ĆWICZENIE 3, Ćwiczenia z Mikrobiologia

Pobierz ĆWICZENIE 3 i więcej Ćwiczenia w PDF z Mikrobiologia tylko na Docsity! Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Genetyki Molekularnej Bakterii, Katedra Mikrobiologii Przedmiot: Mikrobiologia Ochrona Środowiska I| rok Ćwiczenie 3 Identyfikacja bakterii: metody hodowli bakterii i szeregi biochemiczne 1. Hodowla Escherichia coli na podłożu płynnym. Krzywa wzrostu bakterii E. coli MG1655. Doświadczenie ma na celu monitorowanie wzrostu dwóch szczepów bakterii metodą spektrofotometryczną oraz dokładne określenie ich liczby metodą seryjnych rozcieńczeń. Należy przygotować hodowlę szczepu E. coli MG1655, zaszczepiając 50 ml jałowego bulionu 2.5ml bakterii z hodowli nocnej. Hodowle inkubować w wytrząsarce wodnej w temp 37'C. Co pół godziny (oraz w czasie zero) kolejna para pobiera 2 ml hodowli w celu określenia stopnia wzrostu hodowli poprzez pomiar absorbancji w spektrofotometrze (A- 600nm). Bakterie z pomiarów 1, 2, 3, 4 i 5 posłużą również do określenia miana bakterii (ich liczby w 1 ml). 2. Obliczanie miana bakterii metodą seryjnych rozcieńczeń Do 5-ciu ponumerowanych jałowych probówek rozlać po 0.9 ml jałowego roztworu soli fizjologicznej (0.85% NaCl). Do pierwszej probówki dodać 0.1 ml hodowli bakteryjnej z odpowiedniego pomiaru Następnie przenieść 0.1 ml rozcieńczonej 10x zawiesiny bakteryjnej do następnej probówki i ponownie dokładnie wymieszać. Analogicznie wykonać pozostałe rozcieńczenia (do 10). Przy każdym kolejnym rozcieńczeniu miano bakterii zmniejsza się dziesięciokrotnie, Z trzech ostatnich rozcieńczeń pobrać po 0.1 ml zawiesiny bakteryjnej a następnie dokładnie rozprowadzić jałową głaszczką po powierzchni płytek z agarem wzbogaconym. Płytki inkubować 24 godziny w temperaturze 377C. Na następnych zajęciach należy policzyć kolonie, które wyrosły na płytkach. Zakładając, że pojedyncza kolonia powstaje z jednej komórki bakteryjnej można określić liczbę żywych komórek obecnych w 1 ml badanej hodowli (miano bakterii) posługując się następującym wzorem: n N= RxV gdzie: N - oznacza miano hodowli bakteryjnej (liczba bakterii w 1 ml) n - liczbę kolonii, które wyrosły na płytce przy danym rozcieńczeniu R —rozcieńczenie (10*) (x - krotność rozcieńczenia, 1,2,3,4,5 itd) V — objętość posianej próby w ml 3. Metody hodowania bakterii beztlenowych. Metody historyczne: a) Odtlenianie biologiczne metodą Fortnera - DEMONSTRACJA - jedna płytka na grupę. Płytkę z podłożem agarowym podzielić na dwie części przez narysowanie na spodzie szalki kreski. Na jednej części posiać bakterie, które są bezwzględnymi tlenowcami (Serratia marcescens) a na drugiej bakterie beztlenowe (Clostridium sp.). Następnie płytkę Petriego przykryć odwróconą przykrywką i zakleić szczelnie plasteliną. Ilnkubować przez 24 godziny w temperaturze 37'C. Jako pierwsze wyrastają bakterie tlenowe, które w miarę wzrostu zużywają dostępny tlen przygotowując tym samym warunki do rozwoju bakterii beztlenowych. Metody historyczne, obecnie nieużywane: b) Odtlenianie z użyciem świecy c) Hodowla w próżni z wykorzystaniem anaerostatu Metody wykorzystywane obecnie: d) Odtlenianie metodą chemiczną - DEMONSTRACJA - jedna płytka na grupę. Na płytkę z podłożem agarowym posiać bakterie beztlenowe (Clostridium sp.). Z, bibuły przygotować małą kopertę, którą następnie napełnić mieszaniną odtleniającą (0.5 g pyrogallolu, 0.25 g węglanu potasu, 1 g ziemi okrzemkowej) zwilżoną wodą destylowaną i przykleić do pokrywki płytki Petriego. Następnie płytkę Petriego przykryć odwróconą przykrywką i zakleić szczelnie plasteliną. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 379C. Mieszanina zredukowanych związków chemicznych pochłania tlen umożliwiając rozwój bakterii beztlenowych. e) Hodowla na podłożu płynnym z tioglikolanem sodu. Usunąć tlen z podłoża poprzez zagotowanie i szybkie oziębienie pożywki. Posiać bakterie beztlenowe (Clostridium sp.), powierzchnię pożywki przykryć cienką warstwą parafiny (w celu utrudnienia dostępu powietrza) i zamknąć gumowym korkiem. Probówki inkubować 24 godziny w temperaturze 37?C. Tioglikolan sodu jest związkiem zredukowanym, który utleniając się zużywa tlen obecny w podłożu umożliwiając rozwój bakterii beztlenowych. f) Hodowla w specjalnych torbach wytwarzających atmosferę sprzyjającą wzrostowi bakterii beztlenowych — DEMONSTRACJA — jedna płytka na grupę Posiać bakterie na podłoże krwawe lub LA. Umieść płytkę w szczelnej torbie. Otworzyć aluminiową torebkę zabezpieczającą. Wyjąć generator i natychmiast umieść go w torbie. Umieścić klamrę zaciskową na torbie, następnie szybko ją zamknąć. Inkubować tak przygotowaną hodowlę w odpowiedniej temperaturze. Drugą płytkę, kontrolną, inkubować w odpowiedniej temperaturze w warunkach tlenowych. 4. Identyfikacja bakterii (szereg biochemiczny) - badanie właściwości biochemicznych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae. Za pomocą ezy posiać bakterie z odpowiedniej zawiesiny (1 szczep na parę): 1. Escherichia coli 2. Proteus mirabilis 3. Klebsiella pneumoniae na następujące podłoża: * Podłoże Kliglera — badanie zdolności bakterii do rozkładu glukozy, laktozy, wytwarzania siarkowodoru, wytwarzania gazu* * Podłoże MIU — określanie ruchliwości bakterii, badanie zdolności bakterii do wytwarzania indolu i ureazy * Podłoże z laktozą (pod parafiną) — badanie zdolności bakterii do fermentacji laktozy * Podłoże z mannitolem - badanie zdolności rozkładu mannitolu * Trypton water - badanie zdolności bakterii do wytwarzania indolu. * Podłoże Kliglera — badanie zdolności bakterii do rozkładu glukozy, laktozy, wytwarzania siarkowodoru, wytwarzania gazu* Podłoże przygotowywane w probówkach w postaci półskosów (barwy brązowo - pomarańczowej lub podobnej — interpretacja koloru wedle uznania). Posiew badanego szczepu należy wykonać poprzez wkłucie w części słupkowej oraz po powierzchni skosu. Odczyt powinien być dokonywany po 24 godz. Rozkład glukozy przejawia się zażółceniem części słupkowej podłoża, natomiast rozkład laktozy — zażółceniem skosu podłoża. A zatem: * żółty słupek + żółty skos = rozkład glukozy i laktozy