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TEMA 5: AMINOÁCIDOS Y
ENLACE PEPTÍDICO
5.1. AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos son biomoléculas se construyen en torno a un carbono que está unido a cuatro sustituyentes diferentes: un grupo carboxilo, un grupo amino, un hidrógeno y un radical distinto -R, que sirve para clasificarlos. Debido a la presencia de este carbono asimétrico, llamado carbono α, son moléculas con actividad óptica, aunque sólo son proteinógenos los de la serie L. El hecho de que existan grupos carboxilo y amino sobre el carbono α convierte a los aminoácidos en anfóteros, sustancias cuya carga depende del pH del medio. Así, además de la naturaleza del radical -R, este hecho permite clasificar los 20 aminoácidos codificados genéticamente (si bien en las proteínas puede aparecer un número mayor de éstos, debido a su posterior alteración). AMINOÁCIDOS
Aminoácidos apolares alifáticos: glicina (Gly, G), alanina (Ala, A), valina (Val, V), leucina (Leu, L), isoleucina (Ile, I) y metionina (Met, M). Aminoácidos aromáticos: fenilalanina (Phe, F), tirosina (Tyr, Y) y triptófano (Trp, W). Aminoácidos polares sin carga: serina (Ser, S), treonina (Thr, T), cisteína (Cys, C), prolina (Pro, P), asparragina (Asn, N) y glutamina (Gln, Q). Aminoácidos cargados positivamente a pH fisiológico: lisina (Lys, K), arginina (Arg, R) e histidina (His, H). Aminoácidos cargados negativamente a pH fisiológico: ácido aspártico (Asp, D) y ácido glutámico (Glu, E). A pesar de tener radicales distintos, los aminoácidos pueden agruparse así en función de muchas características físicas y químicas comunes. Por ello, la estructura primaria de una misma proteína puede variar mucho de unas especies a otras, manteniendo únicamente el balance entre aminoácidos apolares y polares, el número de cargas... para que se pliegue de la misma manera en el espacio. Aunque la función fundamental de todos estos aminoácidos es la síntesis de proteínas, también pueden comportarse como neurotransmisores, hormonas o como sustrato metabólico para producir energía. Sin embargo, esto último lleva implícita la necesidad de excretar el grupo amonio, muy tóxico para el organismo.
5.2. PUNTO ISOELÉCTRICO
Al ir variando con el pH, es posible calcular en qué valor de la escala la carga de un determinado aminoácido es nula, lo que se conoce como punto isoeléctrico. Normalmente, durante el transcurso de una valoración con una base fuerte, el primer grupo que pierde su protón es el carboxilo del carbono α y, a continuación, lo hace el grupo amino de este mismo carbono.
Formación de bases de Schiff: las bases de Schiff son intermediarios del metabolismo de los aminoácidos, formados por la reacción de su grupo amino con un aldehído. Descarboxilación o desaminación con ninhidrina: esta reacción sirve para la identificación de aminoácidos, de manera que la solución se vuelve de color púrpura. Sin embargo, no tiene el mismo efecto con la prolina, técnicamente un iminoácido, pues adquiere un tono amarillento. Formación de enlaces disulfuro: se trata de la interacción covalente más relevante que mantiene las estructuras más superiores de las proteínas, de manera que se forma un puente con dos átomos de azufre de los radicales de dos cisteínas. El proceso de formación está catalizado por una enzima del retículo endoplásmico, la PDI (protein disulfuro isomerasa). Esta misma enzima, cuando se combina con el compuesto β-mercaptoetanol, también es capaz de romper estos enlaces. Reacción de Ellman: el puente disulfuro que contiene la molécula de DTNB (ácido 5,5’- ditiobisnitrobenzoico) se rompe al reaccionar con los grupos tioles de las cisteínas no implicadas en los propios enlaces disulfuro de la proteína, liberándose un mol de DTNB por cada mol de cisteína reactiva. Así, junto con la PDI y el β-mercaptoetanol, se puede conocer cuántas cisteínas contiene una determinada macromolécula.
5.4. ENLACE PEPTÍDICO
El enlace peptídico, un enlace de tipo amida muy dirigido y que conlleva la pérdida de una molécula de agua, es el encargado de unir dos aminoácidos para formar un dipéptido. La disposición de las moléculas al formar el enlace peptídico hace que siempre reaccione el grupo carboxilo del primer aminoácido con el grupo amino del segundo, de manera que todas las cadenas polipéptidicas incorporan nuevos monómeros por su extremo C-terminal. Las diferencias de electronegatividades hacen que sobre el oxígeno del grupo carboxilo aparezca una carga parcial negativa y, sobre el hidrógeno del grupo amino, una positiva; un hecho importante de cara a la formación de puentes de hidrógeno.
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Así pues, las proteínas comparten un mismo esqueleto de la forma N-C-C-N-C-C-N-C-C-N- C-C-... que, a pesar de tener únicamente enlaces simples, no es nada flexible. Además, al unirse los aminoácidos, aparecen dos enlaces cuyas longitudes son diferentes a lo esperado: el enlace C-N es más corto de lo normal y el C=O, algo más largo. Esto se debe a que el enlace peptídico es una estructura resonante con enlaces que tienen un orden algo mayor que 1 pero menor que 2, y que no permiten el giro de los átomos a su alrededor, sino sólo en torno al carbono α de cada residuo. Por este motivo, los cuatro átomos implicados en el enlace peptídico (C, O, N e H) permanecen siempre en un mismo plano, con la posibilidad de que aparezca una isomería geométrica, o de tipo cis-trans. Cuando se sintetizan proteínas, inicialmente siempre lo hacen en forma trans, de forma que los radicales de cada residuo se van alternando. Más tarde, la enzima PPI (peptidil prolil cis-trans isomerasa) puede transformar los enlaces en los que interviene la prolina hasta adoptar una configuración cis. Si bien la estructura primaria de las proteínas permite el giro de los átomos en torno a los carbonos α, existen unas ciertas posiciones que los planos de los enlaces peptídicos no pueden adoptar, pues colisionarían los unos con los otros. Las posiciones posibles se definen por los distintos valores de los ángulos Φ y Ψ, representados en el diagrama de Ramachandran. Los escasos ángulos permitidos de este diagrama revelan básicamente tres conformaciones secundarias posibles: las α-hélices con giro a derechas, las α-hélices con giro a izquierdas (que no aparecen en proteínas) y las láminas β. Generalmente, los distintos radicales de los aminoácidos no influyen en los ángulos Φ y Ψ, ni siquiera los que son muy voluminosos en los aromáticos, pues cuentan con carbonos β espaciadores, en forma de grupos CH 2. Sin embargo, este grupo no aparece en los radicales de algunos aminoácidos como la treonina o la isoleucina, y se reduce aún más el espacio conformacional permitido. !"#$%&'(&()+,%-'.'/01,+-'1&2-"$"%,$'&")1&'3'&2)14%)41$2'&#&%)15",%$2'&6)1&7$ Consecuencias. !2'(-#$18'&2)9 &"'4"'(#$"-':'&2)9 &2)$0,#,;$+-' (-1'1&2-"$"%,$'<,2-7&1*$' cis-trans =
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El extremo amino terminal de cada péptido reacciona con el PITC hasta que se rompe el primer enlace peptídico por reordenación de los electrones y se libera un derivado de la tiazolinona diferente para cada aminoácido, que se puede identificar por cromatografía. Lavando la proteína y volviendo a repetir el protocolo con más PITC para obtener las distintas tiazolinonas y secuenciar todos los polipéptidos. Esta técnica también pasó a estar obsoleta con el desarrollo de la espectrometría de masas, especialmente la llamada MALDI-TOF ( Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time-Of-Flight ). El inicio del análisis requiere también de la fragmentación de la proteína en varios péptidos por acción de la tripsina, que se cargan por un pulso de láser. Al quedar cargados, se pueden hacer volar hacia un detector que relaciona su tiempo de llegada con su masa. El conjunto de masas registradas por el detector compone la huella peptídica de la proteína y, al comparar ésta con la base estadística informatizada de todo el conjunto de proteínas conocidas a partir de la secuencia del genoma, puede determinarse cuál es la secuencia de aminoácidos original. Existen algunas variantes de la técnica del MALDI-TOF, como es la ESI-MS ( Electrospray Ionization Mass Spectrometry ), donde la mezcla líquida de polipéptidos se hace pasar por una aguja electrificante, transformándose en una mezcla de gases ionizados y haciéndose volar hacia el detector. Además, es posible acoplar dos espectrómetros en serie, en la llamada MS-MS, de forma que se consigue que al detector llegue un mayor número de polipéptidos más pequeños, haciendo más improbable un error al comparar con la base estadística.
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5.7. SÍNTESIS ARTIFICIAL Y RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS
En la actualidad, el método más eficaz para obtener grandes cantidades de una determinada proteína ocurre a través de microorganismos. En el genoma de una bacteria se incorpora el gen que codifica para la proteína deseada, y la propia célula se encarga de utilizar su maquinaria traduccional para sintetizarla. También existen formas artificiales de sintetizar una cadena polipeptídica en el laboratorio, siguiendo únicamente métodos químicos. Esta síntesis artificial se lleva a cabo en sentido contrario al que seguiría un ribosoma en la célula, uniendo el grupo amino del aminoácido C-terminal con el carboxilo del penúltimo, y así sucesivamente. Para evitar que se produzcan reacciones no deseadas entre otros grupos, el grupo carboxilo del aminoácido C-terminal se bloquea con una partícula de resina sólida insoluble, dejando su grupo amino libre para poder formar el primer enlace peptídico. Cuando se incorpora el penúltimo aminoácido de la cadena, éste debe llevar bloqueado su grupo amino con un compuesto llamado Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonil), para que sólo sea reactivo su grupo ácido. El enlace peptídico se establece entonces entre estos dos aminóacidos gracias a la acción de la DCC (diciclohexilcarbodiimida), una molécula que recoge la molécula de agua liberada y se transforma en diciclohexilurea. Si la síntesis del péptido debe continuar, el grupo Fmoc del grupo amino terminal se libera y se permite la entrada de un nuevo aminoácido de la misma manera. Esta técnica permite formar no proteínas completas, sino oligopéptidos de unos 10 ó 12 residuos. Este fragmento proteico es suficiente para funcionar como antígeno y producir una respuesta inmunitaria específica al ser inoculada en un animal de laboratorio. Gracias a esto, al extraer el suero del animal se obtienen inmunoglobulinas que son específicas contra la proteína que a estudiar, un primer paso esencial de cara al reconocimiento y el marcaje de proteínas en las células.
