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Nucleo e genoma
Acidi nucleici
Esistono principalmente due tipi di acidi nucleici: DNA (acido desossiribonucleico) e RNA (acido ribonucleico). L'unità monomerica degli acidi nucleici è il nucleotide, una struttura che presente un gruppo fosfa- to, uno zucchero e una base azotata. L’informazione genetica è conservata nelle sequenze nucleotidiche delle molecole di DNA Le caratteristiche ereditarie sono associabili ai cromosomi costituiti da DNA e proteine.
Struttura e funzione del DNA
BASI A, C, G E T
➔ Base + zucchero: Nucleoside. ➔ Base + zucchero + fosfato: Nucleotide. Zucchero: desossiribosio. Basi: adenina, guanina, citosina, timina. NUCLEOTIDI La base azotata si lega al carbonio 1 dello zuc- chero, attraverso un legame β-N-Glicosidico. Questo legame porta alla formazione di un nucleo- side. Solo con l'esterificazione del carbonio 5 da parte di un gruppo fosfato si ottiene un nucleotide.
La struttura di un nucleotide
Base azotata
Esistono 5 tipi di base azotate che in base alla struttura vengono divise in due categorie: Puriniche e Pirimidiniche. Le prime presentano due anelli fusi tra di loro e sono l'Adenina e la Guanina. Mentre per quanto riguarda le pirimidiniche, presentano un solo anello e sono la Timina, la Citosina e l'Uracile. Inoltre le basi puriniche svolgono altre funzioni come:
- (^) l'ATP e il GTP(funzione energetica)
- (^) l'AMP ciclico (messaggiero).
Base, Nucleoside e Nucleotide
Struttura del nucleo L’ involucro nucleare è un sistema di due mem- brane separate da uno spazio perinucleare. La membrana esterna presenta ribosomi sulla faccia citoplasmatica ed è in continuità con il reticolo endoplasmatico rugoso. Un complesso sistema di proteine lega la membrana interna alla lamina filamentosa, le due membrane fra loro e la mem- brana esterna all’actina del citoscheletro. Si forma così un sistema che collega il nucleoscheletro con il citoscheletro. L’involucro nucleare è percorso da numerose aperture cilindriche, i pori nucleari , al cui livello le membrane si fondono e dove si trova una struttura proteica, detta complesso del poro , che è ancorata alle membrane dell’involucro. Il complesso del poro controlla gli scambi di materiale tra il nucleo e il citoplasma. L’involucro nucleare si sfrega all’inizio della divisione e si ri- forma alla fine. All’interno del nucleo si trovano: la matrice nucleare o nucleoscheletro, la cromatina e il nucleolo. Una fitta rete granulare insolubile costituisce una sorta di nucleoscheletro (matrice cellulare) che partecipa a mantenere la forma del nucleo. Questa offre un’impalcatura per l’organizzazione della cromatina e un ancoraggio per molecole coinvolte nella duplicazione e trascrizione. Il nucleoscheletro è una struttura reticolare costituita principalmente da proteine. Esso com- prende la lamina fibrosa, che è costituita da proteine dette lamine, dà supporto all’involucro nu- cleare e può far da tramite tra questo e la cromatina, e la rete fibrillare, che è costituita anch’essa da lamine e da actina e dà supporto alla cromatina. Il nucleoscheletro è importante per l’integrità del nucleo e influisce anche sulle funzioni nucleari.
Genoma e geni
Definizione di gene
Il DNA nei geni può essere: ❖ a sequenza unica : geni strutturali; ❖ mediamente ripetuto : geni per sequenze regolatrici o per rRNA e tRNA ❖ altamente ripetuto : non vengono trascritte in mRNA maturo; il loro ruolo non è ancora stato chiarito. Il genoma degli eucarioti è molto più grande di quello procariotico, ma è costituito da una larga parte di sequenze non funzionali. Esso è formato da lunghe catene nucleari di DNA unito a pro- teine, che costituiscono i cromosomi. I geni eucariotici sono spesso separati da sequenze che non trascrivono, dette spaziatori , e sono discontinui, cioè formati da sequenze complementari a quelle dell’RNA messaggero, dette esoni , e da sequenze che non si trovano nell’RNA messag- gero, dette introni. Oltre ai geni strutturali si trovano geni regolatori. Frequenti sono anche se- quenze non funzionali. Tra queste si trovano i DNA satelliti ed elementi mobili, quali trasposti e retroposoni. GENI REGOLATORI Sono siti di controllo della trascrizione, ovvero interagendo con particolari proteine possono incen- tivare o reprimere la trascrizione. Alcuni di questi si trovano subito prima l'inizio del gene, altri in- vece a distanze molto grandi come nel caso dei geni intensificatori e i geni silenziatori. In alcuni casi la molecola di RNA è il prodotto finale: le subunità ribosomiali (rRNA), gli RNA trans- fer (tRNA), i micro RNA (miRNA). I microRNA (miRNA) sono piccole molecole endogene di RNA non codificante a singolo filamento riscontrate nel trascritto ma di piante, animali e alcuni virus a DNA. Si tratta di polimeri codificati dal DNA nucleare eucariotico lunghi circa 20-22 nucleotidi e principalmente attivi nella regolazione del- l ’ e s p r e s s i o n e g e n i c a a l i v e l l o trascrizionale e post-trascrizionale. I miRNA vengono inglobati nel comp- lesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) e inducono il silenziamento genico tramite sovrapposizione con sequenze complementari presenti su m o l e c o l e d i R N A m e s s a g g e r o (mRNA) bersaglio. Tale legame com- p o r t a u n a r e p r e s s i o n e d e l l a traduzione o la degradazione della molecola bersaglio. Il genoma è l’insieme di tutte le sequenze di DNA di un organismo. Negli eucarioti il DNA è sempre legato a proteine ed è separato dal citoplasma da un sistema di membrane chiamato involucro nu- cleare. La maggior parte delle cellule eucariotiche ha un solo nucleo. Le informazioni genetiche sono necessarie per costruire e mantenere un organismo vivente e ven- gono trasmesse da una cellula alle cellule figlie. Contengono istruzioni per produrre le proteine. Le
la cosina. Le proteine che regolano la trascrizione. Nel nucleo si trovano vari RNA , alcuni dei quali sono precursori degli RNA citoplasmatici, altri coinvolti nella maturazione degli RNA e nella dupli- cazione del DNA. Il diametro della “perla” nucleosomica, è di circa 10 nm. L’istone H1 (non mostrato) è legato al DNA linker e facilita l’impacchettamento dei nucleosomi nelle fibre di 30 nm. La struttura a zig-zag è data dalla formazione di due catene parallele in cui i nucleosomi si sovrap- pongono tra di loro. Questo fenomeno non è dato dall'intervento di proteine, ma dalle caratteris- tiche del nucleosoma e dalla concentrazione salina. Infatti più abbassa la concentrazione più la struttura tende a tornare alla forma primaria. Modelli di organizzazione di filamento nucleosomico ( a ) e di fibra a struttura secondaria secondo il modello a zig zag ( b ) o a solenoide ( c ) Dalla struttura a collana di perle (diametro di circa 10 nm) si passa a:
- Fibra cromatinica di 30 nm per la cui formazione è indispensabile la presenza dell’istone H;
- Livello successivo di impacchettamento: domini ad ansa. Questa struttura è stabilizzata dal- l’ancoraggio periodico del DNA a proteine non istoniche della matrice nucleare;
- Eterocromatina: forma di cromatina più condensata;
- Eucromatina: forma di cromatina meno condensata.
Livelli di impacchettamento della cromatina
- Collana di perle : configurazione estesa dei nucleosomi, formata dall’associ- azione del DNA con 4 tipi di istoni;
- Fibra di cromatina di 30 nm : associ- azione molto condensata di più nucleo- somi. Il 5° istone, H1, può essere localiz- zato all’interno della fibra.
- Domini ad ansa delle fibre di 30 nm
- Eterocromatina : cromatina molto com- pattata che è visibile sottoforma di bloc- chi discreti anche nelle cellule in inter- fase.
- Un cromosoma replicato : due croma- tidi uniti di una cellula in divisione, con tutto il DNA del cromosoma sottoforma di eterocromatina altamente condensata.
L'eucromatina rappresenta la parte decondensata del DNA, quest'ultimo si trova in forma attiva, di conseguenza pronto a trascrivere. L’inattivazione casuale del cromosoma X avviene dopo che nell’embrione si sono formate nu- merose cellule. IL MODELLO AD ANSE RADIALI È l'unico modello capace di spie- gare il livello di compattazione che raggiungono i cromosomi in intercinesi. Utilizzando specifiche sostanze che permettono di al- lontanare gli introni dal DNA, possiamo notare la presenza di un'impalcatura proteica che fa assumere alla cromatina una struttura ad anse. L'ordine di queste strutture è di circa 300 nm. Intercinesi : fase di riposo tra due divisioni cellulari, durante la quale vengono rinnovati gli elementi costitutivi del citoplasma e, in particolare, vengono sintetizzati DNA, istoni e altre proteine nucleari. STRUTTURE TERZIARIE Le strutture terziarie sono dell'ordine di circa 100-130 nm. Formazione di queste strutture è resa possibile grazie all'intervento di un famiglia di proteine chiamate proteine architettoniche. Quest'ul- time possono agire al livello del DNA linker compattando più nucleosomi successivi o agendo diret- tamente sui nucleosomi stessi. Sull'organizzazione di queste strutture ancora si sa poco. L’unità di base della cromatina è il filamento nucleosomico costituito da ottameri degli istoni H2A, H2B, H3 e H4 attorno ai quali si avvolge un filamento di DNA di circa centocinquanta coppie di basi, che continua con un tratto rettilineo verso un ottamero successivo; questo tratto si chiama DNA linker. Il filamento nucleosomico si avvolge su se stesso in modo che i nucleosomi si dispon- gono in una configurazione a zig zag, a formare una fibra di 30 nm di spessore, che sarebbe stabi- lizzata dal’H1. La fibra di 30nm può avvolgersi in strutture di ordine superiore nella cui formazione sarebbero coinvolte varie proteine non istoniche. ANOMALIE NUMERICHE Aneuploidie, quando il cariotipo è costituito da un numero di cromosomi che non è un multiplo di n; come nel caso delle trisomie o monosomie. Può capitare che sia il numero dell'intero assetto cro- mosomico a cambiare, e quindi una triploidia (3n). Questo fenomeno è incompatibile con la vita. ANOMALIE STRUTTURALI Esistono 4 tipi di anomalie strutturali: Delezione è la perdita di un frammento di cromosoma; Inversione è la rotazione di 180° di un frammento di cromosoma; Duplicazione è la presenza di un frammento cromosomico in più dovuto a un crossing over sbagliato o allo scambio ineguale di materiale genetico tra cromatidi fratelli; Traslocazione, consiste nello spostamento di un frammento o di un intero cromosoma su un al- tro non omologo.
Cariotipo ottenuto con coloranti
Il cariotipo è l'insieme di tutti i cromosomi metafasici. Quello umano è costituito da 46 cromosomi: 22 paia autosomi e un paio eterocromosomi (sessuali). Al fine di ottenere un cariotipo bisogna es- eguire la ricostruzione del cariogramma, tenendo conto sia della lunghezza del cromosoma sia del- la posizione del centromero. In base a quest'ultima possiamo distinguere cromosomi: metacentrici, submetacentrici, telocentrici e acrocentrici. Ogni cellula somatica di un individuo contiene due cro- mosomi per tipo più due cromosomi sessuali, due X nella femmina, un X e un Y nel maschio. Col- orazione ottenuta all’inizio della mitosi : La linea rossa indica la posizione del centromero. Questo bandeggio si ottiene con la colorazione Giemsa (Blu di Metilene e Eosina), che produce bande scure nelle zone ricche di A-T. Posizione dei geni che codificano i grandi RNA ribosomici (Satelliti). STRUTTURA DEI CROMOSOMI METAFASICI Durante la divisione e, in particolare, durante la metafase, i cromosomi raggiungono la loro massi- ma compattazione assumendo la morfologia più adatta per consentire l’uniforme ripartizione del patrimonio genetico nelle due cellule figlie. I cromosomi metafisici sono costituiti da due strutture bastoncellari, i cromatidi , unite a livello di una costrizione o centromero. La diversa posizione del centromero determina differenti morfologie dei cromosomi. Il numero di cromosomi è costante e specifico per ciascuna specie. Nelle cellule somatiche il corredo cromosomico comprende coppie di cromosomi uguali per forma, dimensioni e corredo genetico, detti cromosomi omologhi. Questo corredo è detto diploide. Nelle cellule che hanno subito la meiosi, il corredo cromosomico è costituito da un solo elemento per coppia di omologhi ed è detto aploide. Negli organismi nei quali il sesso è determinato geneticamente, una o più cop- pie di omologhi differiscono nei due sessi. In un sesso, detto omogametico, i cromosomi sessuali sono uguali, nell’altro sesso, detto eterogametico, la coppia di cromosomi sessuali comprende un omologo uguale a quello del sesso omogametico e uno diverso. L’organizzazione molecolare e compositiva dei cromosomi metafisici non è ancora completamente chiarita. Lo studio mediamente le cosiddette tecniche di bandeggio o ibridando specifiche sonde di DNA sui cromosomi secondo un piano organizzativo preciso, caratteristico e costante per ogni cromosoma. Due sono i modelli proposti per spiegare l’ ultrastruttura dei cromosomi. Un primo modello prevede che i cromosomi siano costituiti da un’impalcatura centrale, o scaffold , fatta da proteine non istoniche, attorno alla quale si avvolge una fibra cromatica a 30nm disposta ad anse radiali. Un altro modello ipotizza invece che una fibra cromatica a 30nm subisca vari livelli di spiral- izzazioni fino alla formazione di un cromatidio del diametro di 500-750nm. Due zone specializzate dei cromosomi sono il centromero e i telomeri. Il centromero serve a tenere uniti i due cromatidi e a favorire l’attacco dei cromosomi al fuso mitotico. L’unione dei cromatidi dipende dalla presenza a livello del centromero di proteine dette coesine. Ai due lati del centromero si osservano due dis- chetti proteici, detti cinetocori , al cui livello si trovano proteine motore dei microtubuli che determi- nano l’attacco dei cromosomi ai microtubuli del fuso mitotico.
LCR – Locus Control Region
La regione di controllo del locus (LCR) è un elemento che agisce a lungo raggio e regola la trascrizione dei geni, inoltre è un modello specifico del tessuto. Tipicamente, LCR è costituito da diversi siti ipersensibili come DNase I (HS), in cui sono presenti i siti di legame per attivatori trascrizionali. Il legame degli attivatori con l'HS recluta complessi di modifica della cromatina all'LCR, aprendo la struttura della cromatina e modifi- cando gli istoni. La sua sequenza è conservata in molti vertebrati e la conservazione di siti specifici può sug- gerire l'importanza nella funzione.
I GENI SI POSSONO ATTIVARE E DISATTIVARE TRAMITE APPOSITI REPRESSORI
L’ESPRESSIONE GENICA SI PUÒ REGOLARE TRAMITE ATTIVATORI
- Una proteina attiva si lega alla sequenza regolatrice sul DNA, interagisce con la RNA polimerasi e contribuisce a far iniziare la trascrizione.
- In mancanza dell’attivatore, non si può avere l’inizio della trascrizione. La proteina attivatore spesso deve interagire con un metabolita o un’altra piccola molecola (triangolino rosso) (es. l’attivatore batterico CAP lega cAMP).
Negli eucarioti i regolatori della trascrizione controllano a dis-
tanza l’espressione genica
Le proteine attivatrici eucariotiche agiscono con diverse modalità:
- Favoriscono l’assemblaggio dei fattori generali di trascrizione e della RNA polimerasi al promo- tore;
- Modulano la struttura della cromatina. IL RIPIEGAMENTO AD ANSA DEL DNA CONSENTE IL CONTATTO FRA LA PROTEINA ATTI- VATORE LEGATA ALLA SEQUENZA INTENSIFICATORE E IL COMPLESSO DI TRASCRIZIONE LEGATO AL PROMOTORE
Controlli post-trascrizionali
Ribointerruttori: brevi sequenze di RNA che cambiano conformazione in seguito al legame con pic- cole molecole come i metaboliti. A : quando i livelli di guanina sono bassi, il ribointerruttore adotta una struttura che permette alla RNA polimerasi, di continuare a trascrivere i geni biosintetici delle purine, e vengono prodotti gli enzimi necessari per la sintesi della guanina B: la guanina si lega al ribointerruttore, induce un cambiamento di conformazione che obbliga la RNA polimerasi ad interrompere la trascrizione.
