¡Descarga BMCM tema 1 y más Apuntes en PDF de Biotecnología solo en Docsity!
TEMA 6. EL CULTIU DE CÈL·LULES ANIMALS EN BIOREACTORS
El potencial del cultiu de cèl·lules animals es basa en la capacitat que tenen aquestes cèl·lules per a dur a terme modificacions postraducció complexes, produint proteïnes amb l’activitat biològica necessària per a ser utilitzades en el diagnòstic i teràpia de malalties. Les línies cel·lulars més habitualment emprades són les de:
- CHO, Chineese Hamster Ovary
- BHK, Baby Hamster Kidney
- Hibridomes, cèl·lules obtingudes de la fusió entre un limfòcit i un mieloma
- HEK 293, Human Embryo Kidney
- Cèl·lules d’insecte, infecció amb baculovirus
Tal com es pot observar, la majoria de cèl·lules són de mamífer.
Tecnologia de cèl·lules animals (ACT)
El cultiu de cèl·lules animals ha permès desenvolupar processos per tal de produir proteïnes altament sofisticades en bioreactors, assolint les necessitats de producció per a ser utilitzades en un ampli rang d’aplicacions biomèdiques. Entre els productes que s’obtenen per ACT hi ha: vacunes virals, citoquines, factors de creixement hematopoiètic, hormones de creixement, anticossos monoclonals, agents trombolítics, factors de coagulació i vectors per a teràpia gènica.
Els processos ACT han de ser ben definits, reproduïbles, assegurar la productivitat, assegurar la qualitat del producte, la bioseguretat, robustesa i han d’operar en condicions GMP.
GMP (Good Manufacturing Practice) = BPF (Bones Pràctiques de Fabricació) conjunt de normes de compliment obligatori que ha d’aplicar qualsevol empresa que faci un producte d’ús humà. GLP = BPL: Bones pautes de laboratori parlen de toxicitat i seguretat dels productes d’un laboratori. Són obligatòries també. Les ISO són voluntàries!
1986, l’activador de plasminogen en teixits humans (t-PA) va ser aprovat com a 1r biofàrmac que es va comercialitzar (Genetech, USA). Actualment, entre un 60-70% de les proteïnes recombinants s’obtenen mitjançant aquests cultius (productes líders: ab quimèrics i humanitzats).
ACT: Productes d’alt valor afegit en desenvolupament a USA
Medi de cultiu: optimitzarem el procés i facilitarem el downstream si utilitzem un medi lliure de sèrum. L’aïllament de proteïnes serà més senzill si ja no n’hi ha al medi; a part, evitem el problema de l’homogeneïtat entre lots.
Requeriments bàsics pel cultiu de cèl·lules animals en bioreactors:
- Definir el tipus de bioreactor més apropiat
- Control dels principals paràmetres de cultiu: T, pO2, pH
- Control de l’estrès cel·lular (per exemple, degut a l’agitació i aeració en tancs agitats)
- Definir els requeriments de medi (complexes)
- Definir la forma més adient d’operació: discontinu, discontinu alimentat, perfusió
- Per a cèl·lules adherents, definir el tipus de reactor i seleccionar el suport pel cultiu
Estratègies bàsiques d’operació dels bioreactors en cultiu de CA
Sistemes de cultiu estacionaris
- T-flasks (o flascons de Roux): utilitzats sovint en manipulacions simples als laboratoris. Es guarda en un incubador de CO 2.
- Multiple plates or disks.
- Heterogeneous environament: gradients of nutrient, O 2 , metabolites content.
- From simple to more sophisticated systems (ex: Cell Cube o Cell Factory plaques de molt poca altura, es poden apilar moltíssim).
- Suited for adherent cells growth.
•Es fan créixer les cèl·lules amb tots els components del medi des de l’inici del cultiu. És el sistema més simple, i de referència.
BATCH
•Alimentació continuada de medi, en una operació en batch. Requereix una definició estricta de l’estratègia d’addició.
FED-BATCH
•Alimentació continuada de medi i eliminació de l’exhaurit, amb retenció de cèl·lules. Requereix desenvolupar el sistema de retenció cel·lular i l’estratègia d’alimentació. Sovint hi ha recirculació.
PERFUSION
Roller bottles
- More homogeneous environament
- Higher productivities than in stationary systems
- Labour intensive, due to manipulation
- Increased contamination risk
- Difficult monitoring (múltiple number of individual units)
- For large productions it can be robotic
Hollow fibre bioreactors (Bioreactors de “fibra hueca”)
- Cell retention in the hollow fiber cartridge, with mèdium perfusion
- High cell densities and high product concentrations
- Heterogeneous environament. Difficult monitoring
- Adequate for intermediate scales
Spinner flasks
- Homogeneous environament, low stress
- Can be used with suspension or microcarrier cultures
- Possibility to monitor some paràmetres, although individually
- Adequate for inoculum development and low-intermediate scales
Stirred-tank bioreactors
- Homogeneous Systems
- Easy monitoring and control (pH, pO 2 , T, etc.)
- Construction compatible with CIP and SIP, adapted for GMP production
- Automated operation with few manipulations, low contamination risk
Bioreactors for adherent cells: Fluidized-bed
Les cèl·lules estan fixades a microcarriers que alhora també estan anclats. Es fa passar per força el medi a través de les cèl·lules. Facilitat en els processos downstream.
Bioreactors for adherent cells: Spin-filters in stirred-tanks
BIOREACTORS D’UN SOL ÚS
Permeten flexibilitat en els processos productius. Constitueixen una alternativa interessant per produir volums moderats i també per les primeres etapes de preparació d’inòculs per cultius a gran escala. A més, no hi ha temps d’espera per la “posada a punt”. No calen mil controls per assegurar que tot està estèril abans de començar de nou.
Wave bioreactor
- Rocking moviment can provide good mixing and surface aereation for most aplications of AC. Rocking moviment control and plàstic bag manufacture are key for satisfactory operation.
- Limitated to intermediate volumes (so far, 50L)
Disposable bioreactors: XDR (Xcellerex)
Combination of stirred-tank performance with disposable plàstic bag. Up to 200L.
Anàlisi de fluxos metabòlics
S’ha de regular molt bé el metabolisme de la glucosa i la glutamina. Els seus principals sub- productes derivats, lactat (baixa pH) i amoni són potencialment tòxics per la majoria de cultius (a més d’afectar processos com la glicosilació). En general, el lactat no és tòxic fins a una concentració de 40mM i l’amoni fins a 2-4mM. A part, aquests subproductes també fan augmentar l’osmolaritat del medi.
En els cultius cel·lulars generalment hi ha altes concentracions de glucosa i glutamina per assegurar que es troben en concentracions suficients; s’observa que gran part d’aquestes concentracions es deriven per fer els esmentats subproductes es podria mirar d’afegir poc a poc la glucosa sabent la velocitat del seu consum i fent un control exhaustiu de la seva concentració constant.
La glutamina és un aa essencial i inestable. Si l’afegim al medi es converteix en glutamat molt fàcilment alliberant un amoni. Això produeix l’alcalinització del medi toxicitat. Aquest problema s’evita introduint al medi dímers estables de glutamina i també inserint a les cèl·lules el gen glutamina sintetasa (GluGln útil per la síntesi de proteïnes).
Fer una ullada a “Producción de Agentes Biofarmacéuticos” de Francesc Gòdia (Dept. D’Eng. Química UAB). Penjat al campus a “Documents”.
