Espectroscopia Ultravioleta-Visible (UV-Vis), Diapositivas de Bioquímica e Instrumentación

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Instrumentación Básica

La interacción de los compuestos con la energía radiante puede ser por las

propiedades de onda de esta, como ya se mencionó, o bien como partículas

energéticas. En el presente capítulo se tratará de las radiaciones como

partículas energéticas. Las formas de interacción desde este punto de vista

son:

Emisión: La emisión es el fenómeno, inverso a la absorción, en donde el átomo, ión o molécula pasa de su estado basal al excitado por medio de energía diferente a la radiante, como arcos eléctricos, flamas, bombardeos electrónicos, etc, y vuelve a su estado basal o a un nivel menor de energía emitiendo fotones de energías características ( figura 2 b). La intensidad de la radiación emitida depende del número de especies capaces de emitir fotones. Luminiscencia: La luminiscencia es un fenómeno que combina la absorción con la emisión, ya que el átomo, ión o molécula pasa al estado excitado absorbiendo fotones, y regresa al estado basal emitiéndolos. Según la energía de los fotones emitidos, se pueden producir fenómenos de fluorescencia resonante, fluorescencia normal y fosforescencia.

Fosforescencia: Cuando una molécula pasa de un estado singulete a un estado triplete se presenta el fenómeno llamado “ intersistema cruzado”. Con el cruzamiento los electrones se desaparean y la molécula queda en un nivel vibracional excitado que por relajación vibracional pasa al nivel mas bajo de energía E3. La energía del estado E3 es menor que E2, de lo que se deduce que una molécula en estado triplete tiende a perder su energía por colisiones. Si la molécula en un estado triplete pierde su energía E3 por emisión de un fotón, se produce la fosforescencia. La fosforescencia se presenta en muy pocas moléculas y actualmente no se suele aplicar a la química analítica.

Dispersión de la luz: Si una radiación electromagnética choca con una partícula pequeña con respecto a la longitud de onda de la radiación, esta sufre una perturbación debida a que la partícula esta sujeta al campo eléctrico oscilante. Si la partícula se puede polarizar, el campo eléctrico de la radiación induce un dipolo en la partícula. Durante el paso de la onda, el polo inducido oscila a la misma frecuencia que la radiación y forma un campo propio que actúa como una fuente de radiación. Esta radiación es de la misma frecuencia que la original, pero se propaga en todas direcciones produciendo una dispersión. Todos los átomos y moléculas pueden causar esta dispersión, conocida como “dispersión Rayleigh”.

1 .- Transiciones ∂∂ . Se presentan en todos los compuestos orgánicos. Son en general de gran energía (UV de vacío) e intensidad. 2 .-Transiciones ∂ 𝝅 y 𝝅 ∂ *. Son posibles solo en compuestos insaturados. Son transiciones de baja intensidad (regiones de definición de los orbitales involucrados diferentes)en el UV lejano. Carecen de interés práctico. 3 .-Transiciones n ∂ *. Se presentan en compuestos con heteroátomos (O, N, S, Hal), generalmente en la región cercana a los 200 nm. La intensidad es variable dependiendo de la naturaleza del orbital n. 4 .- Transiciones 𝝅𝝅 . Presentes solo en compuestos insaturados. En ausencia de conjugación estas transiciones se presentan en UV de vacío. Dan lugar a bandas intensas que `pueden aparecer en UV cercano si está presente insaturación conjugada. 5 .-Transiciones n 𝝅. Presentes en compuestos insaturados con heteroátomos (grupos carbonilo, nitro, azo, tiocarbonilo). Dan lugar a bandas débiles usualmente en la región UVcercana (baja energía de transición).

Imaginemos que hacemos dos medidas de la intensidad de luz: 1 ) La primera medida la muestra será una disolución con la misma matriz que el analito que deseemos determinar pero en ausencia de éste (disolución blanco). La intensidad de radiación (luz) que llega al lector será 2 ) La segunda medida se hará en presencia del analito (cromóforo) que deseemos estudiar. En este caso la intensidad de luz que llega al lector será I. Como trabajamos con analitos que absorben radiación a la longitud de onda que selecciona la red de difracción, lógicamente. Existen dos maneras de expresar la relación entre I e Io. La relación directa se denomina transmitancia (T), mientras que se denomina absorbancia al logaritmo con signo cambiado de la transmitancia. La absorbancia es un término actualmente mucho más utilizado que la transmitancia.

8. Ley de Beer

Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución.

La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, ε varía con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de moléculas, cambios del medio, etc Se pueden presentar desviaciones de la linealidad de la curva en absorbancia frente a concentración y pueden ser: 1 )Se miden concentraciones muy elevadas del absorbente. 2 ) La radiación incidente no es monocromática. 3 )Varia el índice de refracción con la concentración de absorbente. Desviaciones químicas: cuando se producen interacciones del absorbente con la matriz y desviaciones instrumentales, debidas a la radiación dispersa, ruido de fonda, usa forzado de longitudes de onda extremas, cubetas inadecuadas, disolventes muy absorbentes 0 cuando se produce una falta de linealidad del detector.

Cromóforo Un grupo insaturado covalentemente que es responsable de la absorción electrónica. Una molécula o parte de una molécula que puede ser excitada por absorción se llama cromóforo. En sistemas biológicos los cromóforos generalmente tienen máximos de absorción en el rango del UV lejano al visible. C=C C=O O=N=O Auxocromo Son grupos que no absorben la radiación ultravioleta y visible pero desplazan los máximos de absorción hacia longitudes de onda mayores e incrementan las intensidades. Un grupo saturado que, cuando se encuentra unido a un cromóforo, altera tanto la longitud de onda como la intensidad del máximo de absorción; por ejemplo: OH Cl