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Ce document présente les principes fondamentaux de la chromatographie en phase liquide (CPL) et en phase gazeuse (CPG), deux techniques analytiques puissantes utilisées pour séparer et identifier les composants d'un mélange complexe. Il aborde les différents types de chromatographie, les paramètres clés comme le temps de rétention, le facteur de capacité et la perte de charge, ainsi que les éléments de l'appareillage. Il décrit également en détail la chromatographie par échange d'ions et la chromatographie d'exclusion stérique. Enfin, il présente les principes de la chromatographie en phase gazeuse, notamment la différence entre chromatographie gaz-solide et gaz-liquide, ainsi que l'optimisation des paramètres opérationnels. Ce document fournit une compréhension approfondie des techniques chromatographiques et de leurs applications dans divers domaines scientifiques.
Typology: Lecture notes
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Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique Université Abderahman Mira Béjaia Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département des Sciences Alimentaires
Méthodes Séparatives
obtienne de très bonnes résolutions en séparant plusieurs centaines de composés différents par échange d’ions sous haute pression. C’est grâce à ce nouveau procédé, et grâce surtout aux nouvelles technologies (notamment le traitement par ordinateur) que la chromatographie en phase liquide sur colonne a atteint l’efficacité de la chromatographie en phase gazeuse. Cette chromatographie en phase liquide sous haute pression, ou haute performance (HPLC) est désormais la seule utilisée en analyse. Aujourd’hui la chromatographie liquide est la technique analytique la plus utilisé à l’heure actuelle.
Le principe de la chromatographie repose sur l'équilibre de concentrations des composés (soluté S) présents entre deux phases en contact : la phase stationnaire et la phase mobile (gaz ou liquide) qui se déplace. La séparation est basée sur l'entraînement différentiel des constituants du mélange. Ces derniers parcourent la phase stationnaire avec des temps proportionnels à leurs propriétés intrinsèques (taille, structure, ...) ou à leur affinité avec la phase stationnaire (polarité, ...).
[S]phase mobile [S]phase stationnaire
L'élution d'un soluté S en chromatographie est donc caractérisé par la constante d'équilibre K , appelée aussi constante de partition, de distribution ou constante de Nernst.
C’est le paramètre physico-chimique de base en chromatographie qui quantifie le rapport de concentration de chaque composé entre les deux phases en présence.
𝐾 = [S]phase^ stationnaire [S]phase mobile
Les facteurs qui contrôlent la séparation sont surtout d'ordre thermodynamique: la rétention de l'échantillon sur la colonne est donc contrôlée thermodynamiquement.
(eq. 1)
K varie avec la température T suivant l'équation classique (eq.1), où ΔrG° est la différence d'énergie libre de dissolution du soluté S entre les 2 phases. K est >>1 donc ΔrG° est négative.
K
On peut classer les méthodes chromatographiques de trois manières: o selon la nature des phases o selon la nature des phénomènes mis en jeu dans la séparation o selon la technologie mise en œuvre.
Selon la nature de la phase mobile on distingue:
Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction avec les molécules à séparer. On distingue ainsi:
La chromatographie d'adsorption : La séparation entre les molécules est fondée sur le processus répété d'adsorption et désorption par la phase stationnaire. Dans les premières études les phases stationnaires « modèles d’études » étaient la silice et la cellulose. En conséquence, les phénomènes étudiés correspondaient essentiellement à des interactions de type liaison hydrogène. D’autres phases ont été utilisées depuis avec des mécanismes d’échange impliquant des liaisons Van der Waals, hydrogène et des interactions hydrophobes. Il s'agit d’une chromatographie liquide- solide.
un soluté dans la phase stationnaire, soit :
Ici t 0 est le temps du début de l’injection, cependant dans certains ouvrages il symbolise le temps mort.
Le volume d’élution (de rétention) Vr de chaque soluté représente le volume de phase mobile nécessaire pour le faire migrer d’une extrémité à l’autre de la colonne. Il correspond sur le chromatogramme au volume de la phase mobile qui s’est écoulé entre l’instant de l’injection et celui correspondant au maximum du pic. Si le débit D est stationnaire,
Vr = tr.D (eq. 3).
Il correspond au volume de phase mobile dans lequel le composé est dilué en sortie de
colonne. Il vaut par définition : Vpic = ɷ ·D (eq. 4).
ɷ : correspond à la largeur du pic à la base.
Le volume de la phase mobile dans la colonne (encore appelé volume mort) Vm correspond au volume interstitiel accessible. Il peut être calculé d’après le chromatogramme, à condition d’introduire un soluté non retenu par la phase stationnaire. On peut l’exprimer en
fonction de tm et du débit D : Vm = tm·D (eq. 5)
Ce volume désigné par Vs n’apparaît pas sur le chromatogramme. Dans les cas simples on le calcule en retranchant du volume total interne de la colonne vide le volume de la phase mobile.
En chromatographie chaque soluté injecté dans la colonne est soumis à deux effets antagonistes : un effet d’entraînement par la phase mobile dans laquelle il est soluble et un effet de rétention avec la phase stationnaire avec laquelle il interagit. On caractérise la distribution de chaque soluté entre les deux phases par le coefficient de partage ou coefficient de distribution.
A un instant donné, le soluté est à la concentration Cm dans la phase mobile et Cs dans la phase stationnaire. Leur rapport à l'équilibre est appelé coefficient de partage K
𝑲 = (^) 𝐂𝐦𝐂𝐬 (eq. 6)
Lorsque le soluté n’a aucune affinité avec la phase stationnaire, Cs est nulle, donc K=0. Le soluté n’est pas retenu dans la colonne si la phase mobile est très différente du solvant d’injection, il y’a un risque de faire précipiter le soluté en tête de colonne, donc de la boucher. Dans ce cas le soluté peut ne jamais sortir du système chromatographique. Ce qui veut dire que la Cm ne peut pas être nulle.
Le coefficient de partage est fonction de trois types d’affinités : celle entre le soluté et la phase mobile celle entre le soluté et la phase stationnaire mais aussi celle entre les phases stationnaire et mobile.
Compte tenu des equations 3 et 5 le volume de rétention Vr d’un soluté pourra s’écrire :
Ou :
La largeur d'un pic est caractéristique de l'efficacité de la séparation : plus le pic est fin plus la chromatographie est efficace. L'efficacité est mesurée par le nombre de plateaux
Une colonne de N plateaux théoriques est une colonne divisée en N petits disques cylindriques successifs. On admet que la phase mobile progresse non pas de façon continue, mais par sauts successifs d'un plateau théorique à l'autre. Dans chaque plateau théorique, on observe une rétention du soluté S, du fait de l'équilibre de ce produit entre la phase mobile [S]pm et la phase stationnaire [S]ps.
Une colonne réelle aura donc "N plateaux théoriques" si elle se comporte comme une "colonne à distiller théorique" de N plateaux.
Figure 2. Model des plateaux théoriques
Dans cette théorie, les pics de chromatographie ont une forme gaussienne et la variance s^2 est reliée au nombre de plateaux théoriques N et au temps de rétention tr par la relation:
N augmente donc avec le temps de rétention et diminue si la largeur des pics ( s) augmente. D'après la relation 12, une « bonne » colonne de chromatographie qui conduit à des pics fins ( s petit) pour des temps de rétention ( tr ) élevés, est donc caractérisée par un nombre de plateaux théoriques N élevé. Sur le chromatogramme (figure 3) , s représente la demi-largeur du pic à 60 , 6 % de sa hauteur et tr le temps de rétention du composé. tr et s doivent être mesurés dans la même unité (temps, distances ou volumes écoulés, si le débit est constant). Si on exprime s en unités de volume (en faisant intervenir le débit), 4 s correspond au « volume du pic » soit 95 % du composé injecté. Par suite des propriétés de la courbe de Gauss ( ɷ = 4 s ), il en résulte
l’equation 13. 𝑁 = 16 𝑡𝑟 ɷ^22 (eq. 13)
Les pics étant assez souvent déformés à la base, cette dernière est rarement employée : on utilise de préférence la formule équivalente 14.
𝑁 = 5,54 𝑡𝑟^
2 𝛿^2 (eq. 14)
Figure 3. Caractéristiques d’un pic chromatographique
La contribution de A est nulle pour une colonne capillaire de chromatographie en phase gazeuse.
Diffusion longitudinale (Terme B) Le terme B/u traduit la dispersion du soluté à cause de la diffusion du soluté dans la colonne. Par exemple, dans un flux liquide, les molécules au centre du flux progressent plus vite que celles qui sont sur les bords au contact des particules; on a B = 2 g Dm où g est une constante (g<1). et Dm est le coefficient de diffusion du soluté dans la phase mobile.
Le terme B/u est évidemment inversement proportionnel à u. L'efficacité d'une colonne augmente avec la vitesse de la phase mobile.Ceci peut expliquer les bonnes séparations obtenues en HPLC; de plus, comme le terme Dm est environ 5 fois plus grand en CPG qu'en CPL, il en résulte que la contribution de la diffusion longitudinale est presque négligeable en HPLC.
Résistance au transfert de masse (Terme C) Ce terme Cu* représente la résistance au transfert du soluté entre les phases mobiles et stationnaires, cette résistance empêche l'établissement de l'équilibre entre S(pm) et S(ps). Ce phénomène est du par exemple au fait que certaines molécules stagnent dans les pores de la phase stationnaire.
Plus la vitesse ( u ) de la phase mobile diminue, plus les molécules de soluté peuvent pénétrer dans la phase stationnaire, plus l'équilibre entre les 2 phases est favorisé et plus la colonne est performante.
Le terme C est proportionnel à ( dp^2 /Dm ), les colonnes les plus efficaces seront celles régulièrement remplies et bien tassées où le diamètre des particules est le plus faible possible. Il faut également utiliser des solvants de faible viscosité pour minimiser ce terme.
La représentation graphique de l'équation (eq. 17) est appelée courbe de Van Deemter (figure 4). L’analyse de cette courbe montre l'existence d'un débit optimal de phase mobile pour lequel l'efficacité de la colonne est maximum (HEPT minimum).
Réduire le débit de la phase mobile en deçà de ce débit optimal peut diminuer fortement le pouvoir séparatif d'une colonne, surtout en CPG où la contribution du terme B/u est importante
Contrairement à la CPG, en HPLC au-dessus du débit optimal, l'efficacité de la colonne est pratiquement indépendante du débit de la phase mobile. Ceci permet de raccourcir les temps d'analyse, sans perdre trop de pouvoir de séparation.
Ils existent d’autres formulations de l’équation de Van Deemter plus adaptées à la HPLC .
Les trois coefficients numériques expérimentaux A , B et C sont reliés à divers paramètres physico-chimiques, à la colonne et aux conditions opératoires. Si on choisit d’exprimer H en cm, A sera en cm, B en cm^2 /s et C en s (la vitesse étant en cm/s). La courbe
Si dans certaines conditions, deux constituants sortent à des temps proches, leurs pics risquent de se chevaucher. En optimisant les conditions analytiques, il est possible d’améliorer l’allure du chromatogramme. Le paramètre de résolution R quantifie la qualité de cette séparation. Bien qu’on la mesure, en général, sur deux pics contigus, elle peut être calculée sur n’importe quel couple de pics.
R < 1 : mauvaise résolution
1 < R < 1,4 : résolution acceptable
1,4 < R < 1,6 : résolution optimale
R > 1,6 : résolution trop bonne car le temps d'analyse est rallongé
Figure 6. Influence du terme R sur la séparation de deux pics d'intensité égale
Remarque : Si les pics sont gaussiens ɷ= 1,7 δ
Il est parfois utile d'exprimer cette résolution en fonction de la sélectivité et de l'efficacité du dernier des 2 pics étudiés
(eq. 20)
A l'intérieur d'une colonne la phase mobile frotte sur les parois de la colonne mais aussi sur les particules de phase stationnaire. Ces frottements définissent la résistance à l'écoulement. Les particules de phase stationnaire sont sphériques. Si l'on divise leur diamètre
par 10, on diminue leur surface d'un facteur 100 et leur volume d'un facteur 1000. On peut donc placer dans la colonne 1000 fois plus de particules et donc augmenter de 10 fois la surface en contact avec la phase mobile. La résistance à l'écoulement est donc augmentée.
En conséquence, pour maintenir le débit constant dans la colonne il faut augmenter la pression plus la granulométrie de la phase stationnaire est faible.
En HPLC on travaille, en tête de colonne, à des pressions entre 20 et 150 bars. La perte de charge qui est la différence de pression entre l’entrée et la sortie de la colonne est donnée par la loi de Darcy :
Φ (sans dimension) facteur de résistance à l’écoulement ;
D (m) diamètre moyen des particules ;
𝛈 (Pa. s) viscosité ;
L (m) longueur de la colonne ;
u (m. s-1) vitesse de la phase mobile.
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