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NUCLEO E GENOMA
L’insieme delle sequenze del DNA di un organismo è detto genoma. Nei procarioti esso è costituito quasi esclusivamente da sequenze funzionali, cioè che codificano per proteine, e da geni regolatori. Negli eucarioti sono presenti si sequenze non funzionali sia di cui non si conosce ancora la funzione e spesso vanno a formare la maggior parte del genoma cellulare.
Un’altra differenza è che nei procarioti il genoma non è separato dal citoplasma, mentre negli eucarioti esso è confinato all’interno di un compartimento separato dal citoplasma da un sistema membranoso, detto involucro nucleare, che costituisce il nucleo. Inoltre, il DNA della cellula eucariotica è associato a proteine a costituire una complessa struttura definita cromatina.
Il nucleo è una struttura dinamica, la cui morfologia tende a variare durante il ciclo cellulare, specie durante la fase di divisione cellulare. Osservando il nucleo in sezione è possibile notare: un sistema di membrane che delimita il nucleo, detto involucro nucleare, costituito da due membrane, una interna e una esterna, separate da uno spazio perinucleare; uno o più organelli sferici che si colorano mediante coloranti acidi, detti nucleoli; un materiale colorabile mediante coloranti basici detta cromatina, che si presenta in forma di ammassi densi detti cromosomi, visibili durante la divisione cellulare; una rete di filamenti intermedi che vanno a costituire la matrice nucleare o nucleoscheletro. La maggior parte delle cellule ha un solo nucleo. Tuttavia, negli organismi pluricellulari vi sono dei tessuti con elementi plurinucleati che possono essere di due tipi:
Sincizi, che derivano dalla fusione di più cellule che mettono in comuni i nuclei in un unico citoplasma Plasmodi, che derivano da un’unica cellula il cui nucleo si è diviso più volte, senza contemporanea suddivisione del citoplasma
Involucro nucleare
L’involucro nucleare è formato da una membrana interna a contatto con il materiale nucleare e una membrana esterna a contatto con il citoplasma. A intervalli regolari la membrana interna ed esterna si fondono in strutture circolari dette pori nucleari, a livello dei quali si trova il complesso proteico del poro.
Membrana interna ed esterna
Entrambe le membrane nucleari hanno uno spessore di 6nm e sono separate da uno spazio perinucleare dallo spessore di 40-50nm, che è in continuità con il lume del RER. La membrana esterna è in continuità con il RER e sulla sua faccia sono associati dei ribosomi, alla rete citoplasmatica dei filamenti di actina e il centrosoma. La membrana interna interagisce con la lamina fibrosa e con la cromatina. Tali interazioni dipendono dalla presenza di proteine integrali della membrana interna ed esterna, di cui ne sono state identificate 63.
Proteine integrali della membrana esterna = ANC1 si lega al citoscheletro o ZIG12 che lega il centrosoma alla faccia citoplasmatica dell’involucro nucleare
Proteine integrali della membrana interna = recettore per la lamina B, una componente del nucleoscheletro. Il recettore della lamina B permette alla faccia interna dell’involucro nucleare di interagire con il nucleoscheletro e quest’ultimo con la cromatina.
Le proteine integrali della membrana interna e di quella esterna interagiscono tra di loro mediante lo spazio perinucleare; nei mammiferi sono state individuate alcune proteine della membrana interna, detta SUN che si lega alla proteina della membrana esterna detta nesprina 2.
Esisterebbero una serie di interazioni che attraverso i legami delle proteine della membrana interna con la lamina fibrosa e con le proteine della membrana esterna con la componente actinica del citoscheletro, unirebbe il nucleoscheletro al citoscheletro e servirebbe a posizionare i nucleo. Questa rete è definita LINC (complesso che lega il nucleoscheletro e citoscheletro). I varie cellule il nucleo forma delle invaginazioni, le quali aumentano l’area di contatto della membrana interna con il materiale nucleare. A queste invaginazioni si dà il nome di reticolo nucleoplasmatico, a livello del quali si registrerebbero dei flussi di ioni calcio.
Pori nucleari e complesso del poro
L’intelaiatura centrale sarebbe perforata da otto canali di 10nm di diametro che è stato suggerito che rappresentino il canale per la diffusione passiva di ioni e piccole molecole. Dalla faccia esterna dell’intelaiatura centrale si dipartono otto distinte strutture a maniglia che sporgono nel lume dello spazio perinucleare e ancorerebbero il poro all’involucro. Il complesso del poro è formato da almeno 8-16 copie di almeno 100 diversi tipi di nucleoporine.
Nella maggior parte degli eucarioti l’involucro nucleare si disgrega all’inizio della divisione per poi riformarsi una volta che la divisione cellulare è terminata. In alcuni organismi che hanno una mitosi detta chiusa, l’involucro nucleare non si disgrega, ma anche in questo caso subisce profonde modificazioni.
Nella mitosi aperta, inizialmente il complesso del poro si modifica in modo tale da rimanere solo l’intelaiatura centrale; ciò consente l’entrata nel nucleo della tubulina e del complesso cdc2/ciclina M o B. successivamente si ha la fosforilazione delle lamine a causa dell’attivazione del fattore per la promozione della mitosi (MPF) e questo provoca la disgregazione dell’involucro. I frammenti dell’involucro si mescolano al RER mentre le nucleoporine si disperdono nel citoplasma mentre alcune sono disperse in vescicole che si fondono con il RER mentre altre ancora si associano al cinetocore. Anche le lamine si disperdono nel citoplasma tranne la lamina B che si associa al RER.
In seguito all’inattivazione di MPF le lamine vengono defosforilate e questo consente la formazione dell’involucro. Le vescicole derivate dalla disgregazione dell’involucro unite alle lamine si associano alla superficie dei cromosomi formando dei piccoli nuclei detti cariomeri ai quali si aggiungono le proteine del
L’involucro nucleare è percorso da numerosi pori, il cui numero dipende dallo stato di attività sintetica della cellula. In genere il loro numero, in una cellula umana, è di circa 4mila. A livello del poro nucleare si trova una complessa struttura proteica, detto complesso del poro.
Il complesso del poro ha un diametro di 120nm e presenta una profondità perpendicolare di circa 180nm. Esso è costituito da un’intelaiatura centrale composta da otto raggi, posti tra un anello citoplasmatico e uno nucleare. Dall’anello citoplasmatico si dipartono otto filamenti lunghi 50nm, mentre dall’anello nucleare si diparte una struttura a forma di canestro (canestro nucleare) costituita da altri otto filamenti che convergono in un anello terminale. Dall’anello terminale si dipartono otto ulteriori filamenti che si spingono per circa 350nm nl nucleo.
Funzione del nucleoscheletro
Il nucleoscheletro svolge un ruolo fondamentale nel mantenere l’integrità dell’organizzazione nucleare, fornendo da supporto alla cromatina, ma esso avrebbe anche un ruolo importante su varie funzioni nucleari come la duplicazione, trascrizione, apoptosi e il controllo del ciclo cellulare.
Al riguardo si è visto che i siti di replicazione del DNA si associano alle lamine, che avrebbero un ruolo importante nell’assemblaggio dell’impalcatura su cui avviene il processo di elongazione durante la replicazione del DNA; le lamine si legano anche ad alcuni fattori di trascrizione e potrebbero essere coinvolti in complessi di regolazione genica. Anche le actine nucleari sembrano giocare un ruolo nella trascrizione, maturazione e nel trasporto degli RNA. Infatti, l’actina monomerica è stata trovata in associazione con i complessi ribonucleoproteici che contengono l’RNA precursore dell’mRNA, e la profilina e l’actina sarebbero componenti degli spliceosomi, complessi che determinano lo splicing dell’RNA eterogeneo e la formazione degli mRNA definitivi.
GENOMA E GENI
Il genoma è l’insieme dei geni di un organismo, dove con gene si intende una sequenza di DNA che codifica per una molecole di RNA, il quale può essere un RNA messaggero che codifica per una proteine, o un RNA che non codifica per nessuna proteina come gli rRNA e i tRNA. La sequenza di DNA che codifica per un mRNA è detta gene strutturale, mentre viene detta cistrone un’unità trascrizionale che codifica per una sola proteina o per un singolo rRNA o tRNA. Nei procarioti è possibile trovare complessi genici che codificano per un insieme di proteine funzionalmente correlate tra di loro. In questo caso l’RNA trascritto è definito policistronico. Vi sono poi geni che non codificano per alcuna proteine, ma svolgono un ruolo di controllo della trascrizione e sono pertanto definiti geni regolatori.
Genoma e geni nei procarioti
Il genoma dei procarioti è molto più piccolo rispetto a quello degli eucarioti. Esso è costituito principalmente da sequenze codificanti, mentre sono rare le sequenza altamente ripetute.
Il nucleoide procariotico è attaccato ad una introflessione della membrana plasmatica, detta mesosoma ed assume una forma aggrovigliata mediante un processo di avvolgimento su se stesso, detto super avvolgimento a causa dell’enzima topoisomerasi I (girasi) e altre proteine che si associano al genoma procariotico favorendone la compattazione. Talvolta, il genoma procariotico, può spiralizzarsi e formare delle anse radiali attorno ad uno stroma centrale di RNA e proteine.
Nei procarioti i geni che controllano un’unica funzione metabolica, costituiscono un’unica unità trascrizionale detta operone, controllata da un unico promotore, il quale costituisce il sito di legame al DNA per l’RNA polimerasi. A monte del promotore si trova una sequenza operativa detta sito CAP e a valle un altro gene regolatore detto operatore. Tale unità viene trascritta in un unico RNA messaggero. Spesso il processo di trascrizione e contemporaneo a quello della traduzione.
Le sequenze di DNA nei procarioti sono quasi sempre uniche, fatta eccezione per per rRNA e tRNA che sono presenti in copie multiple. A questa categoria fanno parte anche alcune sequenze non funzionali che si riscontrano solo in alcuni batteri e archea e che sono lunghe da 24-48 coppie di basi dette CRISPR.
Oltre al nucleoide, possono essere presenti anche dei frammenti di DNA più piccoli detti plasmidi, che sono capaci di replicarsi in maniera autonoma e di essere trasmesse alle cellule figlie durante la divisione
cellulare. Una componente apparentemente non funzionale del genoma procariotico è rappresentata da elementi mobili detti trasposoni, capaci di passare da una regione ad un’altra del nucleoide, ma anche dal nucleoide al plasmide e viceversa. Questi elementi contengono dei geni che codificano per enzimi traspoasi, che consente la loro trasposizione, ma spesso possono contenere dei geni aggiuntivi, come quelli che conferiscono la resistenza per gli antibiotici. Sono tre le classi di trasposoni individuate: IS (insertion sequence) Tn (trasposition) e gli elementi composti, che sono una combinazione di IS e Tn.
Genoma e geni negli eucarioti
Il genoma degli eucarioti è molto più grande rispetto al genoma dei procarioti ed è anche più complesso in termini di struttura e composizione. Esso non è costituito da anelli circolari, ma da lunghe catene lineari di DNA che, in associazione ad alcune proteine, vanno a costituire i cromosomi, il cui numero è caratteristico e costante per ogni specie; nelle cellule somatiche ci sono due copie per uno stesso cromosoma, detti cromosomi omologhi, uguali per dimensione, forma e composizione genica. Questo corredo cromosomico viene anche definito diploide e viene indicato con la sigla 2n. Nelle cellule germinali è presente solo uno dei due cromosomi omologhi per ogni coppia; il corredo cromosomico viene definito aploide e viene indicato con la sigla n.
Durante il ciclo cellulare di una cellula somatica, sebbene il numero diploide resta costante, la quantità di DNA per nucleo varia, ossia varia la dimensione genomica. Dopo la divisione cellulare il valore della dimensione genomica è pari a 2C e ciascun cromosoma è costituito da un unico filamento di DNA. Dopo la fase S, fase in cui avviene la replicazione del genoma, tutto il DNA della cellula viene duplicato, in modo tale che ciascun cromosoma è costituito da due filamenti di DNA, per cui la cellula contiene una quantità doppia di DNA, dimensione genomica 4C. con la divisione cellulare i due filamenti di DNA formanti un cromosoma si dividono nelle due cellule figlie, ristabilendo la dimensione genomica pari a 2C.
Geni strutturali
A differenza dei procarioti, i geni strutturali degli eucarioti non sono organizzati in operoni, ma sono elementi singoli separati, che si possono trovare sullo stesso cromosoma o su cromosomi differenti. I geni strutturali sono discontinui, formati cioè da sequenze complementari a quelle dell’mRNA, dette esoni, intervallate da regioni che, invece non si trovano a livello dell’mRNA, dette sequenze introniche.
All’estremità 5’ si trova una sequenze definita promotore, che contiene i siti di riconoscimento per l’enzima RNA polimerasi; segue il primo esone, il cui trinucleotide iniziale si chiama sito di inizio. Al primo esone segue il primo introne e quindi una serie alternata di introni ed esoni. L’estremità finale del gene, detta estremità 3’, corrisponde all’ultimo esone che contiene il sito di termine il quale segnala la fine della trascrizione. A monte dell’estremità 5’ e a valle dell’estremità 3’ vi sono delle sequenze non trascritte, ma possono avere funzione regolatrice, e sono dette sequenze fiancheggianti 5’ e 3’.
Poiché i geni eucariotici sono discontinui il trascritto primario è più lungo rispetto all’mRNA e deve essere sottoposto ad una fase di rielaborazione chiamata processamento.
La maggior parte dei geni strutturali dà origine ad un solo messaggero e perciò sono definiti singoli; in alcuni casi, da alcuni geni possono derivare degli mRNA costituiti da combinazioni differenti di esoni attraverso un processo di splicing alternativo.
La maggior parte dei geni è presente in una copia singola in un corredo cromosomico aploide; vi sono però dei geni che sono presenti in più copie e che vanno a costituire le famiglie geniche. Le più comuni sono
I retrotrasposoni eucariotici sono distinti in virali e non virali:
VIRALI contengono delle lunghe sequenze (250-600 bp) dette LTR che codificano per la trascrittasi inversa e l’integrasi. NON VIRALI sono gli elementi mobili più abbondanti nei mammiferi e non posseggono LTR. Tra questi si distinguono gli elementi dispersi lunghi LINE (alcune migliaia di basi coppie di basi) e gli elementi dispersi corti SINE (circa 300 coppie di basi). Uno dei SINE più comuni nei mammiferi è la sequenza Alu, così chiamata perché contiene un sito di riconoscimento per un enzima chiamato Alu1 (un enzima di restrizione ad attività endonucleasica). Oltre agli elementi SINE e LINE, che rappresentano circa il 30% del genoma dell’uomo, vi sono anche gli pseudogeni maturati: si tratta di inserti di DNA derivati dalla trascrizione inversa di mRNA. Sono privi di introni e non possono essere trascritti.
DNA altamente ripetuto
È costituito da sequenze corte che si ripetono anche per un milione di volte. Ne esistono di vari tipi:
DNA satellite, così chiamato perché ha una composizione di basi diversa dal resto del genoma e di conseguenza si presenta come una banda separata quando sottoposta a centrifugazione in gradiente di densità, è costituito da milioni di copie quasi uguali disposte in tandem a costituire un cluster che si localizza in regioni specifiche del cromosoma, quali i centromero e i telomero. DNA microsatellite che consiste di unità lunghe 4 paia di basi. DNA minisatellite costituito da sequenze lunghe da 10-100 coppie di basi.
Recentemente si sono trovate delle evidenze che suggeriscono come certe sequenze, sino ad adesso considerate non funzionali, svolgano un ruolo importante nella regolazione genica. In alcuni mammiferi si è visto che alcuni pseudogeni controllano l’attività di geni corrispondenti, pur non trovandosi a livello dello stesso cromosoma e alcuno RNA, detti riboswitch, che funzionano come interruttori genetici, sono codificati da RNA intergenico.
Cromatina e cromosomi
Se si misura la quantità di DNA contenuta in una cellula umana, si nota che il nucleo contiene una quantità di DNA tale da ricoprire una lunghezza complessiva di 2.17m di lunghezza. È quindi evidente come il filamento di DNA e le proteine che costituiscono i cromosomi devono essere soggetti a diversi gradi di compattazione per poter essere contenuti in un nucleo il cui diametro misura 4-5μm.
Negli eucarioti il DNA interagisce con una serie di proteine a formare la cromatina. Queste proteine sono suddivise in proteine istoniche e proteine non istoniche.
PROTEINE ISTONICHE
Gli istoni sono delle proteine basiche che si associano al DNA per formare la struttura di base della cromatina. Essi sono formati da vari amminoacidi con due gruppi amminici, come l’istidina, arginina e lisina. Negli istoni, gli amminoacidi apolari costituiscono un dominio globulare, mentre gli amminoacidi basici formano una o due braccia che si estendono ai lati della regione globulare. Sia la regione globulare che le braccia regolano il legame tra gli istoni stessi e il DNA.
Gli istoni sono delle proteine che si sono conservate nel corso dell’evoluzione. Solo negli spermatozoi di alcuni animali (ma non nei mammiferi) gli istoni sono costituiti da molecole più piccole ricche di arginina, dette protamine.
Le varie classi di istoni si indicano con a sigla H (dall’inglese histone) e quelli più comuni sono distinti in: H2A, H2B, H3 e H4 che costituiscono il core nucleosomico e H1 che è un istone linker. L’istone H1 è il più grande ed è ricco di lisina. Gli istoni H2A e H2B sono moderatamente ricchi di lisina, mentre H3 e H4 sono ricchi in arginina.
Queste proteine possono subire delle modificazioni chimiche, come l’acetilazione, metilazione o fosforilazione in rapporto alle funzione del nucleo, come la regolazione della trascrizione, la duplicazione del DNA o la condensazione della cromatina. Vengono sintetizzati durante la fase S di duplicazione del genoma e vengono assemblati immediatamente a livello del DNA neosintetizzato.
PROTEINE NON ISTONICHE
Le proteine non istoniche costituiscono una famiglia di proteine eterogenee per composizione e funzione. Esse sono per lo più cariche negativamente o neutre e, a differenza degli istoni, possono essere sintetizzate in qualsiasi momento nel corso della vita di una cellula.
Tipi di proteine non istoniche
Proteine ad attività enzimatica, in grado di catalizzare le diverse funzioni del DNA quali trascrizione, duplicazione, ricombinazione e riparazione; Proteine coinvolte nella struttura della cromatina, che controllano in particolar modo la sua spiralizzazione e despiralizzazione, che si distinguono in proteine architettoniche della cromatina e i complessi di rimodellamento della cromatina; e prime sono coinvolte nella formazione delle strutture cromatiniche di ordine superiore a quella secondaria e alcune sono in grado di reprime la trascrizione di alcuni geni (come ad esempio HP1 che sarebbe in grado di legare l’eterocromatina alla membrana interna dell’involucro nucleare). I complessi di rimodellamento della cromatina riducono il livello di compattazione della cromatina, rendendo accessibile la trascrizione di alcuni geni. La loro funzione è ATP-dipendente e per questo possiedono una subunità ATPasica, in funzione della quale si distinguono vari gruppi: i complessi SWI/SNF coinvolti nella trascrizione; i complessi contenenti l’ATPasi ISWI, che controllano la spaziatura dei nucleosomi; i complessi contenenti l’ATPasi Mi2, coinvolti nel silenziamento genico e il complesso INO80, coinvolto nel riparo del DNA. Proteine che controllano il mantenimento strutturale dei cromosomi
