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TEMA 5. CINÉTICA ENZIMÁTICA.
Cinética de Michaelis - Menten.
Las reacciones enzimáticas se caracterizan porque aunque se aumente la
concentración de sustrato la velocidad no aumenta linealmente, aparece un efecto de saturación. La saturación se debe a que todos los centros activos están ocupados. La velocidad depende de la cantidad de enzima con sustrato suficiente. Consideraremos sólo la velocidad inicial de las reacciones para cada concentración de sustrato cuano se construya una gráfica, evitando el error introducido por el deterioro del enzima. Como en el primer momento no hay producto no consideraremos la reacción contraria.
v
La velocidad depende de una constante de velocidad K y de su inversa: K 1 K (^2) E + S ES E + P K-1 K-
El paso limitante en la velocidad es K 2 , por lo tanto la expresión de la velocidad será:
Donde K 2 también recibe el nombre de K (^) CAT. La concentración de enzima será mucho menor
que la de sustrato porque no se consume. Los enzimas que siguen esta cinética se dice que siguen la cinética de Michaelis - Menten. Al aumentar la concentración de enzima la gráfica es igual pero por arriba.
Ecuación de velocidad de Michaelis - Menten.
La concentración de sustrato libre será prácticamente la concentración inicial porque la cantidad de enzima es muy pequeña. Haremos las siguientes consideraciones:
- donde puede despreciarse.
- La velocidad de transformación de sustrato en producto está limitada por K 2
- Hipótesis del estado estacionario: como la concentración de enzima es muy pequeña y la concentración de sustrato muy grande en el primer momento se llega a una concentración de complejo enzima - sustrato que es constante para toda la reacción.
S
t
- El enzima siempre tiene moléculas de sustrato en su centro activo de manera que la concentración de enzima - sustrato será prácticamente constante por lo que : velocidad de formación = velocidad de descomposición
A la relación entre constantes se le denomina constante de Michaelis - Menten:
En lugar de ponerlo en función de enzima libre lo ponemos en función de complejo enzima - sustrato:
Esto es válido para cuando todo el enzima esté formando complejo enzima - sustrato y si el enzima sigue la cinética de Michaelis - Menten.
- Si la concentración de sustrato es muy pequeña podemos despreciarla en el denominador.
La velocidad crece proporcionalmente a la concentración de sustrato , es de orden 1 respecto a el sustrato.
- Si la concentración de sustrato es grande, Km es despreciable:
V = v 0 La velocidad es independiente respecto a la concentración de sustrato. Es lo que ocurre en el tramo final de la gráfica que tiende asintóticamente a V. Es la ecuación de una hipérbola. El enzima presenta saturación de velocidad respecto a la concentración de sustrato. El enzima no seguirá la cinética de Michaelis - Menten si tiene cooperatividad en la unión del sustrato por lo que la curva será sigmoidea. La V será igual y la saturación dependerá e la concentración de enzima. La saturación se alcanza para determinada concentración de enzima, si la concentración de enzima es el doble la velocidad será el doble. La velocidad y F 0 6 Eson dos
formas de expresar la actividad de una proteína.
Significado de los parámetros.
E + B F 0 F 3EB F 0 E 0p V (^) B
Si el enzima es más específico por A entonces VA >VB , VA^ / (^) VB > 1 prefiere A.. Si se ponen en concentraciones iguales siendo la concentración de enzima constante:
Cálculo gráfico.
v Vm constante
Km F 0 5 BS F 0 5 D
Transformamos la ecuación en la de los dobles inversos con lo que sale la ecuación de una recta, calculando sólo algunos puntos se puede obtener:
pendiente ordenada en el origen 1/v 0 Km^ /V
1 / V
Km
Inhibición.
El efecto de un inhibidor es disminuir o bloquear la velocidad de una reacción catalizada uniéndose al enzima. La mayor parte de los enzimas están afectados. Son específicos, cualquier sustancia no sirve para unir cualquier enzima. Se alteran grupos importantes para la función catalítica o se altera ligeramente la conformación (con lo que la proteína ya no es activa) sin llegar a desnaturalizarlo. Los inhibidores sirven para distinguir los grupos esenciales. Inhibición permanente: unión del inhibidor irreversible por medio de enlaces covalentes provocando una modificación química de los grupos catalíticos. Una vez modificado el enzima está siempre inhibido. Para distinguirlo de los reversible se someten a diálisis y si no se separan enzima e inhibidor es permanente. Ejemplo: el iodoacetato reconoce grupos SH y OH y envenena la cisteína. S CH 2 - COO- HI Inhibición reversible: la unión del inhibidor y el enzima es reversible. Al quitar el inhibidor del medio se recupera la actividad. Hay varios tipos:
- Inhibición acompetitiva: el inhibidor sólo se une al complejo enzima - sustrato, que ya no formará producto, por lo que la velocidad bajará. El inhibidor no se une al centro activo sino a cualquier otro sitio, lo que hace que cambie la conformación y el enzima ya no es tan efectivo.
No se puede superar la inhibición aumentando la concentración de sustrato. La V con inhibidor (V I^ ) será más pequeña.
La Km será más pequeña, como si tuviera más afinidad: El resultado es una recta nueva que corta en un valor más grande de ordenadas y con pendiente igual. Si aumentamos la concentración de inhibidor obtenemos una familia de rectas con pendiente igual y corte en ordenadas más grande. (^1) / (^) V
1 / F 0 5 BS F 0 5 D
Inhibición mixta: intermedia entre acompetitiva y competitiva. El inhibidor (que no tiene porqué parecerse al sustrato) no se une al centro activo aunque tiene efecto de competitivo. La unión de uno y otro no son excluyentes. El resultado final depende de cual de los dos prevalezca. E + S ES E + P K (^) I K’I EI ESI
Competitiva. Km sube Acompetitiva. V no afectada Km baja
Competitiva + Acompetitiva.
El valor del punto de corte en ordenadas depende del efecto que prevalezca.
- Inhibición no competitiva: si KI = K’ (^) I el inhibidor se une por igual al enzima que al complejo
enzima - sustrato y KmI^ = K (^) m. El punto de corte en abcisas es igual con inhibidor que sin él. En
ordenadas es más grande por lo que V baja. Si Km se mantiene igual y V baja la pendiente aumenta. E + S F 0 D BES F 0 E 0E + P F 0 6 3KI F 0 6 3K (^) II EI F 0 D BESI
VI^ < V F 0 E 0 K Im K (^) m F 0 E 0
constante Sin inhibidor
El punto de corte con las abcisas da prueba de la importancia de relativa del efecto competitivo o acompetitivo para que lo corte por encima o por debajo.
- Inhibición no competitiva: cuando KI = K’ (^) I. En este caso da igual unirse al enzima que al complejo enzima - sustrato, aunque no se transformará igual de bien porque V es diferente. Cuanto más se parezca el inhibidor al estado de transición del sustrato más eficaz será el inhibidor. Son inhibidores muy potentes de la actividad catalítica del enzima.
Efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimática.
Efecto del pH: afecta al estado de disociación de los grupos, aunque todas las proteínas no se ven afectadas de igual forma porque algunas no tienen grupos disociables. La mayor parte de los enzimas tienen un pH óptimo. Si hay pequeños cambios de pH no se desnaturaliza el enzima. El pH puede afectar de dos maneras:
