¡Descarga Extracción de ADN genómico y más Guías, Proyectos, Investigaciones en PDF de Biología Molecular solo en Docsity!
Universidad de Sonora
Departamento de Ciencias Químico-Biológicas
Licenciatura en Químico Biólogo Clínico
Biología Molecular
Docente: López Romero Gloria Carolina
Grupo 04
Práctica 2 - 3. Extracción de ADN genómico y Cuantificación de
ADN.
Integrantes:
Cárdenas Sánchez Jesús Alejandro
Mercado Gámez Mónica
Ortiz Izaguirre Fernanda Alicia
Torres Chávez Christian Antonio
Hermosillo, Sonora 3 de marzo del 2023
Introducción con fundamento
La extracción de ADN es una técnica para aislar ácido desoxirribonucleico de células o tejidos. El ADN extraído puede utilizarse para investigaciones de biología molecular como secuenciación, PCR o clonación. El primer aislamiento de ADN fue realizado en 1869 por Friedrich Miescher. Actualmente es un procedimiento de rutina en biología molecular o análisis forenses. Las proteínas celulares e histonas unidas al ADN pueden eliminarse añadiendo una proteasa o precipitando las proteínas con acetato de sodio o amonio, o extrayéndolas con una mezcla de fenol-cloroformo antes de la precipitación del ADN. Después del aislamiento, el ADN se disuelve en un tampón. Las reacciones en las que se utilizan ácidos nucleicos suelen requerir cantidades y pureza particulares para un rendimiento óptimo. Una de las prácticas más utilizadas para cuantificar el ADN es el uso del análisis espectrofotométrico mediante un espectrofotómetro. Un espectrofotómetro es capaz de determinar las concentraciones medias de los ácidos nucleicos ADN o ARN presentes en una mezcla, así como su pureza. Este análisis se basa en el principio en el cual los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta siguiendo un patrón específico. En el caso del ADN, se expone a una longitud de onda de 260 nm y un fotodetector mide la luz que atraviesa la muestra. Cuanta más luz absorba la muestra, mayor será la concentración de ácido nucleico en la misma.
Materiales
Solución de lisis de GB y GR Tubo morado (con EDTA) con sangre Micropipeta Centrífuga SDS 20% Isopropanol Baño María Etanol Acetato de potasio 3M Espectrofotómetro Celdas de cuarzo Puntas p/ micropipeta
Materiales peligrosos y sus cuidados
Isopropanol: En cuanto a los peligros presentados en esta sustancia se encuentran:
Palabra de advertencia: Peligro Indicación(es) de peligro
Procedimiento
P
P
Resultados
Cuantificación de ADN.
Concentración de dsADN: (50ug/ml) (Factor de dilución) ((Abs)(260-nm-320nm)) Abs-320nm = 0. 1.- (50ug/mL) (100) (0.114-0.000) = 570 ug/mL. 2.- (50ug/mL) (100) (0.028-0.000) = 140 ug/mL. 3.- (50ug/mL) (100) (0.026-0.000) = 130 ug/mL. 4.- (50ug/mL) (100) (0.027-0.000) = 135 ug/mL.
Conclusión
Pudo observarse con mayor detalle la obtención de la pureza de una muestra de ADN, asimismo, conocer cómo calcular los parámetros de concentración del mismo ADN genómico que fue obtenido previamente en la práctica 2 , utilizado en la práctica 3 al estar correlacionados. Al finalizar esta práctica pudimos notar también que había un gran número de formas de extraer y cuantificar el ADN, siendo esta de las más utilizadas, aunque también nos encontramos con técnicas que no utilizan ningún compuesto orgánico, de esta manera, siendo más eficientes que el de espectrofotometría debido a la poca cantidad de interferencia que puede encontrarse.
Referencias
(^1) 2 - Propanol MSDS - 109634 - Merck. (n.d.). Retrieved March 3, 2023, from https://www.merckmillipore.com/MX/es/product/msds/MDA_CHEM-109634?Origin=PDP (^2) etanol MSDS - 100983 - Merck. (n.d.). Retrieved March 3, 2023, from https://www.merckmillipore.com/MX/es/product/msds/MDA_CHEM- 100983 ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.bing.com%2F Extracción de ADN _ AcademiaLab. (n.d.). Retrieved March 1, 2023, from https://academia- lab.com/enciclopedia/extraccion-de-adn/ Extracción de ácidos nucleicos | Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud | AccessMedicina | McGraw Hill Medical. (n.d.). Retrieved March 1, 2023, from https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookId=1473§ionId=
Cuestionario
P
1.- Explica la función de cada uno de los componentes en las soluciones empleadas en el protocolo de extracción utilizado en la versión casera y las usadas en el simulador. Solución de lisis de glóbulos rojos: Esta solución nos ayuda para lisar (destruir) a todos los eritrocitos que se encuentran en sangre completa Buffer de glóbulos blancos: mejora la extracción y estabilidad de las proteínas Solución de protrinasa k: se utiliza para la destrucción de proteínas en lisados celulares y para activación de ácidos nucleicos, ya que inactiva las DNasas y las RNasas con mucha eficacia Acetato de potasio: es adecuada para la precipitación de ADN isopropanol o etanol: se utiliza para concentrar y desalinizar preparaciones de ácidos nucleicos en soluciones acuosas 2.- Si se usa etanol, éste debe ser lo más concentrado posible, ¿por qué? Para evitar que se tenga una coprecipitacion de sales 3.- ¿ Cómo influye o cómo podría afectar el pH de las soluciones en este proceso? ¿Cómo influye la temperatura? ¿Por qué usamos etanol frío, por qué no se debe usar etanol a temperatura ambiente? Para precipitar DNA a partir de pequeños volúmenes de muestra, se recomienda hacer la extracción en frío para poder recuperar la mayor cantidad de DNA posible, y por lo tanto, el solvente de elección en este caso sería el etanol 4 .- Investiga los protocolos de extracción de ADN: Método con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico, y al menos otro método aparte. Menciona diferencias, ventajas y desventajas de cada uno Método con: Fenol: Cloroformo: Alcohol Isoamílico Lisado y purificación con un detergente iónico. Método del CTAB Características El fenol es un compuesto no polar. Debido a que los ácidos nucleicos son altamente polares, no se disuelven en presencia de fenol. Cuando se agrega fenol a una solución de muestra celular, el agua y el fenol permanecen separados. Se forman dos “fases” Este es un procedimiento básico para extraer ADN de vegetales, donde un detergente aniónico puede romper la pared celular y así se produce la lisis de las células. El uso de detergentes aniónicos no solo se restringe
distancia recorrida por la onda entre dos máximos consecutivos. ¿Qué es absorbancia? La absorbancia se refiere a la magnitud que es utilizada para comparar la cantidad de luz que incide en una sustancia con la cantidad de luz que sale después de atravesarla, de esta manera, se asocia directamente con la concentración que presenta dicha muestra.
3. En el caso de la detección de ADN, ¿cómo se genera la señal óptica? ¿Qué se detecta? ¿A qué longitud de onda absorbe el ADN? ¿Aplica también para otros ácidos nucleicos? La señal óptica se genera conforme a la secuenciación del ADN, es decir, depende la sintetización del mismo, el ADN absorbe longitudes de onda de 260nm comúnmente, esta misma longitud de onda no aplica para cualquier otro ácido nucleico debido a la diferencia estructural y funcional que existe entre cada uno de los ácidos nucleicos 4. ¿Cómo mide la señal óptica el detector? Es decir, ¿qué es lo que detecta? El detector es el encargado de conocer la radiación que se analizará, a su vez, saber qué tipo de respuesta presenta, si es mediante fotones o es mediante calor. 5. ¿Cómo se calcula la concentración de ácidos nucleicos? ¿Con base en qué? Los cálculos se basan en la cantidad de ADN (En microgramos) en cada mL de solución, esto a su vez, multiplicado por el factor de dilución y la diferencia entre las absorbancias, esto nos provee de un valor de concentración de la muestra 6. ¿Cuáles son los límites de detección (superior e inferior) de concentración de ADN mediante la técnica espectrofotométrica? Es posible cuantificar desde 25 pg/mL hasta 250 pg/mL 7. ¿Cómo podemos medir el nivel de pureza de la muestra? Explica que significa la relación 260/280 y la 260/230. El nivel de pureza de una muestra de ADN se relaciona directamente con las absorbancias obtenidas en las longitudes de onda 260/280. La relación de la absorbancia a 260 y 280 nm (A260/280) se utiliza para evaluar la pureza de los ácidos nucleicos. Para el ADN puro, A260/280 se considera como ~1,8, pero se ha argumentado que se traduceen una mezcla de 60% de proteínas y 40% de ADN.4 La relación para el ARN puro A260/280 es de ~2,0. La relación de absorbancia a 260 nm frente a 280 nm se utiliza habitualmente para evaluar la contaminación por ADN de las soluciones proteicas, ya que las proteínas absorben la luz a 280 nm. 8. ¿Qué es un nanodrop? ¿Qué ventajas tiene usarlo vs el equipo que emplea cubetas de cuarzo? El funcionamiento del nanodrop se basa en el empleo de un sistema de retención de muestra que aprovecha la tensión superficial de dicha muestra para formar un puente líquido entre un pedestal inferior y un pedestal superior. Mediante ambos pedestales, se define un preciso paso óptico cuya longitud varía automáticamente con la concentración de la muestra, de esta manera, permite hacer mediciones en un rango muy amplio de concentraciones sin hacer diluciones, cosa que sería necesaria en el uso del equipo que utiliza celdas de cuarzo
9. ¿Qué otras técnicas existen para medir la cantidad de ácidos nucleicos? Descríbelas brevemente. - Análisis con marcador de colorante fluorescente: Este método alternativo para evaluar la concentración de ácidos nucleicos consiste en etiquetar la muestra con un marcador fluorescente, utilizado para medir la intensidad de los colorantes que se unen a los ácidos nucleicos. Este método es útil para los casos en los que la concentración es demasiado baja para evaluarla con precisión con el método espectrofotométrico y en los casos en los que los contaminantes que absorben a 260 nm impiden una cuantificación precisa mediante ese método. La ventaja de esta cuantificación es la mayor sensibilidad con respecto al análisis espectrofotométrico previamente mencionado. No obstante, este mismo aumento de la sensibilidad se produce a costa de un mayor precio neto por muestra y de un proceso de preparación de muestras más largo. 10. Describe brevemente por qué es necesario y útil medir la concentración de ácidos nucleicos. Es bastante útil al necesitar saber la pureza de una muestra que contenga ADN o ARN. Esto debido a que en muchos procedimientos es muy necesario que el ácido nucleico posea cierto grado de pureza o de concentración para un rendimiento óptimo de dicho proceso, asimismo, ver que no haya interferencia de proteínas o algún otro compuesto orgánico que haga el proceso más tedioso al momento de utilizar el ácido nucleico-
