¡Descarga 4.3. Transport Nucli-Citoplasma y más Apuntes en PDF de Biología Celular solo en Docsity!
4.3. Transport Nucli-Citoplasma
- El nucli inclou un espai, el nucleoplasma , on hi ha l’ADN i diferents ARNs
a més de proteïnes. La cromatina és l’ADN i proteïnes. Les proteïnes es
sintetitzen en el citoplasma i s’importen cap al nucli. Diferents RNAs
s’exporten del nucli, a part d’algunes proteïnes que retornen cap al
citoplasma.
- Tot aquest transport es realitza per la estructura que limita al nucleoplasma,
l’embolcall nuclear. Es tracta d’un sac aplanat en continuïtat amb el reticle
endoplasmàtic, que presenta uns complexes macromoleculars anomenats
porus nuclears , vies úniques de pas pel transport nucli-citoplasma.
- Aquesta importació i exportació està facilitada per diferents receptors
solubles, d’importació i d’exportació, anomenats respectivament
importines i exportines. Ambdós tipus de receptors estan relacionats
estructuralment i codificats per la mateixa família gènica de receptors de
transport nuclear o també anomenats carioferines.
- Per això els substrats proteics tenen els corresponents senyals d’importació
i d’exportació.
- Ambdós processos requereixen energia en forma de GTP. Una GTP-asa
monomèrica soluble (no associada a cap membrana) anomenada Ran hi
està implicada.
Figure 12-8 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Nucli i embolcall nuclear
- Complex macromolecular de 60 a 25 MDa en mamífers i de 40 a 60 MDa en llevats. Proteòmica: 30 proteïnes diferents anomenades nucleoporines (Nups). Quatre ancorades a membrana, la resta formant la carcassa del porus. La simetria d’ordre 8 implica que moltes proteïnes presentin vuit còpies, resultant 500 a 1000 Nups per porus. Algunes associades per blocs (building blocs). La bastida circular del porus està formada per dos grups de Nups. A més hi ha ambdós anells, citoplasmàtic i nuclear. Des de l’anell citoplasmàtic es projecten cap al citoplasma vuit filaments i des de l’anell nuclear d’altres vuit filaments nuclears formen una cistella (nuclear basket). El canal central és ocupat per un cabdell filamentós. Tot plegat amb els corresponents grups específics de Nups. En un terç de les Nups hi ha, en la seva seqüència d’aminoàcids, dominis repetitius rics en fenilalanina- glicina (FG). En particular, les Nups del cabdell central són riques d’aquests dominis, i per aquests dos aminoàcids es creen interaccions hidròfobes febles. D’aquesta manera aquesta estructura central esdevé un garbell que actua de barrera selectiva de pas. El mecanisme de pas pel complex el porus encara està en discussió. Entre els diferents models proposats, el “model de la fase selectiva” suposa que els receptors de caire hidròfob, que es transporten units a les seqüències senyal específiques dels substrats a transportar, competeixen amb les interaccions hidròfobes FG- FG, obrint-se pas per la barrera selectiva. La interacció entre els receptors i els dominis FG de les nucleoporines facilita el pas dels substrats a transportar, augmentant la seva solubilitat en el sí del cabdell del canal central.
D’ANGELO, M. et al., COCB, 25:378-386,
Complex del porus. Nucleoporines
Funció de les Nups en el control de l’expressió gènica
COCB, 23:346-353, 2011
La perifèria nuclear és un indret del nucleoplasma on l’expressió gènica normalment està reprimida (2) i on s’acumula gran part de la heterocromatina. No obstant això, els complexes dels porus nuclears, a part de ser vies de transport bidireccional entre el nucli i el citoplasma (1), constitueixen indrets puntuals on sí hom s’implementa la dita expressió. Certes Nups fan de reguladors positius de l’activació de gens, tant a nivell del porus (3) com dins del nucleoplasma (4), de manera que algunes d’aquestes Nups es reciclen entre el porus i el nucleoplasma. També els complexes dels porus intervenen en la formació de llaços de cromatina (5), en la reparació de l’ADN (6) i en la formació d’una zona d’exclusió de la heterocromatina (7).
Seminari : Senyal d’importació nuclear: NLS
NLS: Seqüència carboxiterminal de set aminoàcids bàsics:
Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val.
Senyal descrita el l’antigen T del virus SV
Quin tractament s’ha de fer en aquestes cèl·lules per a localitzar l’enzim, normal i quimèric? En la micrografia de la dreta, a part de la fluorescència del nucli, s’hauria de veure fluorescència en d’altres indrets de la cèl·lula?
Lodish, H. Macmillan,
7ª Ed. 2013
Figure 12-11 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Funció d’una senyal de localització nuclear (NLS)
Micrografies d’immunofluorescència que mostren la localització de l’antigen T del virus SV40 que te una seqüència NLS normal o mutant. En (A) l’heptapèptid senyal normal, ric en lisina, fa que l’antígen que porta la senyal s’importi i es localitzi en el nucli, com ho demostra la tinció immunofluorescent amb anticossos contra l’antigen T. En (B) la seqüència senyal alterada, fa que l’antigen portador de la senyal no s’importi al nucli i es localitzi en el citoplasma. Suggereix això dos fets: que una proteïna aliena al nucli, en aquest cas una proteïna vírica, amb una NLS, s’importa al nucli. La presència de la NLS és la condició necessària i suficient per la importació. En segon lloc que la NLS ha d’estar intacta.
Figure 12-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
L’importació i l’exportació de proteïnes consumeix GTP. Cicle i regulació de la Ran.
Les dues formes de Ran, Ran-GTP i de Ran-GDP són mòvils, entren i surten del nucli, i presenten un gradient de concentració: més concentració de Ran-GTP a dins del nucli i més concentració de Ran-GDP al citoplasma. Es deu això a que a dins del nucli hi ha la proteïna reguladora Ran-GEF (Guanine nucleotide-Exchange Factor) resident, lligada a la cromatina, que catalitza el bescanvi de nucleòtids, GDP per GTP. Igualment al citoplasma hi ha la proteïna reguladora Ran-GAP (GTPase-Accelerating Protein) resident, que catalitza la hidròlisi del GTP. Hom diu que aquests gradients de concentració afavoreixen la importació i la exportació dels substrats corresponents.
Importació nuclear. Receptors d’importació.
Proteïna Ran
Mecanisme d’importació nuclear de proteïnes
“càrrega”. En el citoplasma, una importina lliure
s’uneix a l’NLS d’una proteïna càrrega formant
un complex de càrrega bimolecular. El complex
difon a través del NPC interactuant amb
successives FG-Nups. En el nucleoplasma, la
interacció de la Ran.GTP amb la importina dona
lloc a un canvi conformacional que mena a la
disminució de la seva afinitat amb l’NLS,
alliberant-se la càrrega. Per a iniciar un altre
cicle d’importació, el complex importina-
Ran.GTP és retornat cap al citoplasma. Una
GAP associada als filaments del NPC estimula
l’hidròlisi del GTP unit a la Ran. Això genera un
canvi conformacional causant la dissociació de
l’importina, la qual pot iniciar un altre cicle
d’importació. La Ran.GDP retorna cap al
nucleoplasma, i una GEF situada en el
nucleoplasma bescanvia el GDP pel GTP de la
Ran.
LODISH et al. 6ª Ed. 2008
Exportació de l’RNAm,
independent de Ran
Un cop acabat el processament de
l’RNAm en el nucli, l’àcid nucleic
romana associat a unes hnRNP
(heterogeneous nuclear
RiboNucleoProteins) específiques,
formant el complex d’ mRNP
(messenger RiboNuclear Protein
complex). El principal transportador
d’aquest complex és un heterodímer
Tap/Nxt1 que s’anomena exportador
del mRNP. Aquest exportador s’associa
als components nuclears del porus, fent
interactuar l’mRNP amb les Nups del
canal central. Possiblement, una
helicasa d’RNA localitzada en els
filaments del porus, la Dbp5, amb
consum d’ATP, subministra la força
propulsora necessària pel moviment de
l’mRNP a través del porus. Tap, Nxt1 i
Dbp5 es reimporten de bell nou cap al
nucli per a iniciar un altre cicle
d’exportació.
LODISH, et al. 6nª Ed. 2008
Seminari : Exportació de l’RNA i
hnRNP
L’RNA export factor (REF) és un
component del complex de la juntura
exó-exó, que s’uneix als primers 20
nucleòtids en direcció 5’ de cada exó.
A més tota una colla de hnRNPs
(heterogeneous nuclear
RiboNucleoProteins) s’associen a
l’ARNm a exportar (quadrats i ovals).
Durant la exportació un grup de
hnRNPs romanen en el nucleoplasma
(quadrats) i un altre grup (ovals)
romanen unides a l’ARNm durant la
exportació i es dissocien de l’ARN
quedant solubles en el citoplasma.
Aquestes hnRNPs s’importen cap al
nucli amb unes senyals d’importació
diferents a les NLS clàssiques.
LODISH, et al. 6ªEd, 2008
Seminari
Part de les hnRNPs retornen al nucli gràcies a una senyal d’importació, la M9, de 38 aminoàcids carboxiterminals, diferent a les NLS clàssiques. Per a estudiar les característiques d’aquest transport, Pollard i col. (Cell, 86:985-994, 1996) fan servir el següent model experimental: cèl·lules en cultiu permeabilitzades amb digitonina, lisats de reticulòcits de conill i ATP. Suplementen el cultiu amb les proteïnes següents: A: GST (glutatio-S-trasferasa). B: GST-T-NLS (quimera formada per GST i la seqüència NLS, seqüència de localització nuclear- de l’antigen T del virus SV40). C: GST-M9 (quimera formada per GST i la seqüència M9 de l’hnRNP-A1). D: GST-M9-G274A (quimera formada per GST i la seqüència M9 de l’hnRNP-A1 mutada en el residu 274 G->A. Els resultats queden recollits en la Figura 1 on les imatges s’han obtingut per microscòpia d’immunofluorescència detectades amb anticossos contra la GST.
Si fem l’experiment el resultat del qual és el panell C de la figura 1 i hi afegim: res (-), o un excés de 50 vegades per sobre del GST- M9 de la proteïna NPc-M9 (quimera formada per la nucleoplasmina sense NLS a la qual s’hi ha afegit la seqüència M9), o un excés de 50 vegades per sobre la GST-M9 de la proteïna NPc-bpNLS (quimera formada per nucleoplasmina sense NLS a la qual s’hi afegit la seqüència NLS de l’hnRNP-K), obtenim els resultats de la Figura 2.
Figura 1
Figura 2
1. Per que creus que fan servir cèl·lules
permeabilitades amb digitonina?. 2. Que en
podeu dir respecte a la funcionalitat de les
seqüències NLS i M9 a partir dels resultats de
la figura 1? 3. A partir de la Figura 2, hom
pot deduir alguna cosa de la ruta que fan
servir les proteïnes amb les senyals M9 o NLS
per tal d’entrar al nucli?
Qüestions sessió 4.
- Pel que fa a les nucleoporines, proteïnes del complex del porus nuclear, assenyaleu la opció falsa
a) un terç de les nucleoporines presenta seqüències repetitives fenilalanina-glicina (FG) b) tres nucleoporines són proteïnes de la membrana del porus nuclear c) hi ha nucleoporines específiques de la cara citoplasmàtica i específiques de la cara nucleoplasmàtica del complex del porus d) les nucleoporines del canal no presenten seqüències FG
- La proteïna Ran-GTPasa s’implica en el transport nucli-citoplasma i esta regulada per dues proteïnes, la Ran-GAP i la Ran-GEF, la situació de les quals és
a) la Ran-GAP esta ancorada en els filaments citoplasmàtics del complex del porus i la Ran-GEF està ancorada a la cromatina
b) la Ran-GAP esta ancorada a la cromatina i la Ran-GEF esta ancorada als filaments citoplasmàtics del complex del porus
c) les dues proteïnes són solubles i entren i surten juntament amb la Ran
d) les dues proteïnes són integrals de la membrana de l’embolcall nuclear
- Dbp5 és una ATP-asa que intervé en la exportació de l’ARN la situació de la qual és
a) sempre esta en el nucleoplasma ancorada a la cromatina b) sempre esta en el citoplasma ancorada als filaments citoplasmàtics del complex del porus c) s’exporta del nucli juntament amb l’ARN i llavors es reimporta cap al nucli d) s’uneix a l’ARN però es dissocia quan l’ARN s’exporta i roman permanentment en el nucli
