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Asignatura: Enzimología, Profesor: Elena Bogónez, Carrera: Bioquímica, Universidad: UAM
Tipo: Apuntes
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[ C o m p a n y A d d r e s s ]
TEMA 1: INTRODUCCIÓN, CONCEPTOS DE ENZIMA COMO CATALIZADOR BIOLÓGICO Definimos enzima como toda proteína con la propiedad de catalizar una reacción. Sin embargo, en los años ochenta, se encontró que no sólo las proteínas pueden funcionar como catalizadores, sino que otras biomoléculas, más concretamente el RNA, entra a formar parte del juego. Estos catalizadores de ácido nucleico, se llaman ribozimas,(como la ribonucleasa P, el Trna, y el autosplicing) para diferenciarlas de los biocatalizadores comunes, que son proteicos. Por ello se define como enzima aquella macromolécula biológica con capacidad catalítica. Estas ribozimas se encontraron por primera vez en un protozoo ciliado, implicadas en el procesamiento del rRNA, cuyo proceso es catalizado por él mismo (autocatálisis). La maduración de este tipo de RNA consiste principalmente en la eliminación de los intrones transcritos. No sólo aparecen en procesos autocatalíticos, también en procesos de maduración de los tRNAs, dando en primer lugar un precursor y posteriormente el tRNA maduro tRNA Precursor-tRNA tRNA maduro Anticuerpos catalíticos : abzimas, tienen grandes aplicaciones biotecnológicas, los abzimas, algunos generados de manera natural, reconocen un determinado tipo de estructura un intermediario de una reacción bioquímica (último tema).las abzimas (de antibody, anticuerpo en inglés y enzima) también llamada catmab (de catalytic monoclonal antibody, anticuerpo catalítico monoclonal), es un anticuerpo monoclonal con actividad catalítica. Las moléculas que se modifican para adquirir nuevas actividades catalíticas se llaman sinzimas. Las Abzimas son normalmente constructos artificiales, pero también se encuentran en los organismos normales y en humanos, como en el caso de los autoanticuerpos anti-péptido vasoactivo intestinal, y en el caso del lupus eritematoso en el que los autoanticuerpos se pueden unir al ADN e hidrolizarlo. Las Abzimas son potenciales herramientas de biotecnología, por ejemplo, para efectuar determinadas manipulaciones en el ADN.
Catalizador: compuesto que aumenta la velocidad de la reacción química sin destruirse o incorporarse al producto (UIPAC). Eso es válido para las enzimas como subtipo de catalziador. Durante el mecanismo catalítico puede sufrir cambios conformacionles e incluso covalentes pero deben de ser capaces de recuperarse al final del ciclo Reducen la energía de activación, igualan la diferencia de los niveles de energía libre del estado basal de la reacción (de los sustratos) y el estado activado de transición que es una barrera energética que tienen que vencer para pasar a ser productos. Esta reducción energética, que se produce en la reacción catalizada en contra de que no sea catalizada produce un aumento considerable de la velocidad de la reacción y de conseguirse le equilibrio esta relación es por la que aumenta la v de la reacción, que es exponencial por eso aumenta tanto la velocidad de reacción. En algunas enzimas, lo que sucede es además estabilizar el estado de transición, sigue una ruta alternativa, se produce un desdoblamiento del mecanismo, en vez de hacerlo en una sola reacción lo hace en varias , con varios estados de transición y pasando por intermediarios químicos, más estables que el estado de transición “original” pero son menos estables que los sustratos y los productos por ello tienen una energía superior. La etapa limitante, va a tener una energía de activación inferior a la reacción no catalizada. El catalizador aumenta la velocidad en los dos sentidos de la reacción, de forma que la posición de equilibrio no cambia, viene dada por la constate de equilibrio que es la razón de los productos y los sustrato en equilibrio, el catalizador no lo modifica, porque esta asociación depende de la energía libre, solo disminuye el tiempo que se alcance el equilibrio acelera la reacción. Diferencias entre catalizadores orgánicos e inorgánicos zimaszimas :: macromoléculas biológicas catalíticamente activas
Ribozimasibozimas :: moléculas de RNA que poseen actividad enzimática, siendo sus sustratos en la mayoría de los casos RNA, ej:
frente al estado de transición de la reacción
Tema 1. PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMAS
uímica sin destruirse o incorporarse al producto (IUPAC)
avance de la reacción estado final estado
! En presencia del catalizador la reacción sigue, en algunos casos, un camino alternativo de menor energía de activación. ! El catalizador aumenta la velocidad en los dos sentidos de la reacción la posición de equilibrio no cambia, Keq = !G 0 = RT ln Keq [P]eq [S]eq ! El catalizador reduce la energía de activación , energía requerida para llevar a las especies químicas desde el estado inicial, o basal, al estado de transición , o activado, estado de energía libre más alta.
Estas son principalmente tres:
Formas de visualizarlo: Proteasa del VIH roja: dos aspáricos del centro activo de la enzima. Se forma el centor activo,justo en la unión entre las 2 subunidades, es un dímiero. cada uno de los ASP lo aporta una subunidad. La PKA es más superficial, como una hendidura en la superficie en la que s egenera el centro activo, trasforma péptidos de tamaño grande no peud emeterse en un hueco pequeño, más expuesto. ! Capacidad para discriminar entre varios sustratos alternativos diferencias en velocidades relativas de transformación. ! La especificidad está controlada por la estructura, la reacción tiene lugar en el centro activo de la enzima una vez formado el complejo enzima-sustrato.
Voet, Voet y Pratt Figura 11Figura 11-- 11 Complejo enzima-sustrato. La complementariedad geométrica y electrónica entre la enzima y el sustrato dependen de fuerzas no covalentes. Proteasa del VIH Proteasa del VIH ! La proteasa del VIH es un dímero, a diferencia de la mayoría de la familia de las aspartil proteasas (monómeros). ! Las subunidades son idénticas (99 aa). ! El centro activo se encuentra en la interfase entre ambas subunidades y es simétrico (simetría C2: giro de 180º sobre su eje genera la misma estructura). ! Los aminoácidos Asp-25, Thr-26 y Gly-27 de cada subunidad están localizados en la base del centro activo. ! Especificidad: hidrólisis de enlaces peptídicos entre un aminoácido aromático (Tyr o Phe) y prolina. Proteína kinasa A Proteína kinasa A
por los residuos que rodean al enlace, de modo que algunas cortarán si avanzando por la cadena se encuentran Lis, Arg, otras si es Met, pero no lo harán si hay una prolina… Todo esto dependiendo de cada enzima. Para aclaran esto, muestro la lista de enzimas proteasas de estructural. La especificidad amplia de reacción, se refiere especialmente al grupo de las lipasas, extraordinariamente grande. Todas ellas rompen el enlace ester. Dentro de las lipasas, las hay específicas de fosfolípidos, de triglicéridos, de esfingolípidos, de gangliosidos, pero dentro de cada uno de estos grupos, da igual el R y el R’. Repasando los dos tipos de especificidad amplia, creo que se puede diferenciar claramente entre la de reacción y la de grupo. Ambas son específicas de un tipo de enlace (peptídico, ester), sin embargo, la de grupo discrimina su acción en función de R y R’ (aminoácido antes o después), mientras que la de reacción no (da lo mismo el ácido graso del que se trate).
de las enzimas (proteínas en último caso) con moléculas más pequeñas. Estas moléculas son normalmente derivadas del metabolismo intermediario, y la interacción con la enzima suele producirse en un lugar alejado del centro activo (no son competidores con el sustrato). La regulación viene dada por un cambio en la conformación de la enzima que puede aumentar la avidez por el sustrato o disminuirla, dependiendo de los casos. Ente cambio conformacional puede transladarse a las subunidades de la enzima (en el caso de que esta sea multimérica), sin necesidad de que las demás interaccionen directamente con el modulador alostérico. Cooperación
Subsubclase oxidoreductasa, con donante alcohol, y si acepta los electrones es el NAD-NADP es es 1…. Habia 821 entradas de enzimas en esa susbsubclase Luego ver la estructura, y a reaccion que hace El 4º digito es el numero de serie que es la que la define 27. Endopeptidasas: − Dependen del primer aminoácido del enlace, es decir, que cortan el enlace aa 1 - C-N- aa 2 según cómo sea aa 1. Se dice que cortan “detrás de”: − Tripsina: Corta detrás de Lys y Arg, es decir, de aminoácidos básicos con carga, y siempre que detrás no haya un prolina. Es altamente específica y la imposibilidad de cortar antes de prolina se debe a la cadena lateral ciclada. Se encuentra en el estómago y es especialmente activa a pH 2. − Quimiotripsina: Corta detrás de Phe, Tyr, Trp y Leu, es decir, aminoácidos aromáticos o muy hidrófobos. Tampoco puede haber prolina detrás. − Clostripaína: Corta siempre detrás de arginina. − Dependen del segundo aminoácido del enlace, es decir, cortan el enlace aa 1 - C-N-aa 2 según cómo sea aa2. Se dice que cortan “delante de”: − Pepsina: Corta delante de aminoácidos aromáticos o muy hidrófobos y también de aminoácidos ácidos: Phe, Tyr, Trp, Leu, Asp y Glu; y siempre que el aminoácido anterior no sea la prolina. Sustituye a la tripsina en el intestino y es activa a pH 7. − Termolisina: Corta delante de aminoácidos aromáticos y alifáticos (con cadena lateral de hidrocarburo simple) siempre que sean ramificados: Phe, Tyr, Trp, Leu, Ile y Val. Tampoco puede haber una prolina antes. Exopeptidasas: Sólo se enumeran dos carboxipeptidasas, pero hay muchas más: − Carboxipeptidasa A: Corta todos los extremos C-terminales excepto si son residuos de aminoácidos básicos con carga a pH fisiológico o prolina, es decir, corta los extremos que no sean Arg, Lys o Pro. Aunque la histidina también es un aminoácido básico, la forma mayoritaria está desprotonada y sin carga a pH fisiológico, lo que unido a su rareza la excluyen de la lista antes mencionada. Además de esto, no cortará ningún extremo si el resto anterior es uno de prolina. − Carboxipeptidasa B: Corta todos los extremos excepto los que sean de aminoácidos básicos con carga (otra vez sin His) o de cisteína, es decir, corta los extremos que no sean Arg, Lys o Cys, y tampoco cortará si hay un resto de prolina anterior.
TEMA 2: CINÉTICA QUÍMICA Los Parámetros de velocidad que indican la funcionabilidad de la proteína. Ley de acción de masas: establece que la velocidad de la reacción es directamente proporcional al producto de las concentraciones de los reactivos. En el supuesto que haya varios, y sino es solo directamente. GRUPO PROSTÉTICOGRUPO PROSTÉTICO (cofactor unido fuertemente a la apoenzima)
! Las enzimas se clasifican de acuerdo a un sistema de numeración definido por la Comisión de Enzimas de la IUBMB. ! EC number : número de la Comisión de Enzimas, por ej. L-lactato deshidrogenasa : EC 1.1.1. ! nombre sistemático: (S)-lactato:NAD+^ oxidoreductasa clase (^) subclase sub-subclase enzima
la cantidad desaparecida de sustrato en sentido contrario es igual a la cantidad formada de producto por unidad de tiempo (monosustrato) la variación de sustrato se toma como nula, porque se pone infinita cantidad de él y a primeras etapa.
Siguiendo con la reacción sencilla de transformación de A en producto, necesitamos la ecuación de velocidad integrada. En este caso es sencilla:
como indica el subíndice, el cual no se volverá a colocar. La V es directamente proporcional a la cantidad de sustrato, por ello a una cantidad infinita sustrato (cuando A tiende a infinito) la V en poco tiempo se alcanzará la v máxima. Ver más adelante. En To => Vo Si integramos la ecuación anterior, entre dos límites de To y Tt. En equilibrio la velocidad se mantiene constante, tanto la positiva como la negativa por ello la velocidad es = la total de destrucción y formación. La concentración de los sustratos es constante pero hay transformación. Las enzimas reducen la energía de activación del sustrato por ello mayor número de moléculas a la vez alcanza el estado de trasición.
(ley elemental de velocidad) ! La velocidad de una reacción es directamente proporcional al producto de las concentraciones de los reactivos.
! Relación matemática entre velocidad y concentracione de los reactivos. A P [A] v d[A] dt
equilibrio: A P v (^) =v
equilibrio: A P v (^) =v v d[P] dt
! v 0 : tangente a la curva a tiempo 0 "[A] "t v 0 =
"t = ,^ valor constante
d[A] dt = = k [A] Integrando - (d[A])/[A] = k dt ln([A] 0 /[A]) = k t [A] = [A] 0 e-kt
! Ley de acción de masas ! Ecuación de velocidad ! Constante de velocidad ! Orden de reacción ! Molecularidad ! Mecanismo cinético Ley de acción de masas: (ley elemental de velocidad) ! La velocidad de una reacción es directamente proporcional al producto de las concentraciones de los reactivos. Ecuación de velocidad: ! Relación matemática entre velocidad y concentraciones de los reactivos. [A]^ A^ P v d[A] = dt equilibrio: A P v (^) =v t [P] t equilibrio: A P v (^) =v v d[P] = dt Velocidad Velocidad y velocidad inicial (vy velocidad inicial (v 00 )) ! v 0 : tangente a la curva a tiempo 0 ( !!! ) "[A] "t v 0 = "[P] = (^) "t , valor constante ! La velocidad de conversión de A es proporcional a [A]: v d[A] = (^) dt = k [A] Integrando - (d[A])/[A] = k dt ln([A] 0 /[A]) = k t [A] = [A] 0 e-kt
La velocidad es función del número de moléculas que alcanzan el estado de transición ET. colisiones efectivas: orientación y energía necesarias para que sean capaces de producir la reacción. La enzima actúa sobre la energía libre, disminuyéndola.
Determinación experimental del orden de reacción y del valor de la constante de velocidad K: para la reacción anterior, se analiza la velocidad frente al tiempo de la reacción a diferentes concentraciones de sustratos, obteniéndose diferentes velocidades iniciales, como la K es independiente de la concentración de sustrato y velocidad, la velocidad si que depende directamente de la concentración de sustrato. La k podemos sacarla mediante este método con la ecuación anterior. Y el orden de reacción por la forma de la curva.
Avance de la reacción
! Greacción
A: frecuencia de colisiones efectivas entre las moléculas de reactivos, A = P x Z (P, factor de probabilidad; Z, factor de frecuencia) !G* RT : factor energético, fracción de colisiones con energía igual o superior a la energía de activación !Grev*
v d[A] dt
Constante de velocidad de reacción (k) ET* !G* Avance de la reacción G ! Greacción ! La velocidad es función del número de moléculas que alcanzan la energía del estado de transición ¿qué factores afectan a la velocidad? ! temperatura ! !G* (Energía de activación, Ea) ! concentración de reactivos v d[A] = (^) dt = k [A][B] Ecuación de Arrhenius: Ecuación de Arrhenius: k = A e^ (!G/RT) A: frecuencia de colisiones efectivas entre las moléculas de reactivos, A = P x Z (P, factor de probabilidad; Z, factor de frecuencia) !G RT : factor energético, fracción de colisiones con energía igual o superior a la energía de activación !Grev* Determinación experimental del orden de la reacciónDeterminación experimental del orden de la reacción y del valor de la constante de velocidad (k)y del valor de la constante de velocidad (k) v d[A] = dt [A]^ A^ P t [A] 0 = 1 mM v 0 ! cada [A] 0 determinará un valor de velocidad inicial (v 0 ) v 0 [A] 0 = 0,7 mM v 0 [A] 0 = 0,4 mM
La ecuación de velocidad para las ecuaciones de segundo orden es la siguiente: ley de masas: Vo será proporcional tanto a la concentración de A Y B. Esta ecuación puede simplificarse si igualamos las concentraciones de A y B, de modo, que:
recta, sino una hipérbole exponencial. El análisis no suele coincidir con idénticas concentraciones de los sustratos, de modo, que lo que se hace es mantener una de las dos constante. Esto se consigue añadiendo uno de los dos en exceso, con lo que podemos considerar su variación constante con el tiempo. Al ser constante, la concentración de ese sustrato se incluye en la constante de
la constante de primer orden aparente, con unidades de constante de primer orden, tiempo-^1. v^0 (M/min [A] 0 (M) k : constante de velocidad de primer orden, tiene dimensiones de tiempo-1^ (min-1, s-1) v 0 [A] 0 = M/min M k= =min- v 0 = k [A] 0 Velocidad: reacción de primer orden Orden : un único término de concentración elevado a 1
A + B P v 0 = k [A] 0 [B] 0 Si [A] 0 = [B] 0 v 0 = k [A] 02 = k [B] 02 (ecuación de 2º orden) k : constante de velocidad de segundo orden, tiene dimensiones de concentración-1^ x tiempo- [A] 0 (M) v^0 (M/min) v 0 = k [A] 02 v 0 [A] 02 = M/min M^2 k= =M-1^ x min-
Como ya adelantábamos, la mayor simplicidad cinética, está en este tipo de reacciones. Como se sobrentiende, se trata de una reacción en la cual la velocidad es independiente de las concentraciones de los sustratos. De este modo, la representación gráfica de la [S] Vs t, nos da una línea horizontal, clara idea de independencia de la velocidad con respecto a la concentración de sustrato. Si la velocidad no depende de las concentraciones de sustrato, la única forma de hacerla variar, será mediante cambios en la temperatura, el pH o la concentración de enzima, inhibidores o potenciadores. puede ser muy compleja, etapa a etapa. Aunque el h20 o lo sprotones participen en la reacción, su concentración se la considera infinita, y por ello no hay diferencias de concentración. Siempre en eceso. Reacciones de primer orden aparente o pseudoprimer ordenReacciones de primer orden aparente o pseudoprimer orden ! Si uno de los sustratos se mantiene constante, por ej: [B] 0 constante y [A] 0 variable A + B P v 0 = k [A] 0 [B] 0 ! si k [B] 0 = k’ v 0 = k’ [A] 0 (ecuación de primer orden) k’: constante de velocidad de primer orden aparente, dimensiones de tiempo- Reacciones de orden ceroorden cero : velocidad independiente de la concentración de reactivo(s) ! número de moléculas que reaccionan en cada etapa o reacción elemental ! en función del número de reactivos (sustratos, productos) se denominan: Uni (uno) Bi (dos) Ter (tres) ! H 2 0 y H+^ no se consideran reactivos A + B P A + B C P ! etapas o reacciones elementales: 2 1ª etapa: molecularidad 2 (reacción bimolecular) 2ª etapa: molecularidad 1 (reacción unimolecular) 1ª 2ª
Reacciones de primer orden aparente o pseudoprimer orden Reacciones de primer orden aparente o pseudoprimer orden ! Si uno de los sustratos se mantiene constante, por ej: [B] 0 constante y [A] 0 variable A + B P v 0 = k [A] 0 [B] 0 ! si k [B] 0 = k’ v 0 = k’ [A] 0 (ecuación de primer orden) k’: constante de velocidad de primer orden aparente, dimensiones de tiempo- Reacciones de (^) orden ceroorden cero : velocidad independiente de la concentración de reactivo(s) ! número de moléculas que reaccionan en cada etapa o reacción elemental ! en función del número de reactivos (sustratos, productos) se denominan: Uni (uno) Bi (dos) Ter (tres) ! H 2 0 y H+^ no se consideran reactivos A + B P A + B C P ! etapas o reacciones elementales: 2 1ª etapa: molecularidad 2 (reacción bimolecular) 2ª etapa: molecularidad 1 (reacción unimolecular) 1ª 2ª MolecularidadMolecularidad
