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TEMA 0: Unitats i eines matemàtiques.
1. Unitats
1.1 Sistemes unitats: Estan basats en un conjunt d’unitats fonamentals (o bàsiques), on s’estableixen amb precisió el nom, el símbol i la definició. Es defineix una unitat per a cada quantitat física. Conjugant aquestes unitats fonamentals es defineixen a partir d’equacions simples el conjunt de unitats derivades.
Existeixen diversos sistemes d’unitats diferents, on predomina el SI (Sistema Internacional), tot i que no ha desplaçat els altres sistemes:
1.2 Unitats fonamentals per als diferents sistemes d’unitats:
Longitud Massa Temps Intensitat corrent elèctric
Temp. Intensitat lumínica
Quantitat substància
SI
(Internacional)
m Kg s A K Cd (Candela)
Mol
Cgs (Cegesimal)
cm g s ºC
MKS
(tècnic)
m Kg s ºC
FPS
(Anglosaxó)
ft lb s ºF
1.3 Unitats derivades: Són aquelles unitats referents a altres qualitats, que es dedueixen a partir de les unitats fonamentals (velocitat, força,...)
Velocitat = dL/dt = [m/s]
Força = M · a = Kg · m /s 2 = 1N
1.4 Coherència d’unitats: Al aplicar valors numèrics a la resolució d’equacions matemàtiques, és necessari que tots els paràmetres que formen part de l’equació, estiguin expressats en el mateix sistema d’ unitats: coherència d’unitats.
Per convertir un valor d’una magnitud d’un sistema d’unitats a un altre, s’utilitza els factors de conversió ; aquests donen l’equivalència entre unitats d’una mateixa magnitud entre dos sistemes d’unitats diferents.
Exemple:
Per tant F 0 6 D= 1[Kg / m s] = 1000 Cp
2. Ajust d’una recta per mínims quadrats. A partir d’una sèrie de punts discrets, que descriuen una recta, l’ajust d’una recta per mínims quadrats consisteix en un mètode matemàtic per a trobar l’equació de la recta, la qual la suma de distàncies entre els punts i la recta al quadrat, sigui mínim. Disposant dels punts de partida,
X 1 X 2 X 3 X 4 X 5
Y 1 Y 2 Y 3 Y 4 Y 5
Definim els errors, la distància entre els punts i la recta d’equació Y= aX + b,
F 0 6 5 1 = Y 1 – (aX 1 + b)
F 0 6 5 2 = Y 2 – (aX 2 + b)
F 0 6 5n = Y (^) n – (aX (^) n + b)
Així doncs els paràmetres que defineixen la recta seran aquells que compleixin que,
F 0 4 4=F 0 6 5 12 +F 0 6 5 22 +F 0 6 5 32 + ...+F 0 6 5n^2 =F 0 5 3F 0 6 5i^2 sigui mínim, per tant dF 0 4 4/da = 0 i dF 0 4 4/db = 0.
3. Linealitzacions. Serveixen per a trobar paràmetres de models o d’equacions no lineals, a partir de les dades experimentals recollides en laboratori, de manera senzilla, aplicant una regressió lineal a les variables transformades, de l’equació linealitzada.
Hi ha diversos tipus de linealització, depenent el tipus d’equació inicial:
3.1 Linealitzacions directes:
Equació recta Y = A + b ·x
Y= a + b · 1/x Y = A + b ·1/x
Aplicant logaritmes Y = a · x b^ Log y = Log a + b ·Log x
Y = a · b x^ Log y = Log a +Log b ·x
Y = a · exp (b·x) Ln y = Ln a + b ·x
3.2 Altres Linealitzacions: Aplicant la inversa
Realitzem la inversa Simplificant i ordenant
4. Diferenciació de funcions. Si es coneix l’expressió analítica d’una funció f(x), la diferenciació no sol presentar problemes, i es procedeix a realitzar-la analíticament.
Si només es disposa de punts discrets, en forma d’una taula de parell de valors (x,y), s’ha de seguir el següent procediment per a obtenir la diferenciació.
a) Tabular x i i y i.
b) Per a cada interval calcular els increments de la variable independent i la depenent.
F 0 4 4xn = x (^) n - xn-1 i F 0 4 4yn = y (^) n - y (^) n-
c) Generar els nous punts de la funció derivada, assignant al valor del punt mig de l’interval de la
variable independent ( x (^) n = (xn - xn-1)/2 ), el quocient dels increments de les dues variables dy/dx = F 0 4 4yn /F 0 4 4xn. Així es defineix la taula de valors de la funció derivada.
X (xn = (xn - x (^) n-1 )/2) (^) dy/dx =F 0 4 4y (^) n /F 0 4 4x (^) n
d) Si es representa la gràficament la taula de valors anterior, s’obté la representació aproximada de la
funció derivada (de manera contínua), a partir d’una sèrie de punts discrets de les variables de la funció original.
Si el biorreactor es pequeño habrá poco volumen de sustrato (menos volumen del medio) siendo éste caso muy caro. A la vez esto implicará que no necesitamos mucho personal en la operación por lo que si concentramos mucho nuestro producto cuando lleguemos al proceso de purificación no será necesario concentrar tanto ya que la purificación es más fácil puesto que nos ahorramos pasos.
Los factores que determinan el coste de este proceso son:
• Investigación y desarrollo.
• Material del proceso de partida: es necesario maximizar la conversión del sustrato y el rendimiento del
producto.
• Operación con el biorreactor: Debemos maximizar la productividad volumétrica y por tanto bajar el
tamaño del reactor. Dentro del reactor hay catalizadores (autorreactivos o no) y si lo que queremos obtener es mucho producto nos será necesario mucho catalizador; si maximizamos el catalizador aumentaremos la productividad volumétrica.
También podemos maximizar la productividad específica extrayendo genes de células animales que nos interese e introducirlos en bacterias que se replican mucho más rápido (hecho que permitirá catalizar más sustrato por unidad de tiempo). Otra forma de definir la productividad volumétrica es:
Donde: x = Catalizador
1.1 Aspectos de diseño de un biorreactor:
1. Leyes de conservación: Estas leyes se aplican a la materia, la energía y la cantidad de movimiento (masa / velocidad) aunque nosotros sólo nos centraremos en las 2 primeras. Todas ellas serán magnitudes conservadas puesto que no trabajaremos con reacciones nucleares, y por tanto, la masa y la energía se conservarán. Las leyes de conservación nos indican cuál es la magnitud global de los cambios. 2. Leyes cinéticas: Es necesario saber, además de la cantidad, la velocidad a la que debemos introducir las sustancias sabiendo, por tanto, sus velocidades de cambio físico y biológico así como las leyes cinéticas y biológicas. 3. Restricciones: Nos indican aquello no podemos hacer como restricciones termodinámicas pudiendo ser el caso de llegar al punto de equilibrio donde la reacción ya no puede avanzar porque no es favorable; se retiran pues los productos y esto permite avanzar (desplazamos el equilibrio retirando el producto). También hayamos restricciones de legislación relacionadas con la materia ya que es necesario limpiar los biorreactores y para ello es necesario construir plantas depuradoras. Sin duda también nos restringen aspectos económicos, físicos… 2. Reactores continuos y discontinuos. A partir de los 3 puntos anteriores debe salir un modelo matemático que describa perfectamente el sistema; es esto mismo lo que permitirá hacer el análisis y el diseño del biorreactor. La estrategia de operación también es importante y por ello es necesario definirla además de la forma de la operación. Ambas determinan el diseño del reactor y los objetivos mascados; volumen y tiempo si nuestro biorreactor trabaja en discontinuo y volumen y caudal si el biorreactor es continuo o semicontinuo. Éstos serán los datos a encontrar. Debemos diferenciar pues entre los procesos continuos y discontinuos: 2.1 Reactores discontinuos: Mide cómo evolucionan las variables temporalmente; consideremos que existe un sustrato limitante y veamos cómo evoluciona juntamente con el producto y el catalizador. De esta forma las variables evolucionan con el tiempo. El sustrato disminuye mientras avanza el tiempo aumentando así el producto y el catalizador.
2.2 Reactores continuos:
2.2.1 Recatores de tanque agitado (no varían):
Los que nosotros diseñaremos se hallará en el estado estacionario diferenciando 2 etapas; la fase avanzada (variables que varían con el tiempo) y la fase estacionaria (todas las variables se mantienen constantes a los largo del tiempo). Este tipo de proceso se da en un reactor continuo de tanque agitado. En este caso un RCTA. Las variables toman el mismo valor independientemente de la posición que ocupen dentro del reactor.
2.2.2 Reactores de flujo de pistón (varían con la distancia): En ocasiones encontramos procesos continuos donde las variables toman valores diferentes aún estando en el estado estacionario en función de la posición dentro del biorreactor como son los reactores de flujo de pistón RFP donde el flujo es laminar y no se mezcla. Bajo estas condiciones ponemos mucho sustrato al inicio pudiendo ver cómo las variables cambian con la distancia; el sustrato que era máximo en la entrada es mínimo en la salida. Mientras que el producto y el catalizador (u organismo) les pasa todo lo contrario. Es necesario decir que las variables no cambian con el tiempo porque nos hallamos en estado estacionario pero sí en cambio en función de la distancia.
2.3 Descripción de los sistemas:
• Nivel atómico y/o molecular: No se usa puesto que consideramos la materia discontinua y esto es
muy complicado.
• Nivel microscópico: Contempla la descripción del sistema utilizando las 3 variables espaciales (x, y, z)
y la temporal (t). Todo sistema heterogéneo se describe a través de un sistema de coordenadas; el sistema se describe en función de la posición que las variables ocupan a lo largo del tiempo.
• Nivel macroscópico: Considera que existe un valor único de la variable en el sistema (v, t) gracias a
que agitamos y esto permite que el valor sea el mismo en todo el sistema. Para pasar de un sistema microscópico a uno macroscópico lo que se hace es elaborar una función que represente los datos microscópicos e integrarla, en cambio, si queremos pasar de macroscópico a microscópico derivaremos los datos macroscópicos.
3. Principales tipos de biorreactores. Al realizar un balance estamos obteniendo información sobre la cantidad de variación de la variable que estamos estudiando, en nuestro caso la materia, una magnitud que consideramos se conserva.
Tenemos un elemento en el espacio que evoluciona con el paso del tiempo y una propiedad (masa) que puede traspasar las fronteras del sistema. Las unidades de masa pueden ser másicas o molares aunque preferiblemente usaremos las molares ya que si hablamos en unidades másicas sólo nos podremos referir a la entrada y la salida, no a la generación ni a la acumulación porque ya se ha comentado que la materia se conserva. Por lo tanto; con unidades de masa no podemos hablar de G ni A, en cambio, si usamos unidades molares sí.
De esta forma hablaremos de caudales molares (moles/s) y usando unidades molares veremos que dentro del sistema hay variaciones y/o transformaciones que provocarán una generación y por tanto acumulaciones F 0 E 0 Existe una variación de la propiedad (materia) a lo largo del tiempo. El balance de materia será el siguiente: F 0 E 0
A partir de esto podemos encontrar 3 situaciones extremas a partir de las cuales elaboraremos los siguientes reactores:
3.1 Reactores discontinuos de tanque agitado (RDTA): Las variables evolucionarán a lo largo del tiempo desde el punto inicial al tratarse de un reactor discontinuo. El modelo que utilizaremos será el macroscópico porque el valor de la variable será el mismo a lo largo de todo el reactor ya que está perfectamente agitado. En este caso las variables que debemos definir son el volumen y el tiempo , es un reactor ideal.
3.2 Reactores continuos de tanque agitado (RCTA): También está perfectamente agitado, hecho que implica que se trata de un biorreactor ideal y como consecuencia el modelo que aplicaremos será el macroscópico. Nos hallamos en el estado estacionario así que una vez iniciado el proceso no será necesario encenderlo otra vez.
Como entra y sale materia es necesario tener muy en cuenta que la S no se sea más grande que la E ya que de lo contrario se vaciaría el depósito y al revés se derramaría. Por lo tanto es necesario que E = S y mantener el estado estacionario. Las variables a definir en este reactor son el volumen y el caudal.
El término de generación, como está perfectamente agitado, consideraremos rj igual en todo el reactor:
F 0 E 0 F 0 E 0
Como que Q es el mismo en E como en S (ya que si el caudal variara no estaríamos en estado estacionario) tendremos que:
F 0 E 0 F 0 E 0
Donde: Z = tiempo de residencia (s) Cj = concentración final (moles/s) Cj0 = concentración inicial (moles/s) rj = velocidad de reacción (moles/s·L) V = volumen del reactor (L) Q = caudal (L/s)
(Z) es el tiempo de residencia y es el tiempo que tardamos en procesar un volumen igual al volumen del reactor (V). El volumen del reactor es directamente proporcional a la concentración (Cj) de lo que le pedimos al reactor e inversamente proporcional a la velocidad de reacción (ri) ya que cuanto más rápido se produzcan los microorganismos menor será el volumen que necesitaremos en el biorreactor.
Velocidad de reacción comparativa (rj):
En este caso (rj) depende de los que pasa en el reactor y por tanto tomará valores diferentes por lo que no puede salir de la integral.
En este caso (rj) corresponde al estado estacionario, a la concentración de sustrato en la salida. Esto quiere decir que no variará porque tiene un único valor (el que corresponde con las condiciones que hemos fijado). La (rj) en un reactor continuo es única porque trabajamos en un único punto; aquel donde la [] de sustrato permite trabajar a una velocidad más elevada.
El reactor discontinuo, por tanto no es bueno cuando tiene lugar una inhibición de sustrato, por lo que se recomienda utilizar el RCTA. Esto ocurre porque el RDTA nos impone la limitación de no poder superar una concentración de sustrato concreta y por tanto no podemos obtener más biomasa de la que nos permite esta concentraciónF 0 E 0sería necesario pues aumentar el volumen del reactor. En cambio, en un RCTA sí que podríamos trabajar a concentraciones de sustrato elevadas porque entramos una elevada cantidad de sustrato y los microorganismos de dentro del biorreactor (que hay muchos) actúan sobre el sustrato reduciéndolo.
Para acabar, la velocidad de reacción (rj) no tiene el mismo significado físico en un RDTA que en uno continuo, de esta forma:
RDTA: RCTA:
4.3 Reactor coninuo de fujo de pistón (RCFP): En este reactor el flujo no genera mezcla, avanza de forma laminar haciendo que las variables se modifiquen en función de la posición. El balance en este reactor se hace a partir de un elemento diferencial, si quisiéramos saber el balance en todo el reactor sería necesario integrar la suma de los resultados obtenidos. Balance del elemento j en el estado estacionario:
F 0 E 0
Como es un reactor continuo éste no tendrá A (acumulación) por lo que es necesario realizar un cambio de variables de n (mol/s) por caudal (L/s) y concentración (mol/L):
F 0 E 0
Consideramos que rj es la misma en cada elemento diferencial.
F 0 E 0
En este reactor debemos determinar el volumen porque el caudal lo fijaremos nosotros, además, observamos que en la ecuación aparece una integral debido a que en cada elemento diferencial (rj) dependerá de las condiciones de la concentración, del catalizador… y por tanto variará en cada elemento diferencial.
El volumen de nuestro reactor (variable que queremos determinar) dependerá de la concentración; cuanto mayor sea la concentración mayor deberá ser el volumen del reactor junto con la (rj) puesto que bajo (rj) elevadas el volumen se reduce.
4.3.1 Experimento discontinuo para averiguar rj: La velocidad de reacción (rj) dependerá del sistema experimental que hagamos servir por lo que es necesario saber cómo es la cinética de nuestro proceso. Para averiguarla podemos realizar experimentos discontinuos donde mediremos cómo varían las variables en función del tiempo gráficamente a partir de una tabla obtenida a partir de las diferentes concentraciones, por lo que:
4.3.2 Experimento continuo para averiguar rj: Pero podemos hallar otra manera de averiguar la cinética del proceso y es mucho más precisa. Consiste en realizar un experimento en continuo (ya que el los discontinuos, a elevadas [] de sustrato, pierden precisión de la medida). Si trabajamos en continuo estaremos en un estado estacionario en el que a cada estado estacionario le corresponderá una (rj) que se mantendrá cte pero como los diferentes estados estacionarios tendrán diferentes [] la (rj) entre ellos variará.
Se trata de un método más preciso porque podemos mantener el estado estacionario durante mucho tiempo de tal manera que como el sistema se mantiene bajo estas condiciones indefinidamente si medimos erróneamente no pasa nada porque podremos volver a tomar más muestras. En cambio, en un experimento discontinuo, como la [] varía con el tiempo si la medida es errónea ésta no la podremos repetir. Aunque el experimento discontinuo ofrece una ventaja; es más rápido ya que en un sólo experimento podremos obtener todas las (rj) que nos hagan falta pero perdiendo precisión en las medidas elevadas.
En un experimento continuo tendremos diferentes condiciones que mantendremos por lo que tardaremos en realizarlo y será necesario tanto tiempo como estados estacionarios. Cabe decir que para asegurarnos de que nos hallamos en el estado estacionario es necesario hacer pasar 5 tiempos de residencia (Z) para que si el microorganismos tiene un tiempo de generación muy elevado deberemos esperar mucho tiempo para realizar el experimento por lo que es necesario que el tiempo al que trabajemos sea superior que el tiempo de generación del microorganismo:
Podemos modelar los datos cinéticos gráficamente representando la inversa de (rj) respecto a la concentración de sustrato. Si representamos el caso de una enzima que no se desactiva de ninguna manera, es decir, que se mantiene cte su [] a lo largo del proceso, veremos que para elevadas [] de sustrato la velocidad de reacción (rj) será pequeña (ya que la inversa tiene valores grandes). De esta forma podemos afirmar que existe una inhibición por sustrato.
Además observaremos también que el área comprendida bajo la curva entre Cj y Cj0 se corresponde con el tiempo de operación del RDTA pero
TEMA 2: Cinética enzimática.
1. Cinética de reacciones con un único sustrato. Es importante determinar la cinética de una reacción y conceptualizar así el reactor que utilizaremos. Es necesario, por tanto, escoger la enzima adecuada ya que muchas de éstas tienen elevadas especifidades a tener en cuenta ya que trabajamos a una velocidad rápida (podemos estar analizando algo que ha pasado hace rato). Por lo que se recomienda trabajar bajo condiciones suaves porque las enzimas son inestables y sensibles al estrés térmico, pH y físico.
Para saber qué enzima es la más adecuada es necesario observar su cinética, es decir, realizar un experimento en el que veamos cómo evoluciona la [] del sustrato y el producto con el paso del tiempo. Por lo que llevaremos a cabo un experimento en discontinuo. Al realizar una gráfica a partir de estos datos no veremos la cinética de nuestra enzima, para saberla, partiendo de estos datos, necesitaremos encontrar (rj) y ver cómo varía ésta con el sustrato; se debe realizar pues una tabla y a partir de ésta realizar una nueva gráfica.
Representamos la [] de sustrato respecto a (rj) y es partir de esta gráfica que obtendremos el modelo cinético que se incluirá dentro de la ecuación de diseño del reactor.
t S P ΔS ΔS/ t t t …
S
S
P
P
rj rj …
Este proceso se realiza con las diferentes enzimas de las cuales disponemos. A partir de esta última gráfica veremos cuándo la enzima llega a su máxima velocidad (es decir, a qué [] de sustrato) y a partir de este punto, por mucho más sustrato que pongamos esta velocidad no se verá afectada
(ni de forma positiva ni negativa). Cuando dividimos Vmáx / 2 obtenemos otro parámetro importante; (KM), que nos indica la afinidad de nuestra enzima por el sustrato.
En general, la mejor encima será aquella que tenga la Vmáx más grande y KM más pequeña. Se debe tener cuidado porque cuanto más pequeña sea KM más afinidad habrá por el sustrato y por tanto más rápidamente llegaremos a Vmáx. Pero a la vez esto implica menos capacidad de regulación de la enzima, por eso se recomienda escoger enzimas de elevada Vmáx pero no necesariamente de KM pequeñas ya que de esta forma obtenemos un margen de control. Si partimos de una enzima que sigue el modelo de Michaelis-Mendel:
Donde: β = número de moles
1.1 Hipótesis:
1. La enzima que utilizamos en el experimento es cte (E0) y es igual a la enzima que se encuentra libre
más lo que está formando el complejo: E0 = E + ES
2. Suponemos que la [sustrato] >>> [E0] y que S = S + ES + (1/ β) · P.
3. El producto no inhibe.
4. Las K son cte’s cinéticas (de velocidad) y es necesario diferenciarlas
de las cte’s de equilibrio que nos indican cómo se distribuye el sustrato y el producto en la reacción. Cada K es intrínseca de la reacción y en este caso K2 controla toda la reacción porque conduce a un paso no reversible pero aún en el caso que sea reversible pasa a una velocidad tan lenta que puede ser despreciada.
A partir de estas suposiciones obtenemos cómo varía la velocidad de desaparición del sustrato y la de aparición del producto:
A partir de una serie de experimentos discontinuos obtendremos la anterior gráfica donde se observa el comportamiento del sustrato, la enzima, el producto y el paso del tiempo. Si planteamos los balances de materia para cada uno de ellos y del complejo se debe tener en cuenta que E i S = 0 porque el experimento es en discontinuo por lo que A = G:
Balance materia de la enzima: Balance materia del sustrato:
Balance materia del complejo: Balance materia del producto:
Viendo el gráfico comprobamos que pese a trabajar en discontinuo la [ES] se mantienen cte, por lo que;
(KM) nos relaciona las constantes cinéticas pese a ser ésta una constante de equilibrio y por tanto, nos da idea de la relación que existe en el equilibrio entre el sustrato y los reactivos:
• Si KM ↑ quiere decir que el equilibrio de esta reacción aún posee mucha enzima y mucho sustrato para
reaccionar.
• Si KM ↓ significa que en el equilibrio casi toda la materia estará en forma de complejo; de esta forma
nos interesan enzimas con KM bajas.
Cabe decir que la mejor forma para ajustar la recta es a través de ajustes no lineales. Esto se hace usando una máquina a la que indicaremos que ajuste los puntos de los datos a una función logarítmica, exponencial, polinómica… estos ajustes son mucho más precisos que los ajustes lineales porque al linealizar hacemos inversas y eso magnifica más errores cometidos, es decir, es mejor hacer los experimentos en continuo y con ajustes no lineales.
2.1 Ajuste lineal para experimentos discontinuos: Encontramos otro método de ajuste lineal para experimentos discontinuos:
2.1 Ajuste lineal para experimentos continuos: Es el método de integración donde también se logra una recta donde se acumulan menos errores que al hacer la inversa, pero igualmente tiene errores porque representa variables frente las mismas variables. Si los datos son continuos también se puede utilizar un ajuste lineal:
3. Reacciones enzimáticas con inhibición. Cuando tiene lugar una inhibición en una reacción enzimática esta puede ser debida tanto a un inhibidor, como por un sustrato o por el producto. Aunque las inhibiciones pueden ser irreversibles no las estudiaremos y nos centraremos en las que si son reversibles.
3.1 Inhibición reversible por inhibidor:
3.1.1 Inhibición competitiva: El inhibidor se une a la enzima en el mismo lugar en que interacciona con el sustrato (el centro activo), de tal forma que tiene lugar una competencia entre las moléculas de sustrato y el inhibidor por unirse a la enzima.
Si hacemos la representación gráfica comparando la reacción con presencia y con ausencia del inhibidor, se observa como la rmáx es igual en ambos casos, mientras que el valor de K (^) M aumenta en la reacción en la que actúa el inhibidor.
Si se quiere mantener la cantidad de producto obtenido en el mismo tiempo se deberá aumentar la concentración del sustrato, además, se deberá hallar la ecuación cinética y los parámetros vmax, K (^) M y K (^) i, por lo que se linealiza, viendo como rmáx es constante mientras que KM varía y se habla entonces de KM aparentes:
Cálculo de la Ki y velocidad de reacción: La Ki indica como se distribuyen los reactivos y productos en la reacción de unión del inhibidor a la enzima, una Ki elevada significa que la enzima no se ve muy afectada por el inhibidor:
- Lo que se ve afectado es la KM
3.1.2 Inhibición no competitiva: La interacción del inhibidor con la enzima se hace en un centro diferente al entro activo, de tal forma que no impide la unión del sustrato y no hay competencia, es decir, el inhibidor se puede unir tanto si hay sustrato como si no.
En este caso si representamos el gráfico comparando la reacción con y
sin inhibidor veremos que cuanto más inhibidor se ponga menor será la rmax. Aunque KM se mantendrá cte.
Cálculo de la velocidad de reacción: Ante esta cinética, lo único que se puede hacer es aumentar la concentración de enzima siempre y cuando el inhibidor no venga con la enzima, lo que se verá afectado es la rmax.
3.. Inhibición anticompetitiva:
El inhibidor tan solo interacciona con la enzima cuando este está conjugado con el sustrato. En esta inhibición tanto KM como rmáx se ven afectadas por el inhibidor, el método o la solución más adecuada es buscar otro enzima que no presente este tipo de inhibición.
Si no se pudiera se tendría que esperar y no se dispone de tiempo, ya que se aumente lo que se aumente, la enzima siempre se encontrará inhibida. Otra solución sería purificar el inhibidor y quitarlo pero resulta muy caro.
3.2 Inhibición reversible por producto: La ecuación cinética para este tipo de inhibición viene determinada por:
Donde p* es la concentración de producto que hace que la velocidad de reacción sea 0.
Si representamos esta ecuación veremos que cuando hay poco sustrato casi no hay producto (al principio de la reacción) y por tanto p/p ≈ 0 F 0 E 0(1-p/p) ≈ 1** , haciendo que a bajas concentraciones de producto la cinética sea como un Michaelis-Menten.
Cuando se empieza a acumular producto nos aproximamos a la zona inhibitoria donde p = p*, lo que provoca que (1-1) n^ = 0 y como consecuencia que la velocidad de reacción también sea 0. El grado de curvatura de esta inhibición vendrá determinado por n.
¿Qué hacer ante una inhibición por producto? Se debería retirar el producto a medida que se vaya formando, logrando así mantener baja la concentración de producto.
Para poder determinar las cte’s cinéticas en una inhibición por producto diseñamos un experimento a elevadas [ ] de sustrato (obligatoriamente tendremos que utilizar un RCTA o un RCFP) ya que: Linealizamos
A elevadas concentraciones de sustrato S>>>KM, KM, por tanto, se puede despreciar.
Para poder encontrar los parámetros se habrá de convertir esta ecuación en una recta, de donde obtendremos el valor de rmáx y de n.
1. Para los puntos de la serie donde [S] es baja consideraremos [S] ≈ 0:
y = 7,1062x + 39,937 b = 39,937 = F 0 E 0 R^2 = 0,9993 a = 7,1062 = F 0 E 0
2. Para los puntos de la serie donde [S] es elevada consideraremos 1/S ≈ 0:
y = 48,161x + 41,727 b = 41,727 = F 0 E 0 R^2 = 0,991 a = 48,161 = F 0 E 0
4. Reacciones enzimáticas con sustratos múltiples. La mecánica de la reacción con sustratos múltiples puede presentar muchas formas, pero cabe decir que nosotros nos centraremos en el caso de dos sustratos:
Puede ser que la enzima acepte A y después B, o incluso ambos a la vez:
Si
Los valores de A y B los decidiremos nosotros en función de lo que queramos producir, por tanto, habrá que hallar Ka y Kb. Para averigur Ka (la constante de equilibrio donde se engancha el primer sustrato A) hemos de conseguir que sea A quien controle la reacción, que sea el reactivo limitante y que por tanto haya mucho de B:
F 0 E 0 Michaelis Menten
Para encontrar KB hay que hacer un experimento con mucha cantidad de sustrato A para que B controle ahora la reacción:
F 0 E 0 Michaelis Menten
5. Variación de la actividad enzimática con la temperatura y el ph.
A lo largo de todos los procesos hechos hasta ahora hemos mantenido la concentración de catalizador (Eo) constante. Cabe decir que el Ph, la temperatura, la agitación y el O (^2) son factores que afectan a la actividad enzimática, por eso previamente hay que determinar todos los óptimos físico-químicos.
Por ejemplo la enzima que se representa en el gráfico tiene un óptimo de trabajo a 60ºC, pero como en todo hay deterioro a la larga se acabaría desactivando. Hay que hallar la relación estructura-función de la enzima para poder aumentar la catálisis.
Lo que se hace para evitar este deterioro es utilizar enzimas procedentes de microorganismo termófilos y hacer así que la concentración de enzimas se pueda mantener constante a lo largo del tiempo. Si no es así se ha de introducir una ecuación matemática:
Como que la enzima se desactiva de alguna manera ha de ser proporcional a la concentración inicial de esta enzima. Si integramos esta ecuación y después la linealizamos:
5.1 Variación de la actividad enzimática en un RDTA: Si en un RDTA encontrásemos que la enzima se desactiva, entonces la ecuación quedaría:
Si se quiere conservar el tiempo de trabajo que se tenía sin desactivación será necesario añadir más enzima, se habrá de modificar K 2 ·EoF 0 E 0K 2 ·(Eo·e -Kd·t^ ).
5.2 Variación de la actividad enzimática en un RCTA o RCFP:
En un RCTA o RCFP si hay desactivación de la enzima significa que todo sobre lo que hemos trabajado es falso porque hay una variable que evoluciona con el paso del tiempo y que por tanto no hay estado estacionario: la ecuación de diseño nos quedaría llena de diferenciales y sería muy complicada de resolver.
La solución no es otra que utilizar enzimas hipertermófilos que no desactiven. Todo esto además de pasar con la temperatura también puede pasar con el Ph, la agitación o la presencia de O 2 , por eso se han de encontrar enzimas robustos para evitar cualquiera de estas desactivaciones, aunque se puede utilizar ingeniería genética de proteínas para modificar estas enzimas.
___ Con activación. ___ SIn activación.
TEMA 3: Cinética microbiana.
1. Estequiometría y rendimientos.
Si además consideramos que el proceso es aeróbico escribiremos tan sólo los productos importantes por lo que la estequiometría del crecimiento vendrá dada por:
C 6 H 12 O 6 + A(O 2 ) + B(NH 3 ) F 0 E 0 C(CH XO Y NZ ) + D(CO 2 ) + E(H 2 O)
Es necesario decir que el gas (CO2) se disuelve muy mal por lo que éste puede limitar la velocidad de la reacción. Por esta misma razón se debe evitar que el proceso quede sin O2; llegará un momento en el que habrá tantas células que el O2 no se podrá disolver e incluso habiendo sustrato no se podrá obtener biomasa porque llevarán a cabo la fermentación y el proceso pues no será tan rentable.
Por otro lado también se liberan ciertos subproductos por lo que por esto es necesario tamponar, mantener el pH, T, agitación… de forma óptima ya que si no trabajamos bajo condiciones óptimas la velocidad de la reacción no será la adecuada.
Nuestro producto será el microorganismo por lo que es necesario saber cuánto queremos obtener para calcular el sustrato necesario. Para saberlo se realiza un experimento en el que se pesa la cantidad de Glucosa, O2 y amonio que ponemos en la reacción. Después de se pesa la cantidad de células que se obtienen. Para llevar a cabo esto es necesario extraer el H2O (filtraremos y los microorganismos se quedarán sobre el filtro mientras que el H2O pasará; por lo que ahora ya podremos pesar los microorganismos). Esto se puede hacer con todos los componentes obteniendo así la relación entre todos los componentes respecto al Carbono:
CHX OY NZ H = x = 1,703 O = y = 0,459 N = z = 0,
C 6 H 12 O 6 + A(O 2 ) + B(NH 3 ) F 0 E 0 C( CH1,703 O0,459 N0,171 ) + D(CO 2 ) + E(H 2 O)
Para encontrar los coeficientes estequiométricos de esta reacción plantearemos un sistema e ecuaciones:
C: 6 = C + D
H: 12 + 3B = 1,703C + 2E
O: 6 + 2A = 0,459C + 2D + E
N: 3B = 0,171C
Este sistema tiene 4 ecuaciones para encontrar 5 incógnitas por lo que es necesario hacer otro experimento que nos proporciones una nueva ecuación como es el caso del coeficiente de respiración (RQ): = 1,
Si resolvemos el sistema: A = 3,942 B = 0,33 C = 1,928 D = 4,072 E = 4,
- Ahora ya sabremos que a partir de X moles de sustrato prodremos obtener Y moles de producto. El rendimiento se calcula a partir del limitante estequiométrico que en este caso es la glucosa:
Rendimiento YX/S :
F 0 E 0 F 0 E 0
Una vez encontradas todas las cantidades es necesario ver cómo afectarán a la cinética del proceso y por tanto, ver cuál será el mejor reactor para cada caso. Independientemente del reactor que hagamos servir debemos conseguir que la velocidad de la reacción sea la más cercana posible a la velocidad máxima:
ΔS = ΔS asimilación + ΔSenergía de síntesis + ΔS mantenimiento.
También cabe decir que en los reactores ideales con microorganismos la concentración del catalizador variará, a diferencia de las enzimas. Esto hace que no se pueda representar su velocidad de crecimiento en un gráfico 2D, el gráfico correspondiente tendrá 3D porque se le habrá añadido un nuevo eje. Para obtener el gráfico se mantiene constante la concentración de microorganismo y se realizan diversos experimentos cambiando la concentración de este catalizador y observando qué pasa baja estas condiciones con la concentración de sustrato.
El gráfico final se elabora a partir de diferentes planos (cada uno de los cuales tiene una concentración de catalizador diferente). En la representación final se coge un punto de [S] y de [X] de cada plano, esto nos permitirá calcular el experimento:
La velocidad de reacción nos indicará la masa transferida por unidad de volumen y tiempo, para saber si afecta esta velocidad será necesario calcular la velocidad específica:
Los rendimientos nos permitirán calcular, además de cantidades globales, velocidades;
Donde: rS = velocidad de consumo del sustrato. rY = velocidad de crecimiento. rP = velocidad de generación del producto.
Cuando los microorganismos usan el sustrato generan claro, CO2, H2O y células; se trata de una combustión, es decir, las células también pueden hacer una combustión generando el CO2, el H2O y el calor característico de esta reacción.
Es necesario calcular el calor total porque la reacción generará un cierto calor que puede estropear el producto. En el balance energético consideraremos todos los valores del calor, además necesitaremos saber el tiempo que tarda en generarse este calor; debemos definir los aparatos de energía, la transferencia de materia y la cantidad de movimiento.
2. Modelos cinéticos. En la cinética de microorganismos podemos diferenciar 4 modelos cinéticos clasificándolos estructurales y segregados:
No estructurado Estructurado No segregado Población celular tratada como un soluto unicomponente ( caso idealizado )
Descripción promediada multicomponente.
Segregado Un componente, células individuales heterogéneas.
Descripción multicomponente de la heterogeneidad célula a célula. ( caso real ).
Nosotros haremos una consideración; todas las células son iguales y se comportan igual, es decir, será como si tan sólo hubiera una única célula que fuera creciendo. Esto implica que nosotros seguiremos un modelo cinético no estructurado y no segregado en el que sólo habrá 1 limitante estequiométrico o cinético.
3. Cinética de crecimiento, consumo de sustratos y obtención de productos. Cuando trabajamos con microorganismos, a diferencia de las enzimas, encontramos 3 tipos de velocidades diferentes; rX, rS y rP:
Velocidad a la que crecen los microorganismos. Observamos que rX es proporcional (pese a que μ no es cte) a la concentración celular, a más células más velocidad de crecimiento. μ es la velocidad de crecimiento.
