etapas de extracción del ADN, Guías, Proyectos, Investigaciones de Biología

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Materia:

Biología celular y molecular

LABORATORIO

EXTRACCIÓN DEL ADN

Profesor:

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La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción. Tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+^ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite. Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le permite unirse a moléculas y matrices inorgánicas cargadas positivamente.

INTRODUCCION

ETAPAS DE EXTRACCIÓN DEL ADN

¿EN QUE CONISTE CADA

UNA?

 El primero una extracción la cual implica sacar el ADN el compartimiento celular por medio de una lisis  El segundo sería una purificación ésta permite separar el ADN de los demás componentes celulares  por último, una precipitación que es en la cual ya tendríamos el ADN completamente puro. Sobre la extracción y la purificación del ADN en ella entenderemos los principios químicos de separación y purificación describiremos las generalidades de los diversos mecanismos de extracción y lo más importante comprender la necesidad de la extracción de ADN para su uso en pruebas diagnósticas. los métodos comúnmente empleados combinan procesos químicos, físicos y o mecánicos e cómo se mencionó el paso inicial de cualquier método de la extracción como el material genético se encuentra dentro de la célula lo primero es realizar una lisis. la lisis permite liberar el ADN el interior y puede realizarse por métodos químicos métodos físicos o métodos enzimáticos.

1. hablaremos de la lisis celular generada por métodos químicos estos utilizan buffer es de extracción que contienen detergentes como el sodio de silo de sulfato mejor conocido como SDS éste degrada la membrana celular capturando lípidos y proteínas evitando que cantidades significativas de ADN queden atrapadas en los restos celulares también se le debe añadir a la solución moléculas que el antes como por ejemplo el EDTA que posee cuatro grupos carboxilos y los dos grupos amino y cuya forma totalmente desprotonada puede unirse a iones magnesio el magnesio. El magnesio funciona como un cofactor de las enzimas que degradan el ADN o sea las nucleasas por lo tanto al agregarle el EDTA a estas son inhibidas protegiendo así el ADN. Algunas sales como el cloruro de sodio forman una capa iónica suave que recubre el ADN y así lo protege y ayudan a evitar su degradación además de deshidratar y precipitar

3. Por último, la extracción puede hacerse por métodos enzimáticos estos métodos utilizan proteasas que rompen los enlaces peptídicos de proteínas de la pared y membrana plasmática además de las interacciones células célula el resultado es una lista celular que libera el material genético a la solución como se comentó al inicio el mejor método es el que se adapta a las necesidades de la muestra y las que tenga el laboratorio luego de extraído el ADN de la célula por cualquiera de los métodos antes descritos es necesario realizar una purificación ésta se realiza con la eliminación de proteínas y lípidos de membrana la eliminación de éstos se como por ejemplo el fenol que debe agregarse en un volumen igual al de la muestra debe de agitarse hasta que la solución dentro del tubo tenga un aspecto de emulsión y posteriormente debe de centre jugarse. la centrifugación permite la formación de dos fases una acuosa y otra orgánica y entre ellas se forma una interfase que es en donde quedan atrapadas proteínas de  La fase acuosa es la que contiene el ADN por lo tanto es la que nos interesa recuperar así que debe traspasarse a otro tubo estéril siempre teniendo el cuidado de no arrastrar la interfase o la fase orgánica  posteriormente se agrega cloroformo en un volumen igual al del sobrenadante recuperado y se procede de la misma manera que con el fenol en este paso son eliminados residuos lipídicos que pudiesen estar aún presentes en la muestra.  nuevamente la fase acuosa conteniendo el ADN

por último, es necesario precipitar el ADN esta precipitación se lleva a cabo agregando etanol absoluto a la fase acuosa recuperada la sala adicionada en el buffer de extracción también ayuda a la precipitación del ADN debido a la formación de una capa iónica positiva alrededor de éste como se había mencionado con anterioridad el etanol, además, cumple la función de remover la concentración residual de sales.  luego se centrífuga para remover el sobrenadante recordad que el ADN ha precipitado y ahora es este precipitado el que nos interesa al descartar el sobrenadante el  nuevamente se centrífuga y se elimina todo el etanol dejando secar el botón de ADN por media hora a temperatura ambiente es importante que sea en un lugar protegido hasta que todo el etanol se haya evaporado una vez seco el botón de ADN puede suspenderse en agua para ser utilizado o bien puede guardarse en el congelador hasta su uso el ADN es estable por varios días conservado a una temperatura estable con esto hemos terminado la extracción y la purificación de una muestra de ADN que ahora puede ser sometida a investigación para algún uso

EXTRACCION DE ADN CON MATERIALES DE

COCINA

1. vamos a romper las células del tomate a base de golpes con la cuchilla, batimos a intervalos de 10 seg. Una vez triturado el tomate vamos a colar el tomate con un colador para eliminar los trozos de pulpa o de piel, al triturarlo lo que hicimos es romper las células y liberar los orgánulos contenidos en el citoplasma, el ADN estará contenido tanto en el núcleo como en las mitocondrias y cloroplastos todos ellos orgánulos rodados de membrana

6. Para recoger esta banda podemos utilizar una pipeta a la que le hemos estrechado la boca de la pipeta en forma de gancho.
7. introducimos la pipeta movemos hasta llegar al nivel de la banda tratando de enrollar el ADN en la punta de la pipeta y tiramos hacia riba
8. la muestra obtenida la depositamos en una placa de Petri y la visualizamos.

¿Qué puedo hacer con el ADN

La extracción de ADN se realiza para obtener las moléculas aisladas con alto grado de pureza y poderlas utilizar en investigación científica, en medicina o para la ciencia forense. se utiliza para analizar a pacientes con diferentes padecimientos como enfermedades genéticas, cáncer, infecciones, etc.

Método de salting-out Uso de la proteinasa K y el dodecilsulfato de sodio Método de extracción de ADN con yoduro de sodio como agente caotrópico en un único tubo Entre los kits comercializados por Wako se encuentran:  Kit de extracción de ADN (DNA Extractor® Kit) para extraer ADN tanto de suero sanguíneo como de productos biofarmaceúticos.  Kit de extracción de ADN WB (DNA Extractor® WB Kit) para la extracción de ADN genómico de muestras de sangre entera  Kit de extracción de ADN TIS (DNA Extractor® TIS Kit) este kit puede ser usado para la extracción de ADN de tejido parenquimatoso humano y animal.  Kit de extracción de ADN SP (DNA Extractor® SP Kit) usando este kit se puede extraer el ADN libre del suero y plasma sanguíneo  Kit aislador de ADN PS (DNA Isolator PS Kit) permite aislar el ADN en muestras de secciones de tejidos embebidas o incrustadas en parafina.  Kit de extracción de ADN FM (DNA Extractor® FM Kit) su principal uso es la obtención de ADN en muestras de medicina forense. Extracción con gradientes de cloruro de cesio – bromuro de etidio Método del CTAB

Otras técnicas para extraer

ADN

Al realizar adecuadamente el procedimiento sobre la extracción de ADN se pudo observar que las fibrillas de ADN comenzaron a salir, de un color blanco precipitado por sobre el alcohol (mezcla Heterogénea). A través del otro experimento junto a su extracción y purificación se pudo analizar que cada uno de los ingredientes tiene su propia función la lisis permite liberar el ADN el interior y puede realizarse por métodos químicos métodos físicos o métodos enzimáticos. La homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del ADN con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la eliminación de inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molécula.

CONCLUSIÓN

https://www.youtube.com/watch?v=a8d8ZNSX880&t=267s https://www.youtube.com/watch?v=PkjtFM_UVxk&t=122s http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0375- http://conogasi.org/articulos/extraccion-de-adn/

BIBLIOGRAFIA