Biofilms microbianos, Tesis de Biología

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MICROBIAL BIOFILMS

BIOFILMS MICROBIANOS

Trabajo de Fin de Grado

MELANIA TRUJILLO GARCÍA

Trabajo tutorizado por Ángel M. Gutiérrez Navarro

GRADO EN BIOLOGÍA

Junio 2017

MICROBIAL BIOFILMS

• HISTORIA ÍNDICE
• ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN
  • AGUA:
  • EXOPOLISACÁRIDOS:
  • PROTEÍNAS EXTRACELULARES:..................................................................................................
  • TENSIOACTIVOS Y LÍPIDOS:
  • ADN EXTRACELULAR (eADN):
• FORMACIÓN
  • FASES DE FORMACIÓN DE UN BIOFILM
    • 1º Adhesión bacteriana primaria:
    • 2º Adhesión bacteriana secundaria:
    • 3º Maduración del biofilm:
    • 4º Desprendimiento activo:
  • PROPIEDADES DE LOS MICROORGANISMOS:
  • PROPIEDADES QUE ADQUIEREN LAS BACTERIAS AL FORMAR PARTE DE UN BIOFILM:
  • PROPIEDADES DE LA SUPERFICIE:
  • FACTORES MEDIOAMBIENTALES:
• BIOFILMS EN EL ÁREA CLÍNICA:
• BIOFILMS EN LA INDUSTRIA:
• BIOFILMS EN LA NATURALEZA:
• ELIMINACIÓN Y CONTROL DEL BIOFILM
  • Limpieza:
  • Desinfección:
• TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO Y LA OBSERVACIÓN
• VENTAJAS VS DESVENTAJAS
• CONCLUSIONS:
• CONCLUSIONES:
• REFERENCIAS

MICROBIAL BIOFILMS HISTORIA Los “biofilms” , también llamados biopelículas, fueron descritos por primera vez en el siglo XVI por Antonie Van Leeuwenhoek, a consecuencia de haber examinado la placa de sus propios dientes declarando haber observado unos “animálculos” en un informe de la Royal Society de Londres: “The number of these animicules in the scurf of a man's teeth are so many that I believe they exceed the number of men in a kingdom." Pero la teoría general que describe el proceso de biopelícula no se promulgó hasta el año 1978. Dicha teoría se ha transformado y perfeccionado durante los últimos 25 años, entendiendo hoy en día, que la gran mayoría de los microorganismos en la naturaleza se encuentran adheridos a superficies donde crecen formando biopelículas o biofilms (Marsh, 2005); de hecho, los biofilms constituyen el estado habitual de las bacterias en la mayoría de los ecosistemas naturales (Stoodley y col. 2002). Todo ello establece la definición de “ biofilm bacteriano” entendido como «una comunidad sésil bacteriana inmersa en un medio líquido, caracterizada por bacterias que se hallan unidas irreversiblemente a un substrato o superficie, o unas a otras, que se encuentran embebidas en una matriz extracelular polimérica producida por ellas mismas, y que muestran un fenotipo alterado en cuanto al grado de multiplicación celular o la expresión de sus genes». (Costerton y col. 199 9; Donlan, 2002). Se tratan de un caso específico de contaminación microbiana. Éstos consisten en agrupaciones de microorganismos que se acumulan en una interfase sólido- líquido (También cabe la posibilidad que se establezcan en interfaces aire-líquido o sólido-aire) encontrándose rodeados por una matriz mucilaginosa provista de moléculas orgánicas, microbios y minerales. La matriz del biofilm en la que se encuentran embebidas las células, es el material extracelular de carácter adhesivo y gelatinoso, producido en su mayoría por los propios microorganismos y consiste en un conglomerado de diferentes tipos de biopolímeros – conocidos como Sustancias Poliméricas Extracelulares (EPS) – que constituyen el soporte para la estructura tridimensional de dicho biofilm. La formación de estas

MICROBIAL BIOFILMS biopelículas permite a las células una forma de vida completamente diferente del estado planctónico, protegiéndolas de entornos adversos y facilitando su supervivencia. Estas conformaciones microbianas presentan características específicas como su heterogeneidad , es decir, pueden estar formadas por una gran diversidad de especies bacterianas pudiéndose encontrar también hongos, levaduras, algas e incluso protozoos, su diversidad de microambientes , encontrándose en el mismo biofilm microorganismos con distintas necesidades fisiológicas (anaerobios, aerobios, microaerobios, entre otros), resistencia a antimicrobianos , esto es debido a la matriz de exopolisacáridos que los protege y la capacidad de comunicación intercelular que realizan gracias al sistema que poseen llamado “quorum sensing” que las convierte en complejos difíciles de erradicar en los ambientes donde se establecen. ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN A través de los nuevos métodos de observación como es el caso del microscopio láser cofocal de barrido (CSLM) se ha logrado la observación de estas biomasas “ in vivo” , hidratadas y a tiempo real mostrando claramente que un “biofilm” típico se compone principalmente por:

• Agua (Hasta un 97% del contenido total (Zhang y col. 1998)).
• Los propios microorganismos (15-20% del volumen (Costerton y col. 1997)).
• Matriz de naturaleza polimérica (Entre un 75% y 95% del volumen de una biopelícula ya madura). Conteniendo en su mayoría exopolisacáridos (Sutherland, 2001) y en menor cantidad macromoléculas como proteínas, lípidos, minerales y ADN microbiano procedentes de la lisis de las bacterias (Branda y col. 2005). La matriz de exopolisacáridos del biofilm retiene y mantiene próximas a las células entre sí, consiguiendo un elevado grado de interacción, comunicación intercelular y la formación de microconsorcios sinergísticos. Dicha matriz protege, además, a los microorganismos frente a la desecación, radiación ultravioleta, algunos antibióticos, biocidas, oxidantes, cationes metálicos, y

MICROBIAL BIOFILMS de desecho. Todo ello ocurre debido a que el agua es predominantemente aniónica, de manera que crea un sistema para atrapar los nutrientes y minerales del medio externo que rodea al biofilm. Por lo tanto, los canales son, en esencia, la línea de vida del sistema (De Beer y col. 1994).

EXOPOLISACÁRIDOS:

Se trata de moléculas largas, lineales o ramificadas, con masa molecular alrededor de 10^6 , consistentes en una mezcla de azúcares neutros y cargados, de forma que dan lugar a heteropolisacáridos. Pueden contener, además, sustituyentes orgánicos o inorgánicos que afectan de forma significativa a sus propiedades físicas y biológicas. Por ejemplo, uno de los exopolisacáridos más habituales es el alginato, constituido por los ácidos D-manúrico y L-gulurónico (Sutherland, 1990) y producido en biofilms de Pseudomonas aeruginosa (uno de los modelos de biofilms más estudiados). A continuación, haremos mención a la formación y producción de alginato : En un primer momento, el gen algU, en presencia de los genes reguladores mucA y mucB, empieza a favorecer la síntesis de dos sustancias llamadas «factor sigma 32» y «factor épsilon 32», las cuales, al actuar sobre el gen algC (que tiene como regulador al gen lacZ), inducen la formación de una enzima denominada fosfomanomutasa. Ésta participa activamente en la síntesis de alginato , un exopolisacárido que favorecerá la protección, la adhesión de las bacterias a distintas superficies y el mantenimiento de la integridad estructural (Forte y Rebagliati, 2013). Figura 2. Biopelícula desarrollada en una superficie de acero inoxidable en un sistema de agua potable en un laboratorio. CANALES DE H 2 O

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PROTEÍNAS EXTRACELULARES:

o Las proteínas enzimáticas poseen funciones que permiten el crecimiento del biofilm y la supervivencia de las células alojadas mediante el acceso a nutrientes, la regulación de la integridad o la estabilidad del biofilm (Costerton y Zbigniew, 1997). o Las proteínas no enzimáticas de la matriz, tales como las asociadas a las paredes celulares o las lectinas (proteínas de unión a carbohidratos), están implicadas en la formación y estabilización de la red de polisacáridos de la matriz y constituyen un enlace entre la superficie bacteriana y las (EPS) extracelulares. Dichas proteínas promueven la formación de biofilms en diversas especies bacterianas y juegan papeles importantes como la adhesión a superficies inanimadas y a células huésped (Lasa y Penadés, 2006). Por último, los apéndices proteicos, tales como pili, fimbrias y flagelos , pueden también actuar como elementos estructurales mediante su interacción con otras (EPS) de la matriz del biofilm (Cegelski y col. 2009).

TENSIOACTIVOS Y LÍPIDOS:

De carácter hidrofóbico, son cruciales para la adherencia de las bacterias a superficies hidrófobas. Además, otras (EPS) con capacidad tensioactiva, como surfactina, viscosina y emulsan , pueden dispersar sustancias hidrofóbicas y facilitar su disponibilidad. Los biotensioactivos han sido identificados como Figura 3. Desencadenamiento de la producción de la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa por la acción de los genes intervinientes. SNS 2013.

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FASES DE FORMACIÓN DE UN BIOFILM

1º Adhesión bacteriana primaria: Consiste en el encuentro entre una superficie y una bacteria planctónica basándose en una serie de variables fisicoquímicas que dan lugar a la interacción entre la pared bacteriana y la superficie en cuestión. En primera instancia, la bacteria debe de acercarse a la superficie, bien de manera directa por quimiotaxis, por una corriente de flujo o por la movilidad de la propia bacteria (Costerton y col. 1999). Una vez que el microorganismo está a menos de 1 nanómetro (nm) de la superficie se produce la unión gracias a las fuerzas atractivas o repulsivas en ambas superficies (Por ejemplo, las interacciones electrostáticas) (Lindhe y col. 2000). Cabe destacar que esta unión es totalmente reversible. 2 º Adhesión bacteriana secundaria: La unión comentada anteriormente se consolida con la producción bacteriana de exopolisacáridos, que se acoplan con los materiales de la superficie por ligandos específicos de receptores que se localizan en pilis, fimbrias y flagelos de la bacteria en el proceso de adhesión. En este caso, la unión es irreversible Figura 4. Etapas de la formación de un biofilm maduro sobre una superficie. Nature Reviews.

MICROBIAL BIOFILMS y el microorganismo queda firmemente unido a la superficie inerte. Durante esta fase, las bacterias planctónicas se pueden unir unas a otras (Co-agregación) y a diferentes especies que estén ya unidas al material (Co-adhesión), formando las microcolonias de sustrato (Lindhe y col. 2000). 3 º Maduración del biofilm: Una vez que la bacteria se ha unido de forma irreversible, comienza el proceso de maduración del biofilm. Las bacterias se dividen activamente y los compuestos extracelulares originados por ellas mismas interaccionan con las moléculas orgánicas e inorgánicas del medio creando así, el glicocálix (Busscher y Van Der Mei, 1997). 4 º Desprendimiento activo: El equilibrio dinámico de un biofilm se alcanza cuando las capas más externas de éste comienzan a generar células planctónicas metabólicamente activas y capaces de dividirse, las cuales pueden colonizar nuevas superficies (Busscher y Van Der Mei, 1997). Esta liberación puede darse por dos mecanismos (Xabier y col. 2003):

• Erosión (Pérdida de células individuales).
• Migración (Pérdida de agregados mayores). Además, es necesario resaltar que la formación de las biopelículas puede ocurrir por al menos tres mecanismos distintos: 1. Redistribución de las células unidas por la motilidad superficial: Estudios realizados por O'Toole y Kolter sobre mutantes de Pseudomonas aeruginosa revelan que la motilidad nerviosa (mediada por pili de tipo IV) juega un papel importante en la agregación superficial en este organismo. 2. División binaria de las células: A medida que las células se van dividiendo, las células hijas se extienden hacia fuera y hacia arriba desde la superficie de unión para formar grupos de células (como la formación de colonias en las placas de AGAR). ("Crecimiento y desprendimiento de células del cluster biofilm en flujo turbulento", www.microbelibrary.org/Visual/page1.htm).

MICROBIAL BIOFILMS disponibles, el tipo de bacterias que conforman la comunidad microbiana, hidrodinámica, entre otras (Davey y O'toole, 2000). Los biofilms que crecen bajo un flujo laminar se observan poco uniformes y están constituidos por células redondas, irregulares y agregados separados por espacios intersticiales; los que crecen bajo corrientes turbulentas se observan disparejos, elongados, en serpentina y oscilan en la mayor parte del fluido y los que crecen estratificados y compactos se desarrollan sobre los dientes (Hirsch, 1984).

PROPIEDADES DE LOS MICROORGANISMOS:

Los microbios pueden colonizar una amplia variedad de superficies tanto en ambientes bióticos como abióticos (Costerton y col. 1995); su habilidad para persistir en la biosfera obedece tanto a su versatilidad metabólica como a su plasticidad genotípica. El anclaje de microbios a superficies para la formación de biofilms es un proceso físico-químico determinado por fuerzas electrostáticas entre las células y la superficie. Por ello la superficie externa de los distintos microorganismos determina si dichas propiedades pueden dan lugar a la formación de la biopelícula.

• La presencia de flagelos favorece la capacidad para formar estas biopelículas, sobre todo, en las primeras etapas de su formación ya que ayuda a vencer las fuerzas de repulsión asociadas con el substrato durante la adhesión.
• Las fimbrias también favorecen la formación del biofilm.
• La función de los pilis en la conjugación (Transferencia horizontal de genes a otras células) puede estimular la formación de estas estructuras.
• Presencia de polisacáridos en la superficie externa de las células fomenta la formación de biopelículas.
• “Quorum sensing” o autoinducción (consiste en un mecanismo de regulación en la formación del biofilm que depende de la producción de moléculas señal de bajo peso molecular las cuales permiten a las bacterias apreciar la densidad poblacional existente). ▪ Bacterias Gram - : La principal molécula señal es la Acilhomoserina lactona.

MICROBIAL BIOFILMS ▪ Bacterias Gram +: Los principales inductores son péptidos. Por consiguiente, cuando existe una suficiente cantidad de autoinductor en el medio extracelular estas moléculas mandan una señal activando a un receptor específico, el cual altera la expresión génica afectando a distintos fenotipos. CURIOSIDAD: Se ha identificado una molécula denominada “Furanona” producida por el alga Delisea pulcra , con una estructura similar a las acilhomoserinas lactonas pero en lugar de producir la activación consiguen bloquear al receptor específico inhibiendo, por consiguiente, la formación del biofilm. En la actualidad, se está intentando desarrollar inhibidores derivados de la furanona, ya que esta molécula es extremadamente tóxica.

PROPIEDADES QUE ADQUIEREN LAS BACTERIAS AL FORMAR

PARTE DE UN BIOFILM:

Una vez los microorganismos forman parte de este tipo de estructuras desarrollan diferentes interacciones metabólicas:

• Modificación del microambiente: Modificación del pH según sus necesidades metabólicas, dando lugar a microambientes óptimos para el crecimiento de microorganismos anaeróbicos, a pesar de la presencia de oxígeno en el medio líquido (Wolfaardt y col. 1994).
• Sinergismo: La tendencia de las bacterias a la colonización es una gran ventaja ya que induce las relaciones simbióticas entres diferentes especies. Por ejemplo, cuando un alimento es requerido por un microorganismo, otro no lo puede utilizar, pero sí puede existir intercambio de nutrientes permitiendo de esta manera la supervivencia de ambos dentro de un mismo biofilm.
• Competencia: Por nutrientes, factores de crecimiento, espacio… da lugar a que los diferentes microorganismos embebidos en estas estructuras lleguen a producir distintos mecanismos de acción como son la producción de antibióticos, bacteriocinas, sideróforos, lisosomas, proteasas e incluso llegar a alterar el pH produciendo ácidos orgánicos (Ácido butírico, Ác. Propiónico, entre otros) (Costerton y col. 2005).

MICROBIAL BIOFILMS Asimismo, diversos investigadores han afirmado que la adhesión microbiana ocurre con mayor rapidez en superficies hidrófobas (como es el caso del Teflón, entre otros plásticos) que en materiales hidrofílicos como el vidrio o los metales. Aunque numerosos estudios demuestran que el acero inoxidable puede llegar a ser tan susceptible como el plástico (Pedersen, 1990). La acción del aire o de la humedad sobre el acero inoxidable, va originando una capa de óxido de cromo sobre el que se pega la suciedad orgánica. Así se pre-acondiciona el sustrato para la adhesión de las bacterias. El biofilm puede desarrollarse en distintos tipos de superficies, gracias a que previamente entra en contacto con la materia orgánica presente en el agua. En la interfase agua/superficie se deposita una capa orgánica, que cambia las propiedades químicas y físicas de la superficie y mejora las posibilidades de fijación de los microorganismos.

FACTORES MEDIOAMBIENTALES:

• pH.
• Cantidad de nutrientes.
• Cargas iónicas.
• Temperatura.
• Fluidez. Los cambios de pH pueden tener una gran influencia sobre el crecimiento de las bacterias, lo que es utilizado con frecuencia en la producción de detergentes y desinfectantes para matar dichos organismos. Estos microorganismos responden a cambios en el pH tanto externo como interno, ajustando la actividad y síntesis de proteínas que se encuentran asociadas con diferentes procesos celulares (Olson, 1993). Diversos estudios han demostrado que un aumento gradual de la acidez da lugar a que la supervivencia bacteriana sea mayor en comparación a un aumento repentino por la rápida adición de Ácido clorhídrico (HCl) (Yung-Hua Li y col. 2001). Esto sugiere que los microorganismos poseen mecanismos establecidos que permiten a la población bacteriana adaptarse a pequeños cambios en el pH. Sin embargo, existen procesos celulares que no se adaptan tan fácilmente a las fluctuaciones en el pH como, por ejemplo, la

MICROBIAL BIOFILMS excreción de sustancias exopoliméricas (polisacáridos) donde el pH óptimo es alrededor de 7 para la mayoría de especies bacterianas (Oliveira, 1993). Como ya sabemos, el desarrollo de un biofilm depende de las enzimas que controlan el crecimiento de las células, por lo tanto, las fluctuaciones en la temperatura producen cambios en las biopelículas ya que la velocidad de reacción de las enzimas depende de la temperatura. Por ende, una temperatura óptima produce un crecimiento saludable de las bacterias que conforman los biofilms, por el contrario, la temperatura alejada del óptimo reduce la eficacia en el crecimiento bacteriano; Esto es debido a una reducción en las tasas de reacción de las enzimas bacterianas. Además de las enzimas, la temperatura ambiental afecta a las propiedades físicas de los compuestos tanto dentro como alrededor de las células bacterianas. Fletcher (1977) investigó sobre el efecto de la temperatura en la unión de células en la fase estacionaria y sus resultados mostraron que una disminución de la temperatura reduce las propiedades de adhesión en el caso de Pseudomonas marino (Fletcher, 1977). Sin embargo, Herald y Zottola observaron que la presencia de apéndices en la superficie bacteriana era dependiente de la temperatura y para ello, realizaron varios estudios donde observaron que a 35ºC las bacterias tenían un solo flagelo, a 21ºC tenían dos flagelos y a 10ºC poseían varios, sugiriendo así que la interacción entre las células y el sustrato puede ser mayor con una disminución de la temperatura, aumentando la probabilidad de adherencia (Nisbet y col. 1984). Todas estas características del medio acuoso pueden llegar a ser un factor decisivo en la adhesión bacteriana al substrato. Numerosos estudios como los realizados por Fletcher (1991) reflejan la importancia de dichos factores. Éste observó como el incremento de cationes (calcio, hierro y sodio) afectan al proceso de adhesión de las bacterias Pseudomonas fluorescens a superficies de vidrio, presumiblemente porque reduce las fuerzas repulsivas entre la carga negativa de las células bacterianas y la superficie del vidrio (Fletcher y col. 1991). Por todo ello, la importancia del estudio de los “biofilms microbianos” radica en el impacto que éstos tienen sobre el área clínica, industrial o incluso sobre la naturaleza.

MICROBIAL BIOFILMS manera la colonización por otros microorganismos patógenos (como Gardnerella vaginalis entre otros).

• Otro ejemplo de biofilms beneficiosos lo constituye los formados sobre la superficie de los dientes, que protegen frente a la colonización por otros patógenos exógenos. Este biofilm suele estar compuesto en una persona por 20 - 30 especies bacterianas distintas, entre las que destacan Streptococcus y Actinomyces spp. Estos microorganismos de la placa dental viven en equilibrio mientras las condiciones externas se mantengan constantes. Pero si éstas se alteran, por ejemplo, por el abuso de azúcares, favorecerá el desarrollo de especies bacterianas que fermentan los azúcares, desequilibrando la población bacteriana y favoreciendo el desarrollo de especies como Streptococcus mutans y Lactobacillus spp , que producen ácidos que disuelven el esmalte protector de los dientes, produciendo así el desarrollo de las dos infecciones más prevalentes en el hombre, las caries y la periodontitis. Tras esto, procedemos a describir las infecciones humanas más recurrentes: Endocarditis de válvulas nativas La endocarditis de válvula nativa (EVN) es un proceso inflamatorio que aparece cuando la superficie del endocardio es colonizada por microorganismos, dando Figura 6. Lista parcial de infecciones humanas donde están involucrados los biofilms microbianos.

MICROBIAL BIOFILMS lugar a un proceso infeccioso que compromete a dichas válvulas (Livornese y Korzeniowski, 1992). Cuando la infección involucra el endotelio de los grandes vasos recibe el nombre de endoarteritis. Los microorganismos como Streptococcus o Staphylococcus , alcanzan el torrente sanguíneo desde la orofaringe, el tracto gastrointestinal o el tracto genitourinario, y cuando se produce una lesión en las válvulas estas bacterias se multiplican dando lugar al biofilm, lo que acentúa el daño y puede llegar a provocar embolias sépticas (Ferguson y col. 1986). Otitis media La otitis media (OM) es una inflamación del oído medio que implica la inflamación de la mucosa mucoperióstico y generalmente está causada por bacterias. Consiste en la acumulación de líquido detrás del tímpano dando lugar a las condiciones idóneas para la formación de un biofilm por microorganismos como Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa (Feigin y col. 1992). Prostatitis Consiste en una infección de la glándula prostática por la formación de un biofilm. Las bacterias que forman la biopelícula pueden ascender desde la uretra, por reflujo de orina contaminada o por la invasión de bacterias del recto a través de la extensión directa (Domingue y Hellstrom, 1998). Es preciso destacar que si este problema se trata en sus inicios puede ser erradicado mediante antibióticos, pero si las bacterias persisten puede dar lugar a infecciones crónicas (Níquel y col. 1994). Implantes médicos En el caso de los implantes, el biofilm puede estar compuesto tanto de bacterias Gram positivas, Gram negativas o incluso por levaduras. Estos microorganismos proceden de la piel del propio paciente, del ambiente o del propio personal sanitario. Pueden estar formados por una única especie o por múltiples dependiendo del implante y de la duración de su uso en el paciente. Una vez asentado y madurado el biofilm, éste actúa como una fuente de infección, sobre todo, en aquellos pacientes inmunocomprometidos.