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**ESCUELA DE MEDICINA HUMANA - CURSO INMUNOLOGIA BASICA MANUAL DE PRACTICAS INMUNOLOGIA BASICA
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__----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------ PRÁCTICA 01**
BIOSEGURIDAD Y SEÑALIZACIÓN EN EL LABORATORIO
INTRODUCCIÓN
El Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos, especifica cuatro niveles de bioseguridad para el manejo de agentes biológicos, los cuales son conocidos como Niveles de bioseguridad , la clasificación de cada laboratorio identifica el riesgo biológico que representan para la salud los agentes que ahí se manejan.
Nivel de Bioseguridad 1: En este nivel se trabaja con agentes que presentan un peligro mínimo para el personal del laboratorio y para el ambiente. En este nivel no se requiere equipo especial ni tampoco un diseño específico de las instalaciones. El laboratorio no está necesariamente aislado de las demás instalaciones del edificio. El trabajo se realiza generalmente en mesas de trabajo abiertas. Por lo general, los materiales contaminados se desechan en recipientes de residuos abiertos. Incluye varios tipos de bacterias y virus como la hepatitis canina, Escherichia coli no patógena, Staphylococcus epidermidis, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis, Sacharomyces cerevisiae, Penicillium roqueforti , así como algunos cultivos de células.
Nivel de Bioseguridad 2: En él se manejan agentes de peligro moderado hacia el personal y el ambiente y el personal de laboratorio tiene entrenamiento específico en el manejo de agentes patógenos como las bacterias Bordetella pertussis, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus, Micobacterias oportunistas , Haemophilus influenzae, Yersinia enterocolitica, Salmonelas gastroenteríticas, Shigella, Legionella, Borrelia, Neiserias patógenas, Vibrio, Treponema pallidum y virus como Adenovirus, Parvovirus B19, Rotavirus, Virus de la hepatitis A, Virus de la gripe, Virus del sarampión, Virus de las paperas, Virus de la rubéola.. El acceso al laboratorio es restringido cuando se está realizando algún trabajo. Se toman precauciones extremas con instrumentos punzocortantes contaminados. Ciertos procedimientos en los cuales pueden salpicar los agentes o aerosoles se llevan a cabo en gabinetes de trabajo biológico.
Nivel de Bioseguridad 3: Este nivel es el que se encuentra en los laboratorios clínicos de diagnóstico, laboratorios universitarios de investigación, en el cual se realiza trabajo con agentes exóticos o que pueden causar un daño serio y potencialmente mortal como resultado de la inhalación o exposición a los mismos, como las bacterias Bacillus anthracis, Brucella, Escherichia coli (verotoxigénica), Francisella tularensis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Rickettsias, Salmonella ser. Typhi, Shigella dysenteriae ser. 1, Yersinia pestis ; y los virus Virus de la encefalitis de California, Virus de la encefalitis equina americana, Virus de la estomatitis vesicular, Virus de la hepatitis B, Virus de la hepatitis C, Virus de la hepatitis D, Virus de la fiebre amarilla, VIH. El laboratorio cuenta con un diseño y características especiales y todos los materiales son manipulados utilizando vestimenta y equipo de protección. El personal de laboratorio tiene una formación específica en el manejo de patógenos y agentes potencialmente letales, y son supervisados por científicos competentes con experiencia en el trabajo con estos agentes. El acceso al laboratorio está restringido.
Nivel de Bioseguridad 4: Este nivel es el que se utiliza para trabajar con agentes biológicos que representan un alto riesgo individual de contagio y que además son un riesgo para la vida. Por lo regular los científicos que trabajan aquí, utilizan trajes
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especiales que cubren la totalidad de sus cuerpos y que además tienen una leve sobrepresión para evitar que entren partículas infecciosas al mismo si es que éste llega a desgarrarse. Además, las instalaciones están en un edificio separado o en un área controlada dentro de un edificio, que está completamente aislado de las demás áreas del edificio. Las enfermedades infecciosas que se manejan en el nivel 4 son: Virus de la viruela, Virus de la fiebre hemorrágica de Crimea (Congo), Virus de Marburg, Virus Ébola.
OBJETIVO GENERAL Aprender las normas de bioseguridad aplicadas al laboratorio de inmunología.
Objetivos Específicos. Familiarizar al estudiante con las normas de bioseguridad en el laboratorio de inmunología. Hacer conocer la importancia de los riesgos biológicos del manejo de material infeccioso. Aplicar los conocimientos en la resolución de casos de accidente ocupacional con material infeccioso.
NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA
1. Requisito indispensable: Antes de realizar cada práctica leer cuidadosamente el protocolo de la práctica para familiarizarse con el trabajo que va a desarrollar. Al conocer el protocolo disminuye la posibilidad de que ocurran accidentes y además puede aprovechar el tiempo de manera eficaz. 2. Prohibido: Comer, beber, fumar y distraer al profesor a la hora de la práctica. Prohibido el acceso a toda persona ajena al área. 3. Protección: Llevar el equipo de protección personal necesario. Esto garantiza que cualquier accidente que pueda ocurrir sea de menor gravedad, de no acatar las reglas no se permitirá acceso a la práctica. 4. Material y Equipo: Debe llevar aquellos materiales estrictamente necesarios para la práctica que va a desarrollar. Ser cuidadoso con todo el material y equipo que utilice para evitar accidentes y deterioro del mismo en las prácticas. 5. Limpieza: Dentro del área que se va a trabajar se comienza limpiando el área de trabajo y se repite este procedimiento después de que se haya terminado. El material de desecho depositarlo en el lugar que corresponde y el material reutilizable lavarlo y desinfectarlo. 6. Higiene: Durante la sesión de trabajo lavarse las manos con agua y jabón antes de hacer cualquier procedimiento y al finalizar repita el mismo procedimiento para mantener buenas condiciones higiénicas. 7. Desechos: Si utiliza guantes, frascos de medicamentos vacíos, jeringas, cubre bocas, portaobjetos, cubreobjetos, etc., no reciclar y desecharlos. 8. Indisciplina: Se sancionará con la expulsión parcial o total del alumno, según el caso lo requiera. 9. Responsabilidades: En caso de accidente o lesión, avisar inmediatamente al profesor o responsable de la práctica para que pueda auxiliar con rapidez y eficacia al alumno.
RECOMENDACIONES:
1. Todo material biológico humano se manipula como si fuera potencialmente infeccioso. 2. Protección personal: bata y guantes. Las heridas se traen cubiertas con apósitos impermeables. La ropa de calle es un elemento adicional de
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Color y tipo de envase requerido para cada uno de los tipos de RPBI:
Tipo de residuos Estado físico Envasado Color Sangre Sólidos Bolsas de plástico Rojo Cultivos y cepas de Líquidos Recipientes Rojo agentes infecciosos. herméticos Residuos no anatómicosno Patológicos Sólidos Bolsas de plástico Amarillo Patológicos Líquidos Recipientes herméticos
Amarillo
Objetos Sólidos Recipientes rígidos Rojo punzocortantes
SEÑALIZACIÓN EN EL LABORATORIO
Se entiende por señalización de seguridad y de salud a la que referida a un objeto, actividad o situación determinadas, proporcione una indicación o una obligación relativa a la seguridad o la salud en el trabajo mediante señal en forma de panel, un color, una señal luminosa o acústica, una comunicación verbal o una señal gestual, según proceda. Pictograma es la imagen que describe una situación u obliga a un comportamiento determinado utilizado sobre una señal en forma de panel o sobre una superficie luminosa. En principio, los lugares de trabajo deben ser señalizados con los pictogramas que se ajusten a las características de las tareas que se lleve a cabo en el laboratorio/ taller.
Requisitos de utilización
La altura y posición de las señales deberá tener en cuenta su relación con el ángulo visual. El lugar del emplazamiento de la señal debe estar iluminado, ser accesible y fácilmente visible. Las señales deben retirarse cuando deje de existir la situación que las justifica.
CLASIFICACIÓN DE PICTOGRAMAS:
1. Señales de advertencia Forma triangular. Pictograma negro sobre fondo amarillo, bordes negros. 2. Señales de prohibición. Forma redonda Pictograma negro sobre fondo blanco, bordes y banda rojos 3. Señales de obligación. Forma redonda Pictograma blanco sobre fondo azul 4. Señales de relativas a los equipos de lucha contra incendios. Forma rectangular o cuadrada Pictograma blanco sobre fondo rojo. 5. Señales de salvamento o socorro. Forma rectangular o cuadrada. Pictograma blanco con fondo verde.
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TAREAS DE LABORATORIO:
- Esquematizar dos pictogramas de cada uno de los 5 tipos expuestos
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TOMA DE MUESTRA PARA LA OBTENCIÓN DE SUERO Y PLASMA
INTRODUCCIÓN
El sistema hematopoyético (Hema = sangre, poyesis = producción, fabricación) es el sistema encargado de la formación de la sangre. La sangre es un tejido líquido, compuesto por agua y sustancias orgánicas e inorgánicas (sales minerales) disueltas, que forman el plasma sanguíneo y tres tipos de elementos formes o células sanguíneas: glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas.
Los glóbulos rojos, los glóbulos blancos y las plaquetas que conforman la sangre se producen en la parte esponjosa (médula roja) de algunos huesos del esqueleto (esos son: el esternón, los huesos del cráneo, las costillas, el hueso ilíaco y las terminaciones de los huesos de los miembros superiores e inferiores.
En la médula ósea roja de los huesos se encuentran las células hematopoyéticas pluripotenciales de las que derivan todas las células de la sangre. Hasta los 5 años de edad estas células tienen su origen en, prácticamente, todos los huesos del cuerpo. Después de los 20 años, los glóbulos rojos, blancos y plaquetas son producidos principalmente por la médula de los huesos planos, como las vértebras, el esternón y las costillas.
Se puede realizar un examen físico o químico de la sangre, para lo cual se la obtiene por punción venosa o por punción del pulpejo del dedo (sangre capilar) con lanceta estéril. Para casi todo el trabajo hematológico se utiliza sangre total. Ello exige el uso de anticoagulantes, los cuales impiden que el calcio actúe en la coagulación, sea precipitándolo como sal insoluble (oxalatos) o fijándolo en forma no ionizada (citrato, EDTA). La heparina actúa como agente antitrombínico, o sea neutraliza a la trombina. Así mismo, casi todas las determinaciones bioquímicas en el laboratorio utilizan suero, el cual se obtiene tomando la muestra en un tubo de ensayo y se lo deja coagular, para la separación del suero.
Usualmente en adultos se utilizan las venas del pliegue antecubital del brazo, pero también pueden ser otras zonas como, por ejemplo: del antebrazo, dorso de la mano, dorso del pie, etc.
La práctica tiene por objetivos:
- Adiestrar al alumno en la extracción de muestras de sangre del antebrazo para la obtención de sangre total, suero y/o plasma.
- Realizar extendidos sanguíneos en láminas portaobjetos.
MATERIAL Y MÉTODOS
1. Equipo necesario para la venopunción: Equipo Vacutainer. Tubos de vacío diseñados para llenarse con un volumen predeterminado de sangre por medio de vacío, esto garantiza una adecuada relación entre sangre y anticoagulante. Los tapones de goma están codificados por color de acuerdo con el aditivo que contienen así, por ejemplo, los tubos morados (EDTA) son los más utilizados para hematología rutinaria y los tubos celestes (citrato) para pruebas de coagulación.
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Agujas especiales para adaptador. Adaptador para tubos de vacío. Jeringuillas de 3, 5 y 10 cc. Agujas: Están numeradas dependiendo de su calibre. Para colección de sangre para hemogramas, se recomienda una aguja de diámetro de 0.8mm (21G) para evitar daño a las células. Las agujas de 0.9-1.1mm de diámetro (20G-19G) se utilizan normalmente para punción venosa en adultos. Torniquete: Generalmente una liga plana de látex. Alcohol: Etílico o isopropílico al 70%. Algodón Gasas y/o vendas adhesivas Dispensador de agujas
2. Etiquetado de los tubos
Un adecuado etiquetado de los tubos es esencial para que los resultados de los análisis concuerden con el paciente correcto. Los elementos clave en el etiquetado para garantizar la calidad de la muestra pre-analítica son: Nombre o iniciales del paciente Número de identificación del paciente Fecha y hora de la toma de muestra Iniciales del flebotomista
3. Punción venosa
La punción venosa permite extraer una mayor cantidad de sangre para las pruebas necesarias en hematología. Las venas de elección suelen ser las de la cara anterior del antebrazo (vena cubital, vena cefálica y la vena basílica) porque resulta fácil acceder a ellas.
Preparación del paciente
Instruya al paciente sobre la técnica para tomar la muestra. Valore la existencia de problemas hemorrágicos o de circulación, o alergias. Evite puncionar en un área con hematoma, fístulas, quemaduras, escoriaciones de la piel, cicatrices o del costado en que se ha realizado mastectomía reciente. Avisar al paciente que al introducir la aguja sentirá dolor. Extienda completamente el brazo con la superficie palmar hacia arriba.
4. Punción capilar
Es utilizada para extraer pequeñas cantidades de sangre en determinaciones de hemoglobina, hematocrito y frotes periféricos. Hay dos lugares de donde realizar esta punción: el lóbulo de la oreja, la yema del dedo.
Metodología Tome la muestra de las yemas de los dedos o lóbulo de la oreja. Desinfecte el sitio de la punción, séquelo y puncione la piel con una lanceta estéril que no debe penetrar más de 2 mm. Deseche la primera gota de sangre. Tome las gotas subsecuentes en un microtubo y prepare las laminillas con esa muestra.
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7. Componentes de los tubos vacutainer que se muestran y sus usos:
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__----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------ COLOQUE SUS FOTOS DE LA PRÁCTICA TOMA DE MUESTRA**
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Por ejemplo: Si se tiene 60% de neutrófilos segmentados y el recuento total de leucocitos es de 20 000, entonces el valor absoluto de neutrófilos segmentados sería: 60/ x 20 000 = 12 000.
La práctica tiene por objetivos:
1. Hacer recuentos de leucocitos y plaquetas. 2. Colorear extendidos de muestras de sangre. 3. Reconocer células sanguíneas y establecer la fórmula leucocitaria
MATERIAL Y MÉTODOS:
1. PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS:
MATERIAL: Sangre total (con anticoagulante). Láminas portaobjetos.
PROCEDIMIENTO:
Preparar una lámina cuyo ancho se ha reducido unos 5 mm. y que servirá como "lámina extensora". Colocar a 1 cm. del extremo de una lámina bien limpia y seca, una gota pequeña de sangre total o directamente de la aguja, jeringa o del dedo; por delante de ella colocar un extremo de la lámina extensora en ángulo de 30º y retroceder hasta que toque la gota que se extenderá a lo ancho de la primera lámina, luego deslizar la lámina extensora siempre en ángulo de 30º, en forma rápida y uniforme hacia el otro extremo. Si el ángulo entre las láminas es mayor, el frotis será más grueso y viceversa. Dejar secar las láminas a temperatura ambiente y rotular.
2. COLORACIÓN DE EXTENDIDOS SANGUÍNEOS : (Método de Wright)
PROCEDIMIENTO:
El frotis bien seco y rotulado se coloca sobre la gradilla de coloración. Cubrir la lámina con un volumen de colorante y dejar por un minuto (4-5 gotas) Diluir el colorante con dos volúmenes de agua tamponada pH. 6.4, mezclar bien, observándose la formación de una escarcha metálica y dejar por 6 minutos. Lavar con agua corriente y dejar secar colocando la lámina verticalmente. NOTA: Los tiempos indicados pueden variar de acuerdo a la antigüedad del colorante.
3. RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS: MATERIAL:
Láminas con extendidos sanguíneos coloreados. Microscopio óptico.
PROCEDIMIENTO :
Colocar las láminas coloreadas al microscopio, colocar una gota de aceite de cedro y observar con objetivo de inmersión. Reconocer los diversos tipos de células sanguíneas y dibujar.
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4. RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS
MATERIAL :
Hemocitómetro (Cámara de Neubauer) Pipeta de glóbulos blancos (de Thoma) Diluyente: Líquido Turk (Ácido acético 2-3% más gotas de violeta de genciana: La solución hipotónica del ácido acético destruye los GR y la violeta de genciana hace observar mejor los GB, a los que tiñe ligeramente).
PROCEDIMIENTO:
Mezclar bien la sangre con el anticoagulante. Llenar con sangre la pipeta de GB hasta la marca de 0, 5 y limpiar la punta. Introducir la pipeta en el diluyente de glóbulos blancos y llenar la pipeta hasta la marca de
- Hacer rotar para que se movilice la perla mezcladora. No permitir que ingrese aire ni se escape sangre. Tapar ambos extremos de la pipeta y mezclar manualmente por 1 minuto. Preparar la cámara de Neubauer con su laminilla cubre-cámara. Agitar la pipeta y descartar 3 a 4 gotas para luego colocar una gota pequeña cerca de un extremo abierto de la cámara, para que se llene por capilaridad. Dejar en reposo por 3 minutos: Enfocar la cuadrícula de Glóbulos blancos y luego con el objetivo de 40X contar en los cuatro cuadrados grandes angulares. La enumeración incluye las células que cubren o tocan por dentro o por fuera las líneas limitantes superior e izquierda en el cuadrado grande de recuento y no se consideran las de los limites inferior y derecho.
Nº de Leucocitos = G. blancos contados en 4 cuadrados x mm^3 Áreas contadas X altura cámara X dilución de sangre
Nº de Leucocitos = Glóbulos contados 4 x 1/10 x 1/ Nº de Leucocitos = Glóbulos contados x 50 x mm^3
VALORES NORMALES : de 5 000 a 1 0 000 x mm^3
5. RECUENTO DE PLAQUETAS : (método indirecto)
PROCEDIMIENTO :
De la lámina de hemograma contar 20 campos con más o menos 100 GR/campo. Hacer recuento de plaquetas en cada campo. Sacar promedio de plaquetas por campo, que corresponde al número de plaquetas por 100 glóbulos rojos. Confrontar con la Tabla de Relación entre Hematocrito y Número de glóbulos rojos y con dichos datos, calcular el número de plaquetas por mm^3
EJEMPLO: Se observa 10 plaquetas por 100 glóbulos rojos como promedio:
Si el paciente tiene 35% de Hematocrito, según la tabla te corresponde 3' 000 de glóbulos rojos. Por tanto, el número de plaquetas se obtiene:
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__----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------** Estas cifras pueden variar por condiciones climáticas, altura, raza, emociones, dolor, edad, etc. Conociendo la relación numérica y la cantidad total de leucocitos por milímetro cúbico, es fácil establecer la fórmula absoluta de cada tipo celular de la siguiente manera:
Fórmula absoluta = Recuento global leucocitario x % variedad de célula. 100
CÁMARA DE NEUBAUER
PIPETAS PARA GLÓBULOS ROJOS Y BLANCOS
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__----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------ TÉRMINOS USADOS:**
Leucopenia: Disminución del número total en el recuento de leucocitos. Leucocitosis: Aumento del número total en el recuento de leucocitos. Neutropenia: Disminución del número absoluto de neutrófilos. Aplasia medular. Mieloptisis de la médula ósea. Agentes citotóxicos. Trombocitopenia: Disminución del número total en el recuento de plaquetas. Linfocitosis: Aumento del número absoluto en el recuento de leucocitos. Infecciones virales agudas, como la mononucleosis infecciosa, hepatitis, citomegalovirus. Otras infecciones agudas, como la tos ferina. Infecciones por protozoos, como la toxoplasmosis y la enfermedad de Chagas.Infecciones bacterianas crónicas como la tuberculosis o la brucelosis. Cáncer, especialmente del sistema linfático Monocitosis: Tuberculosis. Endocarditis bacteriana. Enfermedades virales como sarampión, rubeola. Colagenosis. Neoplasias. Desviación a la izquierda: Significa el aumento de las formas inmaduras (en banda o cayado, y juveniles) dentro de los neutrófilos. Puede observarse en: infecciones e intoxicaciones. Desviación a la derecha: Corresponde a la hipersegmentación nuclear. La mayoría de polimorfonucleares presenta más de 5 lobulaciones. Ocurre en: Anemia perniciosa. Hipersegmentación constitucional hereditaria. Reacciones mieloides de la sepsis. Afecciones hepáticas. Leucemia mieloide. En la agonía. Eosinofilia: Infecciones parasitarias. Reacciones alérgicas. Enfermedades cutáneas. Neoplasias.
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5. Pegue fotos de células observadas en práctica, señalando su nombre y aumento.
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PRÁCTICA NO. 04
VÍAS DE INOCULACIÓN EN ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
INTRODUCCIÓN
La bioética tiene como objetivo conectar la reflexión ética con la investigación científica, con la finalidad de construir una ciencia con conciencia al servicio integral del hombre. La experimentación clínica, constituye un valor en sí misma que debe ser buscado lícitamente por los científicos y que no se contrapone con la instancia ética en cuanto al objetivo común de ambas que es la búsqueda de la verdad para el hombre y para su salud.
La elección de especies animales se basa en diversas consideraciones. Se debe tomar en cuenta si la especie en cuestión es susceptible a la enfermedad contra la cual estamos elaborando el producto. Es importante, además, considerar el costo de los animales, así como el de su mantenimiento, el tamaño y docilidad de los mismos, etc. Un factor importante en bioterios (unidades en donde se crían estos animales) y en laboratorios, es el manejo adecuado, tanto para evitar heridas por mordeduras y arañazos, etc., como para evitar el excesivo sufrimiento de los mismos.
Los animales de experimentación han proporcionado modelos para la realización de diferentes investigaciones en diferentes áreas de las ciencias de la vida. Los animales deben tratarse con seriedad y cuidado y si el sacrificio es parte de la experimentación ésta debe de realizarse bajo un protocolo de eutanasia apropiado. El manejo de estos animales varía de especie a especie. Las especies que más se utilizan en el laboratorio son el cobayo, ratón albino, rata albina y el Hamster, de ellos ofrecen mayor dificultad la rata y el ratón porque al sentirse capturados muerden. El cobayo y Hamster son sumamente dóciles.
La inoculación de sustancias es una práctica generalizada, y en el área de la inmunología las inoculaciones representan la práctica más extendida, pero también existen pruebas diagnósticas, los test alérgicos que demandan cierto conocimiento de las diferentes vías de inoculación. Asimismo, la toma de muestras sanguíneas es un procedimiento de rutina en la mayor parte de los laboratorios de inmunología, ya que a través de este procedimiento se obtienen células, fluidos y moléculas tanto para la investigación como para el diagnóstico.
OBJETIVO
Aprender el manejo adecuado de los animales más comunes de laboratorio.
TÉCNICAS DE INOCULACIÓN Y VENOPUNCIÓN (SANGRADO)
1. Inoculación y venopunción intravenosa en ratón y rata. Introduzca al ratón en un tubo de paredes lisas y con un orificio de salida en la tapa donde se extrae la cola. Limpie la cola con una torunda y agua caliente, para que la vena caudal se dilate e inocule con una jeringa de tipo tuberculina usando una aguja de 25. Para la venopunción se procede de la misma manera e incluso se puede cortar un pedazo de la cola.
