è localizzato l’allele sano, la donna può manifestare segni clinici anche in una forma X- linked recessiva. Skewed X-inactivation: Sindrome ATRX-> La sindrome alfa-Talassemia/ritardo mentale (ATRX) è legata a mutazioni del gene pleiotropico (come avevamo visto anche nel caso del gene per la fibrosi cistica) ATRX, legato al chr X e coinvolto nel rimodellamento della cromatina ATP- dipendente. I soggetti affetti sono maschi con disabilità intelletiva, microcefalia, dismorfismi facciali, anomalie genitali e forme variabili di α-talassemia. Lo stato di completa X-inattivazione del cromosoma che porta l’allele mutato protegge le portatrici. I pochissimi casi di donne portatrici con X-inattivazione random, risultano avere un fenotipo clinico. Le donne che hanno questa mutazione non presentano alcun segno clinico a livello fenotipico e hanno una particolarità: hanno un pattern dell’X-inattivazione completamente sbilanciato. Il cromosoma che porta la mutazione è sempre inattivato, mentre quello sano non lo è mai. Ma perché c’è un pattern di X-inattivazione completamente sbilanciato? Perché le cellule che presentavano l’allele X mutato inattivato stavano bene e quindi sopravvivevano, quelle che invece non avevano l’allele X mutato inattivato non potevano replicare. Per verificare questa situazione è possibile fare l’analisi dei polimorfismi che permette di identificare un cromosoma rispetto ad un altro, in particolare in questo caso, si studia un polimorfismo (un trinucleotide) che si trova all’interno del gene per il recettore degli androgeni. Questo però non basta, dobbiamo anche capire quale dei due alleli è metilato (cioè è stato inattivato). Come facciamo? Processiamo il DNA con i bisolfiti che trasformano le citosine metilate in uracile e poi possiamo discriminare questa cosa. Perché invece nella sindrome di Rett, legata ad una mutazione (delezione) nel gene MECP2 sul cromosoma X, le donne non hanno un pattern di X inattivazione sbilanciato, ma hanno il classico pattern di inattivazione del 50%? Teniamo presente che nella sindrome ATRX abbiamo un gene pleiotropico che è espresso ubiquitariamente, quindi il gene mutato comincia a fare danno da subito, mentre nella sindrome di Rett il gene mutato interviene ad avere un effetto dopo la migrazione neuronale, cioè dopo la formazione dei vari
durante la replicazione che fanno si che la polimerasi aggiunga più repeat di quanti non ce ne fossero nella copia originale). Fra le malattie più comuni dovute a espansione di triplette vi sono le atassie spinocerebellari, spesso ad esordio abbastanza tardivo. Oltre 20 malattie sono state associate con espansioni dei repeats. Esse si possono sommariamente raggruppare in tre categorie (in base alla porzione del gene in cui avvengono): •I° Espansioni CAG o CTG in una porzione codante di un gene (prevalentemente associate a disturbi neurologici , es. Hungtington, varie forme di Atassie Spinocerebellari). Ciò è dovuto al fatto che, trovandosi nella regione codante del gene, portano alla produzione di un numero di aa superiore a quello normale. I repeats normali sono di solito sotto i 30-35 mentre i patologici > 50
- II° Espansioni GAC, GCT, GCG, GCA in una porzione codante del gene (più eterogenee da un punto di vista clinico, es Pseudoacondroplasia). I repeats normali sono di solito sotto poche unità. •III° Include la sindrome dell’X-fragile, la distrofia miotonica ed altre forme di atassia come quella di Friedreich. L’espansione avviene in sequenze non codificanti (5’UTR, 3’UTR o introni). SINDROME DELL’X-FRAGILE La sindrome dell’X-fragile è caratterizzata da un pattern dismorfologico peculiare con orecchie grandi e faccia allungata, disabilità intellettiva e macroorchidismo nei maschi. Nella quasi totalità dei casi è dovuta ad un’espansione di un repeat CGG, localizzato nel 5’UTR del gene del cromosoma X FMR1. La sua prevalenza è di circa 1/4000 nei maschi e circa la metà nelle femmine dove si manifesta usualmente in forma più lieve a causa dell’x-inattivazione. L’allele normale ha una lunghezza <55 repeats mentre l’allele mutato > 200 repeats. L’allele intermedio (55-200) è chiamato premutato in quanto favorisce la successiva espansione ad allele mutato che è trasmessa per via materna. (Il soggetto non ha nulla a livello clinico ma ha un’altissima probabilità di produrre una generazione con fenotipo clinico. Infatti, maggiore è il numero di ripetizioni, maggiore è la tendenza della polimerasi a sbagliare. Un numero di ripetizioni > di 200 viene chiamato FULL mutation o mutazione completa). La cosa peculiare è che l’espansione delle triplette non avviene nella linea paterna, ovvero, non avviene durante la meiosi dei padri, ma avviene nella meiosi materna. Questo vuol dire che un padre premutato non avrà mai una figlia con la full mutation. Avrà semplicemente una figlia premutata. Una madre premutata invece avrà molto probabilmente una figlia o un figlio con la full mutation. I maschi premutati trasmettono l’allele premutato alle figlie ma non l’allele espanso mutato. Dunque maschi con l’allele premutato non hanno figlie affette ma solo premutate in quanto l’ulteriore espansione è trasmessa per via materna. Le loro figlie premutate invece possono avere figli affetti. Vediamo il pedigree: Abbiamo una donna sana con un numero di ripetizioni di 29 in un allele e di 30 sull’altro, quindi siamo nel range della normalità. Le sue figlie sono invece nel range del premutato. Il padre invece è un premutato (ha un solo allele essendo maschio con un numero di ripetizioni pari a 80): egli trasmette un allele con le sue ripetizioni alle due figlie, la prima di esse riceve un allele dalla madre (numero di ripetizioni uguale a 30), e uno dal padre, (numero di ripetizioni pari a 76 (a volte il numero di ripetizioni può ridursi da una generazione all’altra invece di aumentare)), la seconda figlia riceve un allele dalla madre e uno dal padre (in questo caso c’è un aumento del numero delle ripetizioni :da 80 passa a 83), il maschio eredita l’unico allele dalla madre. Quindi in questa prima generazione siamo sempre in uno stato di premutazione (non ci sono affetti totali).
Una situazione drammatica si osserva invece nella seconda generazione. Vediamo che l’allele nel corso delle generazioni si espande dando un quadro clinico sempre più grave: anticipazione. FMR1: La proteina codificata da FMR1 è coinvolta nel trasporto dell’mRNA fuori dal nucleo, nella regolazione della traduzione e nella plasticità sinaptica. I maschi premutati possono avere atassia (l’atassia cerebellare è un disturbo neurovegetativo responsabile della progressiva scoordinazione motoria di braccia e gambe) e tremori ad esordio tardivo (>50) mentre circa 1/5 delle donne manifestano la POF (Premature Ovarian Failure) con amenorrea precoce. La malattia si manifesta per accumulo di un mRNA anomalo con effetti tossici La mutazione ( espansione) completa del trinucleotide causa invece la metilazione del gene con completa assenza dell’mRNA e di proteina. IDEOGRAMMA DEI CROMOSOMI UMANI In base alle dimensioni, i cromosomi umani sono stati numerati da 1 a 22. Esiste, inoltre, una coppia di cromosomi, X e Y, che determina il sesso. Il bandeggio in figura è caratteristico per ciascuna specie. Il citogenetista classico, facendo il cariotipo bloccando le cellule umane in metafase cioè quando i cromosomi sono più addensati, dovrebbe ottenere in condizioni normali il tipo di bandeggio mostrato in figura a pag 113. Qualunque differenza o anomalia rispetto a questo pattern vuol dire ce c’è qualcosa da valutare a livello cromosomico. Le bande che si possono osservare nel cariotipo classico hanno dimensioni diverse che però raramente sono inferiori a 5 milioni di bp per cui, le anomalie che si possono evidenziare mediante il cariotipo non possono essere piccole delezioni ma devono essere macro riarrangiamenti dell’ordine di milioni di basi. Quindi la risoluzione del cariotipo classico si aggira intorno ai 5milioni di basi, quindi è possibile valutare solo macroriarrangiamenti. A noi interessa studiare le anomalie cromosomiche. Queste possono essere classificate secondo varie modalità, quella che a noi interessa nello specifico è la classificazione che le distingue in mutazioni o variazioni numeriche e mutazioni strutturali. Queste mutazioni o variazioni, rappresentano la patologia genetica più frequente al concepimento, per di più rappresenta la prima causa che porta ad aborto spontaneo nei primi trimestri di gravidanza, infatti le anomalie cromosomiche coinvolgono un numero di geni elevatissimo, quindi è molto difficile che non abbiano nessuna conseguenza. Le mutazioni numeriche sono per la maggior parte dei casi legate all’età materna per un motivo legato alla gametogenesi femminile. Le anomalie più frequenti originano da un meccanismo particolare che è quello della non disgiunzione meiotica il quale può avvenire sia nei maschi che nelle femmine ma, come sappiamo, avviene più frequentemente nelle donne. Gli errori che possiamo avere avvengono o in meiosi 1 o in meiosi 2. Nella figura sotto è rappresentato sulla sinistra un errore in meiosi uno. In questa fase l’errore consiste nella non disgiunzione dei cromosomi omologhi: conseguentemente dopo la meiosi 1 avremo una cellula che contiene due omologhi e una che non ne contiene nemmeno 1 dei due (ovviamente solo per quello che concerne il cromosoma in esame). In meiosi due, in condizioni normali, dovrebbe avvenire la separazione dei cromatidi fratelli. Se ciò non si verifica si formeranno due gameti di cui uno non conterrà nessuno dei due cromatidi fratelli e l’altro li conterrà entrambi.
le cellule diventano come congelate fino all’inizio della pubertà, quando la formazione dei gameti continuerà proprio a partire dalla profase 1. Quindi la vecchiaia delle cellula non fa bene. Nell’uomo questo processo avviene in modo diverso. Nell’uomo infatti la spermatogenesi inizia nella fase della pubertà (non a livello fetale come nella donna) e non avviene in modo ciclico ma in modo continuo per cui il numero di mitosi è molto elevato.-->Nell’uomo con l’età ci sono molte meno non disgiunzioni ma aumentano le mutazioni puntiformi. DISOMIA UNIPARENTALE Si ha quando un individuo eredita le due copie di un cromosoma dallo stesso genitore. Si ha quindi un assetto normale di 46 cromosomi però una coppia di cromosomi che dovrebbero essere omologhi derivano dallo stesso genitore. Questa condizione ha un risvolto clinico quando coinvolge geni soggetti a imprinting, perché, provenendo dallo stesso genitore, non seguono il pattern normale di silenziamento. Inoltre la disomia uniparentale aumenta il rischio di malattie recessive perché se il genitore era portatore di una malattia che non si esprimeva perché recessiva e presente in eterozigosi , con questo meccanismo tale malattia si esprime in quanto i geni mutati si trovano in condizione di omozigosi. Isodisomia-> eredità di due copie dello stesso omologo dallo stesso genitore Eterodisomia-> eredità di una copia da ciascun omologo dallo stesso genitore (Nell’eterodisomia questo non succede, semplicemente la situazione del figlio rifletterà la situazione del genitore per quella coppia di cromosomi). Trysomic rescue: salvataggio dalla trisomia. È il meccanismo principale che sta alla base della disomia uniparentale. Immaginiamo uno zigote che si è originato dall’unione di due gameti di cui uno, durante la gametogenesi, è andato incontro ad un processo di non disgiunzione. Quindi questo zigote avrà 47 cromosomi. Questo zigote poi va incontro a mitosi: portarsi dietro un cromosoma in più per la cellula non è una cosa semplice, è molto probabile che accada che durante le varie mitosi avvenga una non corretta segregazione del cromosoma in più che quindi viene perso. Ciò succede molto spesso in tutti noi durante le nostre mitosi giornaliere: da una situazione di normalità passiamo ad una cellula anomala. Questa cellula anomala, rispetto alle altre, avrà una mitosi molto più lenta, sia perché non sta molto bene, sia perché deve duplicare una quantità di DNA superiore rispetto alle altre. Se durante le mitosi avviene la fortuna che in una cellula il cromosoma in più viene perso, questa cellula che l’ha perso avrà un vantaggio selettivo rispetto alle altre che non l’hanno perso e l’individuo vira verso la normalità. Riflettiamo però sulla situazione in cui ci sono 47 cromosomi. In questo caso due dei tre cromosomi in trisomia provengono dallo stesso genitore e uno dall’altro. Per questi 3 cromosomi la probabilità di essere perso attraverso il meccanismo di trysomic rescue è identica per ognuno dei 3 cromosomi. Quindi in un terzo dei casi si otterrà disomia uniparentale, in due terzi dei casi ristabiliamo la situazione di completa normalità. L’eterodisomia diventa un vero e proprio problema quando coinvolge cromosomi soggetti a imprinting. Il problema dell’isodisomia concerne il rischio possibile per le malattie recessive e in più il problema per geni soggetti a imprinting. Un’isodisomia potenzialmente è più grave di un eterodisomia perché ha un doppio rischio. Esiste anche la monosomic rescue. Prendiamo ora il caso del gamete monosomico o nullisomico. Immaginiamo ad esempio una monosomia del 21 (non vitale ovviamente). La cellula avrà 44 cromosomi e un solo cromosoma 21. Questa cellula va in mitosi e l’unico cromosoma 21 viene duplicato per dare origine a due cromatidi fratelli. Si può ristabilire la condizione disomica se questi due cromatidi segregano nella stessa cellula. Si può salvare lo stato di monosomi a diventando in maniera fatale una isodisomia.
Quindi, mentre la trisomic rescue può dare eterodisomia o isodisomia, a seconda che l’errore sia rispettivamente in meiosi 1 o in meiosi 2, la monosomic rescue può dare origine solo a isodisomia. L’iso e l’etero-disomia possono avere conseguenze cliniche. L’eterodisomia può dare origine a problemi nel momento in cui coinvolge geni soggetti a imprinting. (quando i due cromosomi provengono dallo stesso genitore il problema sta nel fatto che mantengono lo stesso pattern di metilazione). Anche l’isodisomia può dare origine a problemi se coinvolge geni soggetti a imprinting e, in più, rappresenta un rischio in più per le malattie recessive. quindi l’isodisomia è potenzialmente più grave di un’isodisomia in quanto espone l’individuo ad un rischio in più. Ora riportiamo tutto quello detto finora sull’imprinting alla malattia di Prader Willi. Se siamo nel caso dell’eterodisomia per il cromosoma 15 e se questa si è originata nel corso della meiosi femminile da una non disgiunzione ci aspettiamo che in entrambi i cromosomi sarà attivo il gene per l’ubiquitina ma non gli altri 4 geni coinvolti nella PW. CNV Le CNV sono delle regioni del nostro genoma in cui è presente un discostamento dal normale assetto diploide: abbiamo dei pezzi in più e dei pezzi in meno. Un esempio è rappresentato dai geni dell’α-globina, dovuta alla presenza di 2 geni dell’α-globina cioè α1 e α2, uno dietro l’altro. In passato si pensava che queste CNV fossero ristrette a pochissime regioni del DNA, invece, ad oggi grazie alle nuove tecniche, sappiamo che esse sono abbastanza diffuse in quanto ci sono dei meccanismi che ne facilitano l’insorgenza. Una delle cause principali che determina la formazione di CNV è rappresentato da delle strutture chiamate Dupliconi o blocchi ripetuti a basso numero di copie o LCR (low copy repets). Questi sono dei blocchi di sequenze che hanno da qualche parte una sequenza che gli somiglia, potrebbero essere blocchi di sequenza che non ci dicono niente o potrebbero essere dei geni. Un esempio è rappresentato dai geni α1 e α2 della globina che sono molto simili tra loro. I dupliconi hanno una lunghezza variabile che comunque di solito è superiore alle 1000 bp. Sono molto recenti, per recenti si intende che hanno più del 90% di identità tra di loro: perché facciamo questa analogia tra quanto sono recenti e la % di sequenza in comune? I dupliconi si originano a partire da un pezzo che è andato altrove. Quando un pezzo si duplica e poi si sposta lungo il cromosoma, esso e il pezzo che è rimasto, accumulano ognuno le sue proprie varianti caratteristiche, se lo spostamento è avvenuto di recente, da un punto di vista evoluzionistico, si sono accumulate poche variazioni e quindi i due pezzi sono più simili tra loro, se invece dopo lo spostamento è passato molto tempo e si sono accumulate molte mitosi, aumentano le probabilità che si verifichino variazioni di sequenza e che quindi i due dupliconi diventino più diversi tra loro. I dupliconi tutti insieme rappresentano il 5% del genoma umano e sono sparsi su tutti i cromosomi, non c’è un cromosoma in particolare che ne ha di più. Perché ci interessano tanto i dupliconi? Perché il crossing over è guidato dall’omologia di sequenza, si appaiano le sequenze che sono altamente omologhe. Se chiamo X un duplicone e Y suo fratello, vuol dire X e Y sono praticamente identici. Il crossing over dovrebbe avvenire tra i due omologhi X e X, e così avviene nella maggior parte dei casi. Però a causa degli alti livelli di omologia di sequenza, è possibile che si verifichi anche la ricombinazione aberrante mostrata in figura, cioè quella fra i dupliconi X e Y. Il problema è che X e Y non sono realmente omologhi e questa ricombinazione aberrante porterà alla formazione di un gamete con una duplicazione e di un altro gamete dove sarà presente una delezione. Quindi se è presente una duplicazione dovrà essere presente anche una delezione. Ora, se questa mutazione da una malattia o un polimorfismo dipende dalla localizzazione della mutazione.
paziente e che replico introducendo dNTPs marcati con molecole fluorescenti. Queste probes andranno a riconoscere il tratto complementare sul cromosoma condensato in metafase, che abbiamo sul nostro microscopio. Ovviamente, affinché ci sia il riconoscimento, dobbiamo prima denaturare il cromosoma, ma senza risospenderlo altrimenti va via. Quindi il DNA deve essere ben fissato al vetrino e poi con un po’ di soda caustica viene denaturato. DNA microarray Immaginiamo di avere un vetrino sul quale sono spottate in una data posizione delle sonde messe in ordine, come in una specie di dama. Queste sonde rappresentano delle regioni del nostro genoma: per esempio una prima sonda rappresenta il cromosoma 1 dal nucletotide 20 al nt 80. Queste sonde sono così spottate nelle varie posizioni del vetrino. Le sonde sono sequenze di DNA a singolo filamento complementari alle varie regioni del nostro DNA in modo da potersi poi ibridare al nostro DNA target. Se ripetiamo questo spottaggio per centinaia di migliaia di punti sul vetrino e lo facciamo per tutti i cromosomi, avremo tutta una serie di oligo che in maniera spaziata rappresentano tutti i cromosomi del nostro genoma comune. Ovviamente dobbiamo posizionare le sonde annotando a quale regione e a quale cromosoma corrisponde ogni spot, cioè a quale parte del cromosoma corrisponde uno spot di sonde presenti una certa posizione. All’interno di ogni spot corrispondente ad una certa regione di DNA ci sarà un elevato numero di sonde tutte uguali tra loro. Quindi prendiamo il DNA di un bambino del quale sospetto una malattia su base genetica e provo a ibridarlo sul vetrino. Facciamo questa ibridazione parallelamente a quella di un individuo di controllo che non dovrebbe avere la mutazione marcando il DNA dei due individui con 2 fluorocromi di colori diverso. I due campioni di DNA dovranno essere prima frammentati e denaturati e poi fatti ibridare sul nostro vetrino. Marco per esempio il DNA di controllo con un fluorocromo rosso e quello del bambino con uno verde. Quindi lasciamo ibridare entrambi i DNA. Poiché in ogni singolo spot ci saranno migliaia di sonde otterrò da ognuno di essi sia un segnale verde che uno rosso che in un certo senso si “mischiano “ tra loro dando un segnale di un altro colore, per esempio giallo. Se per esempio però si ibrida solo il DNA di controllo e quello del bambino no, otterrò uno spot che darà un segnale di colore rosso. Quindi sospetto una mutazione, per esempio una delezione nel bambino, in particolare se è tutto rosso una delezione in omozigosi. Viceversa se è tutto verde la delezione potrebbe essere presente nel controllo.( Se invece la mutazione è un polimorfismo avremo comunque ibridazione del DNA in quanto le sonde hanno una lunghezza di 60 nt che permettono al legame fra sonda e DNA target di resistere al lavaggio nonostante il mismatch dato dal polimorfismo). Uno scanner legge punto per punto su ogni spot dell’array. Se la delezione è in omozigosi ci aspettiamo l’estremo in cui lo spot ha un colore rosso, se è in eterozigosi avremo una sfumatura del giallo che verrà letta dallo scanner e interpretata dal computer il quale legge la lunghezza d’onda che gli arriva e quindi in questo caso il tipo di giallo sarà dato da una maggiore percentuale di rosso e una minore di verde, perché l’omologo del DNA target con la delezione non si è ibridato. Ma è sicuro che possiamo interpretare un valore di mezzo (cioè un colore giallo dato da 50% verde e 50% rosso) come una situazione in cui i due genomi (controllo e target) sono integri nel 100% dei casi? No. Questa situazione si può verificare anche quando abbiamo in entrambi i DNA provenienti da target e controllo una delezione. Ciò è dovuto al fatto che quella che otteniamo non è una lettura del valore assoluto della quantità di DNA, ma una lettura relativa al campione di riferimento. Quindi quello che otteniamo non è una conta esatta ma un valore che è dato dal rapporto tra il DNA target e quello di riferimento. Quindi non è un valore assoluto ma uno relativo: valutando direttamente il rapporto perdiamo una parte di informazione. Per esempio un bilanciamento tra i colori rosso e verde può essere ottenuto o perché entrambi gli individui hanno un assetto normale o perché per esempio entrambi hanno una triplicazione di un dato frammento di DNA.
Oppure Per esempio se il bambino ha una duplicazione in eterozigosi ci aspettiamo un rapporto tra il suo DNA e il target di 3 a 2, cioè 1.5, ma 1,5 possiamo ottenerlo come rapporto tra numeri diversi, per esempio anche fra 7 e 3,5. Se il bambino ha una delezione in eterozigosi e il DNA di riferimento ha un assetto normale tale rapporto sarà uguale a 1: 2 cioè 0.5. questi valori vengono convertiti in valori di log in base 2 per comodità. Se il bambino ha una duplicazione il rapporto che ci aspettiamo è 3:2, cioè 1.5. In figura-> il computer ricostruisce l’ideogramma del cromosoma 17. Ogni punto ha come valore il log2 del rapporto dei valori dei segnali fra controllo e paziente. Ci aspettiamo che per punti in cui è rispettata la diploidia sia nel target che nel controllo abbiamo un valore vicino a 0 (dato sempre dal log in base 2 del rapporto tra i due valori). Nell’ideogramma però vi sono tutta una serie di punti verdi che si discostano dal background normale. Questa situazione è la rappresentazione della sindrome da delezione del braccio lungo del cromosoma 17 nella regione 2 1. è una delezione di 0.9 milioni di basi : a destra l’immagine è uno zoom di questa regione nell’ideogramma a sx. Continua nella prossima lezione..
