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Chromatographie (Notions fondamentales)
I. Introduction
La chromatographie est un procédé physico-chimique de séparation au même titre que la
distillation ou l’extraction fractionnée d’un mélange homogène liquide ou gazeux. Le but est
d’identifier et quantifier des composés au sein d’échantillons divers. Le principe de base
repose sur les équilibres de concentration qui apparaissent lorsqu’un composé est mis en
présence de deux phases non miscibles. L’une, dite stationnaire, est emprisonnée dans une
colonne ou fixée sur un support et l’autre, dite mobile, se déplace au contact de la première. Si
plusieurs composés sont présents, ils se trouvent entraînés à des vitesses différentes par la phase
mobile, le long de la phase stationnaire, provoquant leur séparation.
La phase stationnaire:
Reste en place, soit dans une colonne, soit sur une surface plane.
La phase mobile
: Phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire,
entraînant l’analyte avec elle.
L'élution :
Processus au cours duquel les analytes sont entraînés à travers
une phase stationnaire par le mouvement d’une phase mobile.
Expérience de base de la chromatographie
L'élution d'un soluté S en chromatographie est donc caractérisée par la constante d'équilibre K ,
appelée aussi constante de partition (partage), de distribution ou constante de Nernst.
C’est le paramètre physico-chimique de base en chromatographie qui quantifie le rapport de
concentration de chaque composé entre les deux phases en présence.
Les facteurs qui contrôlent la séparation sont surtout d'ordre thermodynamique: la rétention de
l'échantillon sur la colonne est donc contrôlée thermodynamiquement.
K varie avec la température T suivant l'équation classique (eq.1), où Δ r
G° est la différence
d'énergie libre de dissolution du soluté S entre les 2 phases. K est >>1 donc Δ r
G° est négative
Classification
On peut classer les méthodes chromatographiques de trois manières
I. Selon la technologie mise en œuvre
a) Chromatographie sur colonne
b) Chromatographie de surface :sur papier ou sur couche mince (CCM)
II. Selon la nature des phases
1 - Selon la nature de la phase mobile on distingue
a) la chromatographie en phase liquide CPL;
b) la chromatographie en phase gazeuse CPG;
c) la chromatographie en phase supercritique CPS.
2 - Selon la nature de la phase stationnaire on distingue
a) Les ingrédients nécessaires C, colonne, PS, phase stationnaire, PM, phase mobile et E, échantillon ;
b) le dépôt de l’échantillon ;
c) le début de l’élution ;
d) La récupération des produits après séparation ( à des vitesses différentes )
[
]
[
]
LE CHROMATOGRAMME (Grandeurs fondamentales et définitions)
A. Notion de temps
Courbe qui traduit la variation au cours du temps d’un paramètre relié à la concentration
instantanée du soluté en sortie de colonne
Le temps (ou très rarement le volume d’élution) est porté en abscisse et l’intensité du signal de
détection en ordonnée.
La ligne de base correspond au tracé obtenu en l’absence de composé élué
Un constituant est caractérisé par son temps de rétention t R
, qui représente le temps écoulé
entre l’instant de l’injection et celui qui correspond sur le chromatogramme au maximum du
pic qui lui est lié. t R
est indépendant de la quantité injectée.
Le temps mort tm est le temps mis par un constituant non retenu par la phase stationnaire pour
traverser la colonne et sortir (temps passé dans la phase mobile).
- Temps de rétention réduit t R
La différence entre le temps de rétention et le temps mort est désignée par le temps de
rétention réduit du soluté t R
B. Notion de volume
- Volume d’élution ou volume de rétention Vr
t
R
Le volume de phase mobile nécessaire pour faire migrer un soluté d’une extrémité à l’autre
de la colonne. Il correspond sur le chromatogramme au volume de la phase mobile qui s’est
écoulé entre l’instant de l’injection et celui correspondant au maximum du pic. Si le débit D est
stationnaire,
Il correspond au volume de phase mobile dans lequel le composé est dilué en sortie de
colonne. Il vaut par définition :
ɷ : correspond à la largeur du pic à la base.
- Volume de la phase mobile dans la colonne (volume mort Vm)
Le volume de la phase mobile dans la colonne (encore appelé volume mort) Vm correspond au
volume interstitiel accessible. C’est donc le volume de phase mobile qui passe à travers
la colonne pour aller d'une extrémité à l'autre de la colonne (pendant le temps tm). Il peut être
calculé d’après le chromatogramme, à condition d’introduire un soluté non retenu par la phase
stationnaire. On peut l’exprimer en fonction de tm et du débit D :
- Volume de la phase stationnaire
Ce volume désigné par Vs n’apparaît pas sur le chromatogramme. Dans les cas simples on le
calcule en retirant du volume total interne de la colonne vide le volume de la phase mobile
C. Notion de concentration
Vr = tr.D
Vpic = ɷ·D
Vm= tm·D
Dans cette théorie, les pics de chromatographie ont une forme gaussienne et la variance s
2
(s
2
) est reliée au nombre de plateaux théoriques N et au temps de rétention tr par la relation:
N augmente donc avec le temps de rétention et diminue si la largeur des pics (s) augmente.
Une « bonne » colonne de chromatographie qui conduit à des pics fins (s petit) pour des temps
de rétention (tr) élevés, est donc caractérisée par un nombre de plateaux théoriques N élevé.
Pics d’élution Gaussiens
Le pic a le même aspect que la représentation
graphique de la loi Normale de distribution
des erreurs aléatoires
N s
2
=(tr)
2
En conservant les notations classiques μ correspond ici
au temps de rétention et
s à l’écart-type du pic d’élution (dont le carré
symbolise la variance).
y représente le signal, en fonction du temps x , du
détecteur situé en sortie de colonne
Cette fonction caractérise une courbe paire (maximum
pour x = 0, y = 0,399) qui
possède deux points d’inflexion pour x = ± 1 dont
l’ordonnée est de 0,242 (soit
60,6 % de la valeur du maximum) et dont la largeur
aux points d’inflexion est égale à 2 s (s = 1)
En chromatographie, désigne la largeur à mi-hauteur
(d = 2,35 s ) et s
2
la variance du
pic. La largeur « à la base » du pic, appelée ɷ est
mesurée à 13,5 % de la hauteur, point où,
la courbe étant gaussienne, on a ɷ = 4 s par définition.
Il en résulte:
𝟐
𝟐
Les pics étant assez souvent déformés à la base, cette dernière est rarement employée : on utilise
de préférence la formule équivalente :
Pour les asymétriques (ce qui souvent le cas), on rencontre parfois la relation suivante
𝜔0,1:𝑑é𝑠𝑖𝑔𝑛𝑒 𝑙𝑎 𝑙𝑎𝑟𝑔𝑒𝑢𝑟 𝑑𝑢 𝑝𝑖𝑐
𝑚𝑒𝑠𝑢𝑟é𝑒 à 10 % 𝑑𝑒 𝑙𝑎 ℎ𝑎𝑢𝑡𝑒𝑢𝑟,
- Efficacité réelle (nombre de plateaux théoriques effectifs)
Afin de comparer les performances de colonnes de conceptions différentes , vis-à-vis d’un
même composé, – on remplace le temps total t R
par le temps de rétention réduit t R
’ qui ne tient
pas compte du temps mort t M
passé par le composé dans la phase mobile. Les précédentes
expressions deviennent :
ET
Deviennent
Donc Neff (nombre de plateaux effectifs) dépend vraiment du temps passé dans la phase
stationnaire
- Hauteur équivalent à un plateau théorique H
Il permet de comparer des colonnes de longueurs différentes,
bien qu’il ne s’agisse en aucune façon d’une constante.
Sa valeur dépend du composé choisi et des conditions
de l’expérience.
𝟐
𝟐
R
%,'
S
(
T
+ 1 , 25 W
N s
2
=(tr)
2
𝒕𝒓
𝟐
𝜹
𝟐
(
(
!(
(
(
(
𝑳
𝑵
qu’on la mesure, en général, sur deux pics contigus, elle peut être calculée sur n’importe quel
couple de pics.
R < 1 : mauvaise résolution
1 < R < 1,4 : résolution acceptable
1,4 < R < 1,6 : résolution optimale
R > 1,6 : résolution trop bonne car le temps d'analyse est rallongé
Influence du terme R sur la séparation de deux pics d'intensité égale
F. Notion de pression
A l'intérieur d'une colonne, la phase mobile frotte sur les parois de la colonne mais aussi sur les
particules de phase stationnaire. Ces frottements définissent la résistance à l'écoulement. Les
particules de phase stationnaire sont sphériques. Si l'on divise leur diamètre par 10, on diminue
leur surface d'un facteur 100 et leur volume d'un facteur 1000. On peut donc placer dans la
colonne 1000 fois plus de particules et donc augmenter de 10 fois la surface en contact avec la
phase mobile. La résistance à l'écoulement est donc augmentée.
En conséquence, pour maintenir le débit constant dans la colonne il faut augmenter la
pression plus la granulométrie de la phase stationnaire faible
En HPLC on travaille, en tête de colonne, à des pressions entre 20 et 150 bars. La perte de
charge qui est la différence de pression entre l’entrée et la sortie de la colonne est donnée par
la loi de Darcy :
Φ (sans dimension) facteur de résistance à l’écoulement ;
D (m) diamètre moyen des particules ;
𝛈 (Pa. s) viscosité ;
L (m) longueur de la colonne ;
u (m. s
) vitesse de la phase mobile.
(
'
'
(
𝟐
La vitesse doit avoir une incidence sur la progression des analytes dans la colonne, donc sur
leur dispersion, en bref sur la qualité de l’analyse en cours
L’influence de la vitesse de la phase mobile a été mise en évidence par Van Deemter qui a
proposé la première équation cinétique , dans le cas des colonnes remplies en
chromatographie en phase gazeuse.
Modèle cinétique de la chromatographie
Influence de la vitesse de la phase mobile
Ce modèle issu de la mécanique des fluides a été mis au point par J.J. Van Deemter. En 1956 ,
ce physicien a mis au point l'équation qui relie H (HEPT) aux caractéristiques physiques de la
colonne et de la phase mobile.
Elle relie H (HEPT) à la vitesse linéaire moyenne d’écoulement de la phase mobile μ dans la
colonne. Cette équation montre qu’il existe un débit optimal pour chaque colonne,
correspondant au minimum de H, tel que le prévoit la courbe représentant l’équation
Débit trop fort ou débit trop lent= diminution de l’efficacité
Pour expliquer ce phénomène , il faut revenir sur les 03 coefficients numériques expérimentaux
A, B et C sont reliés a divers paramètres physico-chimiques à la colonne et aux conditions
opératoires, qui peuvent être repéré sur le graphe.
- Diffusion turbulente (Terme A)
Remarque : La contribution de A est nulle pour une colonne capillaire de CPG.
μ
Suivant la taille et la forme des particules, ils existent pour
la phase mobile, plusieurs trajets possibles, cette
particularité contribue à l'élargissement des pics d'où A = 2
l dp. l est une constante voisine de 1. dp est le diamètre
moyen des particules. Donc, plus les particules sont petites
et plus le remplissage est homogène , plus l'efficacité de la
colonne augmente,
Courbe de Van Deemter
Réduire le débit de la phase mobile en dessous de ce débit optimal peut diminuer fortement le
pouvoir séparatif d'une colonne, surtout en CPG où la contribution du terme B/u est importante,
Contrairement à la CPG, en HPLC au-dessus du débit optimal, l'efficacité de la colonne est
pratiquement indépendante du débit de la phase mobile. Ceci permet de raccourcir les temps
d'analyse, sans perdre trop de pouvoir de séparation.
En conclusion l'efficacité calculée d'une chromatographie, représentée par la HEPT, est
fonction de la vitesse de la phase mobile donc du débit, et de la qualité (régularité,
remplissage) de la phase stationnaire.
- Analyse quantitative par chromatographie
Pour calculer la concentration massique d’un composé responsable d’un pic sur le
chromatogramme il faut réunir deux conditions :
1/ Disposer d’un échantillonneur automatique du composé que l’on veut doser, à usage de
référence pour déterminer la sensibilité du détecteur à son égard,
2/ Disposer d’un moyen logiciel ou autre pour connaître soit les hauteurs soit les aires des pics
La représentation graphique de cette équation est appelée courbe de Van Deemter. L’analyse de cette
courbe montre l'existence d'un débit optimal de phase mobile pour lequel l'efficacité de la colonne
est maximum (HEPT minimum).
345
m
𝒊
: masse du composé i injectée dans la colonne
𝒊
: coefficient de réponse absolu du composé i (à ne pas confondre avec le coeff de partition)
dépend du réglage du chromatographe
𝒊
: aire du pic d’élution du composé i,
Méthode d’étalonnage externe
et
donc
Méthode de l’étalonnage interne (Etalon Interne)
Repose sur l’utilisation du coefficient de réponse relatif de chaque composé à doser vis-
à-vis d’un marqueur introduit comme référence.
Nécessite deux chromatogrammes l’un pour calculer les coefficients de réponse relatifs
et l’autre pour l’analyse de l’échantillon.
Les aires des pics des produits à quantifier sont donc comparés avec celles d’un composé
de référence, appelé Etalon Interne,
𝒊
𝒊
𝒊
𝒓𝒆𝒇
𝒓é𝒇
𝒓é𝒇
é𝒄𝒉
é𝒄𝒉
é𝒄𝒉
é𝒄𝒉
𝒓𝒆𝒇
é𝒄𝒉
𝒓é𝒇
Soit et
Ces rapports permettent de calculer les coefficients de réponse relatifs de 1 et de 2 vis-à-vis E
choisi comme étalon, et désignés par 𝒌
𝟏/𝑬
et 𝒌
𝟐/𝑬
et
Comme 𝒎
𝒊
sont proportionnelles aux concentrations massiques correspondantes 𝑪
𝒊
𝒊
donc
et
Calcul des concentrations
Et en déduire sa teneur dans l’échantillon, exprimée en %
Conclusion : cette méthode générale et reproductible, exige un bon choix de l’étalon interne
dont les caractéristiques sont :
- Pur et ne se trouve pas dans l’échantillon
- Son pic d’élution doit être bien résolu
- Il doit être inerte vis-à-vis des composés de l’échantillon
- Son temps de rétention doit être proche de celui du soluté à doser
𝟏
𝑬
𝟏
𝟏
𝑬
𝑬
𝟐
𝑬
𝟐
𝟐
𝑬
𝑬
𝟏/𝑬
𝟏
𝑬
𝟏
𝑬
𝑬
𝟏
𝟐/𝑬
𝟐
𝑬
𝟐
𝑬
𝑬
𝟐
𝟏/𝑬
𝟏
𝑬
𝑬
𝟏
𝟐/𝑬
𝟐
𝑬
𝑬
𝟐
𝒊
!
𝑬
!
𝒊/𝑬
𝒊
!
𝑬
!
𝒊
𝑪
𝒊
Masse d’échantillon prélevée
- Sa concentration doit être proche ou supérieure à celles des autres solutés pour être dans
les conditions d’une réponse linéaire du détecteur
