¡Descarga Genómica funcional: Estudios de transcriptoma, exoma y interactoma - Prof. Mestres y más Apuntes en PDF de Biología Celular solo en Docsity!
Genòmica funcional
La genòmica funcional estudia a nivell de genoma la funció, l’expressió i la interacció dels productes gènics (són estudis genòmics que ens porten a intentar comprendre el funcionament del genoma).
- Transcriptoma: estudia la seqüència i patrons d’expressió de tots els transcrits. És l’estudi de tots els exons i tots els productes que es transcriuen. És important saber a on té lloc aquesta transcripció quan té lloc aquesta transcripció quina quantitat d’aquesta transcripció té lloc Un subapartat del transcriptoma és l’estudi de l’exoma, és a dir, l’estudi de tots els exons de l’organisme.
- Proteoma: estudia la seqüència i patrons d’expressió de totes les proteïnes. També ens fem les mateixes preguntes que abans: on es produeixen aquestes proteïnes en quin moment té lloc (quan) l’aparició de proteïnes en quina quantitat. També és important veure quin és el patró de degradació d’aquestes proteïnes.
- Interactoma: estudia el conjunt complert d’interaccions físiques entre proteïnes i segments de DNA, entre proteïnes i segments de RNA i entre proteïnes. Estudia com interaccionen els elements genètics; DNA, RNA, proteïnes... S’intenta veure com els àcids nucleics i proteïnes interactuen entre ells per dur a terme les funcionalitat de l’operó.
El DNA, a part de la regió codificant (gen), té una sèrie de seqüències en cis, tant davant com darrere del gen, que són per exemple promotors, enhancers, etc.
El RNA, clàssicament es classifica en tres tipus: mRNA, tRNA i rRNA; a partir del començament dels anys 90 es comença a veure que hi ha molts més tipus de RNA, hi ha una sèrie de RNA curts que intervenen en el procés de maduració de l’RNA precursor per donar lloc a l’RNA final, també hi ha els ribozims, que són molècules de RNA amb funció catalítica, aquests poden estar sols o bé poden formar complexos amb proteïnes, tot formant riboproteïnes. Darrerament s’han estudiat molt els microRNA, que són RNA de mida curta que el que fan és modular l’expressió gènica; molts d’ells s’uneixen específicament a uns RNAm de manera que bloquegen la traducció. També hi ha els dsRNA, DNA de doble cadena, que són un sistema defensiu i que també bloqueja l’expressió gènica.
Tècniques d’anàlisi del transcriptoma:
Microarrays de DNA per estudiar el transcriptoma: Tinc una sèrie de cèl·lules, i vull estudiar quins mRNA tenen, com ho faig? S’utilitza un xip de DNA: Xip de DNA: són mostres de DNA (de cadena senzilla) (gens coneguts A,B,C...) disposades en una sèrie de gotes microscòpiques unides a un suport de vidre (xip) de la mida d’un cubre-objectes. La tècnica es tracta de dipositar cadenes de RNA de les cèl·lules en aquest xip i mirar si és complementaria amb alguna de les ssDNA del xip. Així podrem descobrir si algun dels gens que hem dipositat en el xip s’està expressant en les nostres cèl·lules. Si algun dels RNA de les nostres cèl·lules és complementari a alguns dels gens del xip trobarem hibridació, si en canvi no troba cap cadena complementaria no farà hibridació. Es tracta d’una reconstrucció de la doble hèlix DNA-RNA. Un cop he determinat els gens dels xip que han hibridat amb algun RNA miro si en les meves cèl·lules s’està expressant aquest gen.
Un cop hem determinat la presència de certs mRNA amb aquesta tècnica hem de fer un salt de qualitat, ara utilitzarem la tècnica del Microarray.
d’expressió gènica al llarg del temps. Hi ha gens que estan actius sempre, i altres que estan actius només en certs moments del desenvolupament.
Anàlisi de l’interactoma
Prova del doble híbrid per estudiar l’interactoma
El que es vol veure en aquest cas es si dues proteïnes humanes, p.ex A i B interactuen per regular l’expressió gènica, volem veure si s’uneixen per donar lloc a un sistema de control de l’expressió gènica. Això es pot aconseguir mitjançant la prova del doble híbrid. El sistema del doble híbrid és una construcció d’enginyeria genètica del llevat. Proteïna GAL4 del llevat té dos dominis:
- Un d’unió al DNA que s’uneix a aquest pel punt d’inici de la transcripció (DU).
- Un d’activació, que activarà la transcripció, però que per si sol no pot unir-se al DNA (DA). Cal que els dos dominis estiguin propers per produir l’activitat transcripcional, regulen el color del llevat, de manera que per a que el llevat doni color DA i DU s’han d’unir al promotor.
El que fem es introduir les proteïnes A i B en un plasmidi cada una i cada una junt amb una proteïna DU o DA respectivament, de manera que un plasmidi donarà lloc a una proteïna DU-A i l’altre a DA-B.
Si les proteïnes A i B interactuen, DU i DA es podran unir i juntes podran interaccionar amb el promotor activant l’activitat transcripcional i donant color al llevat. Per tant; Si A i B s’uneixen veurem color en el llevat
Si A i B no s’uneixen no veurem color en el llevat, ja que DU i DA estaran separats i no podran activar el promotor.
Tot això es construeix per enginyeria genètica; es fan plasmidis que donin aquestes proteïnes mixtes.
Immunoprecipitació de la cromatina
Aquesta es una altre tècnica per a l’anàlisi de l’interactoma. Les interaccions proteïna- DNA són molt importants per la correcta expressió gènica, per a estudiarles s’utilitza aquesta tècnica ChIP (chromating immunoprecipitation).
El que vull esbrinar es quina seqüència del DNA s’uneix a una certa proteïna. Per això se segueixen un seguit de passos que es poden observar en la imatge de sota:
- Sobre el DNA hi trobem moltes proteïnes unides, però ens interessa estudiar una en concret. Aïllo la seqüència que m’interessa.
- Es degrada el DNA de manera que el que no està cobert amb proteïnes es degradi, i només quedi el que esta protegit per proteïnes.
- Ja que conec la proteïna que vull estudiar la puc triar afegint anticossos concrets contra aquesta proteïna. La fico en contacte amb l’anticòs i aquest s’uneix específicament a la proteïna.
Genètica inversa
L’interactoma també es pot estudiar per genètica inversa.
El que hem fet fins ara és genètica directa, que tracta d’avançar en aquesta direcció:
Mirar fenotip com es transmet? quin gen controla aquest fenotip? fer un mapa genètic.
Acabem sabent quins gens controlen els caràcters que estic estudiant, on es troba i finalment l’acabem seqüenciant.
La genètica inversa, en canvi, tracta de partir de la seqüència. Trobem una seqüència conservada i mirem que és el que fa aquesta seqüència, quina funció té, si dóna un fenotip o no... Es tracta de deduir les funcions a partir de la seqüència.
Segons el power A partir d’una molècula coneguda (seqüència de DNA, un mRNA o proteïna), s’altera aquesta per valorar el paper del producte gènic normal en l’organisme. Hi ha diferents aproximacions:
- Mutagènesi a l’atzar
- Mutagènesi dirigida
- Mutagènesi fenocopiat
- Mutagènesi a l’atzar
Es fan servir els mutàgens clàssics (radiacions o químics). Buscar el gen en el mapa. Només les mutacions que caiguin en la regió seleccionada s’estudien a nivell molecular. Cal cartografiar les noves mutacions.
Veure l’efecte de les mutacions i del gen normal.
*El que es fa és provocar mutacions, i es mira si per atzar, algun d’aquests mutants, està a la seqüència que vols estudiar, i si és així, mires quin efecte fenotípic a produït aquesta mutació sobre l’individu.
- Mutagènesi dirigida
En aquest cas el que es fa bàsicament és canviar una seqüència particular per la mateixa seqüència però mutada.
Només es pot fer en organismes model. Es tracta de substituir la còpia del gen normal per un mutant.
En espècies model podem canviar un gen (una seqüència normal) per un altre gen (una seqüència mutada) i miro què passa. Això és un fenomen particular de mutagènesi dirigida. [Recordem que les mutacions es donen a l’atzar].
- Mitjançant fenocopiat
Una fenocopia es defineix com un individu que presenta el mateix fenotip que el que és produït per una mutació coneguda, però que aquest individu no és mutant, és a dir, té el DNA normal. Un exemple d’això és el cas de la talidomida. La talidomida és un fàrmac que servia per treure el mareig a les dones que estaven embarassades. No obstant, quan neixien els nens tenien malformacions greus (els hi faltaven elements de les extremitats superiors). Els nens aquests no tenien canvis en el DNA, la talidomida no és un mutàgen. És un fàrmac que canvia el patró de l’expressió dels gens en el desenvolupament, però no altera el DNA. Hi ha mutacions que donen lloc al mateix fenotip, sense talidomida per tant, veiem que la talodomia es una fenocopia. Com fer una fenocòpia:
- Inteferència de RNA (RNAi) permet saber el patró d’expressió d’un gen L’RNAi és un mecanisme natural de protegir la cèl·lula del DNA aliè (quan detecta un DNA aliè el destrueix. Normalment és un sistema de defensa contra els virus). El que fem és simular un efecte invasiu: Tenim un gen A que fabrica un RNAm, i volem que el RNAi el destrueixi. El que fem per aconseguir-ho és simular un efecte invasiu, agafem seqüències conegudes i fem un RNAi (RNA de doble cadena). Aquest és complementari al RNAm del gen A i el destrueix, de manera que ens carreguem l’expressió del gen A. Així es pot descobrir el patró d’expressió del gen A. Segons el powerpoint: S’utilitza per inactivar un gen específic. Construir un RNAds (doble cadena) amb una seqüència homòloga a la del gen estudiat.
