Pobierz ĆWICZENIE VI i więcej Schematy w PDF z Mikrobiologia tylko na Docsity! ĆWICZENIE VI Temat: Mikroflora środowisk naturalnych 1. Określanie ogólnej liczby drobnoustrojów w powietrzu Powietrze jest środowiskiem niesprzyjającym rozwojowi drobnoustrojów co nie oznacza, że mikroorganizmy tam nie występują. Skład jakościowy i ilościowy mikroflory powietrza zależy od takich czynników, jak: • obecność i liczebność organizmów żywych, • stanu ich zdrowotności, • temperatury, • wilgotności, • naświetlenia, • ruchów powietrza, • stopnia uprzemysłowienia terenu itp. Drobnoustroje dostają się do powietrza z gleby, wody, powierzchni roślin, wydalin ludzi i zwierząt. W powietrzu spotyka się przedstawicieli wszystkich grup drobnoustrojów. Brak przyswajalnych składników pokarmowych w powietrzu ogranicza rozwój drobnoustrojów. Są przypadki, w których drobnoustroje mogą się odżywiać substancjami organicznymi rozpuszczonymi w kropelkach mgły zawieszonej w powietrzu i rozmnażać się. Niektóre komórki giną w wyniku wysuszenia lub działania promieni ultrafioletowych, inne są przenoszone z prądami powietrza. Liczba drobnoustrojów w powietrzu jest jednym z ważnych mierników zanieczyszczenia atmosfery w przestrzeni otwartej i w pomieszczeniach zamkniętych. Liczba drobnoustrojów w pomieszczeniach, szczególnie o dużym zagęszczeniu ludzi i sprzętów, jest wielokrotnie większa niż w powietrzu w miejscach odkrytych. W pomieszczeniach znajduje się szczególnie dużo drobnoustrojów chorobotwórczych wydzielanych ze śliną, przy kichaniu i kaszlu. Wyniku badań nad zawartością drobnoustrojów w powietrzu służba zdrowia uzyskuje ocenę stanu sanitarnego atmosfery. Zastosowana na ćwiczeniu metoda oznaczania liczby drobnoustrojów w określonej objętości powietrza ma charakter jedynie orientacyjny - nie jest metodą ilościową w ścisłym znaczeniu tego słowa. Jednak ze względu na prostotę wykonania bywa często stosowana w praktyce. W metodzie tej, zwanej sedymentacyjną Kocha, wykorzystuje się zjawisko opadania drobnoustrojów będących w powietrzu i osadzania się ich na przygotowanym podłożu hodowlanym. Żywe komórki drobnoustrojów, znajdują w podłożu warunki do życia, rozmnażają się i tworzą kolonie dostrzegalne przy użyciu niewielkich powiększeń, a nawet gołym okiem. Przy określaniu liczby drobnoustrojów w powietrzu zakłada się, że każda kolonia pochodzi od jednej komórki bakteryjnej, fragmentu strzępki czy zarodnika grzyba lub promieniowca. Oznaczenie liczby drobnoustrojów w określonej objętości powietrza opiera się na obserwacjach z których wynika, że liczba kolonii, które wyrosły na 100 cm2 podłoża po 5-minutowym kontakcie podłoża z powietrzem równa jest w przybliżeniu liczbie drobnoustrojów zawartych w 10 dm3 powietrza. Część praktyczna a). W celu określenia liczby drobnoustrojów w powietrzu uczestnicy ćwiczeń otrzymują płytki Petriego z jałowym agarem odżywczym. Płytkę otwieramy, dbając o uniknięcie kontaktu podłoża z ręką eksperymentatora, a także wystrzegając się zanieczyszczenia podłoża (nie pochylać się nad otwartą płytką, nie dmuchać na nią). Wieczko płytki odkładamy ostrożnie na bok dnem do góry. Po upływie 5 minut zamykamy płytkę, na wieczku piszemy datę doświadczenia oraz inicjały eksperymentatora. Zakażone płytki wstawiamy do cieplarki o temp. 28°C. Jako kontrolę wstawiamy do cieplarki płytki identycznie przygotowane, które nie były jednak otwierane. Płytki ustawiamy w cieplarce zawsze dnem do góry, aby zbierająca się woda kondensacyjna nie zalewała powierzchni pożywki. Płytki wyjmuje się z cieplarki po 72 godzinach i przechowujemy do następnego ćwiczenia w chłodziarce o temp. 4°C lub w temperaturze pokojowej. 2. Określanie ogólnej liczby drobnoustrojów w glebie Określanie liczby drobnoustrojów w glebie należy do zabiegów często podejmowanych przez badaczy zajmujących się mikrobiologią gleby. Znajomość liczby drobnoustrojów w glebie ułatwia, w powiązaniu ze znajomością innych danych, poznanie kierunku procesów zachodzących w glebie i aktualnego stanu gleby. Liczba drobnoustrojów glebowych i ich skład jakościowy (występujące gatunki lub grupy fizjologiczne) określają poziom tzw. aktywności biologicznej gleby, jednego z czynników kształtujących w dużym stopniu żyzność gleby. Praktyka mikrobiologiczna zna kilka metod oznaczania liczby drobnoustrojów w glebie. Wszystkie one dalekie są od doskonałości i umożliwiają uzyskanie wyników jedynie orientacyjnych. Na ćwiczeniach stosuje się tzw. metodę płytkową, często wykorzystywaną przez mikrobiologów glebowych. Jest to metoda pośrednia, oparta na liczeniu kolonii wyrosłych na podłożu hodowlanym, zaszczepionych znaną masą gleby. Metody bezpośrednie polegają na liczeniu drobnoustrojów bezpośrednio w próbkach gleby przy użyciu mikroskopu. Metodą płytkową uzyskujemy wskaźnik, określany często jako ogólna liczba drobnoustrojów. Określenie to nie jest jednak ścisłe. Metodą płytkową określamy nie ogólną liczbę drobnoustrojów występujących w danej glebie w ogóle, ale jedynie przybliżoną liczbę drobnoustrojów zdolnych do rozwoju i rozmnażania się na zastosowanej w doświadczeniu pożywce. Posiewając próbkę tej samej gleby na różne podłoża (np. zawierające różne źródła węgla, różne źródła azotu, zróżnicowane pod względem odczynu), otrzymamy przy zastosowaniu metody płytkowej różniące się nieraz znacznie wyniki, stwierdzimy przy tym również wyraźne różnice jakościowe w składzie mikroflory. Niemniej w praktyce mikrobiologicznej metoda płytkowa, wykonana starannie i w dostatecznej liczbie powtórzeń, oddaje duże usługi. Należy jednak zawsze pamiętać o podaniu w opisie, jakie zastosowano podłoże oraz w jakich warunkach i jak długo prowadzono hodowlę. W celu uzyskania wiarygodnych wyników konieczne jest określone postępowanie przy pobieraniu próbek gleby, a także przeprowadzenie kilku równoległych powtórzeń dla każdej próby. W celu otrzymania próbki reprezentacyjnej pobiera się z badanego terenu kilka równoległych próbek gleby laską Egnera, najczęściej z głębokości 2-20 cm. Pobraną glebę umieszcza się w woreczkach z folii lub słoikach z odpowiednim zamknięciem. Przewiezienie próbek do laboratorium i nastawienie doświadczenia powinno nastąpić w zasadzie w dniu pobrania próby. Jednocześnie z nastawieniem doświadczenia określa się suchą masę gleby. Znajomość zawartości wody jest konieczna do późniejszych przeliczeń. W laboratorium miesza się pobrane próbki i przesiewa przez sito o oczkach o średnicy 1 mm. Z przesianej gleby odważa się 2 próbki po 10 g każda i wsypuje do kolbek zawierających po 100 cm3 jałowej wody. Wszystkie opisane tu zabiegi, a także dalsze należy prowadzić w sposób maksymalnie zabezpieczający przed przypadkowym zakażeniem. Zawiesinę gleby w wodzie przygotowuje się na wytrząsarce. Z wstępnego rozcieńczenia (10-1), którego 1 cm3 zawiera 0,1 g gleby przygotowuje się dalsze. Z rozcieńczenia wstępnego pobiera się jałową pipetą 1 cm3 zawiesiny i wprowadza do probówki zawierającej 9 cm3 wyjałowionej wody, uzyskując kolejne rozcieńczanie (10-2). W ten sposób postępujemy dalej aż do osiągnięcia wymaganego rozcieńczenia. Przygotowując każde rozcieńczenie, należy używać nowej jałowej pipety. Przed pobraniem zawiesiny do dalszego jej rozcieńczenia starannie ją mieszamy.