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1. Extraer los gametos de las gónadas de rata
2. Identificar el tipo de ovocitos obtenidos.
3. Identificar la zona pelúcida y la corona radiada de los ovocitos.
4. Observar la interacción ovocito - espermatozoides
Fecundación
La fecundación o fertilización es un conjunto de procesos mediante el cual el gameto masculino y el gameto femenino, (ambos células haploides) se unen para formar una solo célula diploide llamada: huevo o cigoto, esta célula dará origen a un nuevo organismo. Fig. 1.
La fecundación en el humano es la unión del espermatozoide y del ovocito secundario y el lugar donde sucede es en la tubas u oviductos, específicamente en la zona de la ampolla.
Gametogénesis
La Gametogénesis es el proceso donde una serie de cambios en las células sexuales femeninas y las masculinas suceden para convertirse genética y morfológicamente en gametos maduros y de ese modo participar en el proceso de la fecundación. La gametogénesis se divide en cuatro fases:
- Migración de las células germinales primordiales (CGP).
- Mitosis de la CGP, aumento del número de células (proliferación).
- Meiosis, para la reducción del número de cromosomas.
- Maduración estructural y funcional de los ovocitos y los espermatozoides.
En la quinta semana del desarrollo las CGP migran hacia a los primordios gonadales, durante su camino proliferan de manera lenta y una vez que llegan a los rebordes gonadales comienzan su proliferación rápida, aumentando su
Interacción de gametos
Objetivos
M. en B.E. Zapata Gómez Estrella, López Carrizosa María Fernanda Suárez Bautista Kristopher David, Arrieta Cardeña Antonio Arturo
Práctica 5
Interacción de Gametos
Figura 1. Unión del ovocito secundario y el espermatozoide para originar al cigoto. (Imagen propiedad intelectual del Departamento de Embriología FMBUAP.
número de unos cientos a millones. La gónada embrionaria junto con sus CGP se transformará en un ovario ó un testículo de acuerdo a la carga cromosómica que está determinada en el embrión. La Meiosis es diferente en las CGP femeninas y masculinas, mientras en la mujer las células germinales mitóticamente activas, ahora llamadas: ovogonias , la Meiosis I comienza en el ovogonias desde etapas tempranas del desarrollo; en el varón, las CGP ahora llamadas: espermatogonias, realizan la Mitosis en el testículo embrionario y se mantiene a lo largo de la niñez, mientras que la Meiosis comienza hasta la pubertad.
Ovogénesis y
Foliculogénesis
La ovogénesis es la maduración de la ovogonia hasta la formación de un ovocito secundario, listo para ser fecundado. Es un proceso largo y lento que inicia desde la etapa fetal y se detiene hasta la menopausia. La ovogonia comienza la primera división meiótica, entre el séptimo y noveno mes de desarrollo y se le denomina: ovocito primario , este es rodeado por células epiteliales del ovario llamadas: células foliculares, que establecen una estrecha relación con el ovocito, por medio de las prolongaciones citoplasmáticas que emiten las células foliculares. Al conjunto del ovocito y sus células foliculares se le denomina: folículo. El desarrollo de los folículos es lo que se denomina foliculogénesis. Ambos procesos ovogénesis y foliculogénesis transcurren al mismo tiempo y están íntimamente relacionados.
Cuando se inicia la primera división meiótica, el ovocito detendrá su división en la Profase I, en la subfase de diploteno y se dirá que el ovocito está en estado dictiado (o en fase de dictioteno). Esta detención se le llama: periodo de stop o primer arresto meiótico , esta detención es debido a la estrecha comunicación entre el ovocito las células foliculares lo que permite el intercambio de distintas moléculas como: el factor inhibidor de la meiósis donde se involucra al AMPc. A menos que degeneren todos los ovocitos primarios (aproximadamente 400 000 en el nacimeinto) permanecerán dictiados hasta la pubertad, donde su número se reducirá a 40 000 aproximadamente y solo serán ovulados de 300 a 400 a lo largo de la vida de la mujer. Los ovocitos que no maduran y los que quedan después de la menopausia experimentan una degeneración llamada: atresia.
Cuando el ovocito primario está rodeado por una monocapa discontinua de células foliculares aplanadas se le llama: folículo primordial. Antes del nacimiento las células foliculares proliferaran adquiriendo forma cúbica y la monocapa se convierte en un estrato, formando una o varias capas continuas, entonces el folículo primordial pasa a ser un folículo primario. Fig.2.
Figura 4. El proceso de ovogénesis, donde se obtiene un ovocito secundario y un cuerpo polar. Cuando el ovocito secundario es fecundado se convierte en óvulo y libera otro cuerpo polar (sumando 3 cuerpos polares por la división del primer cuerpo polar). (Imagen propiedad del Departamento de Embriología FMBUAP).
Figura 3. Desarrollo de la foloculogénesis y contunuación de la meiósis del ovocito por la influencia hormonal. (Imagen propiedad del Departamento de Embriología FMBUAP).
Espermatogénesis
Al igual que la gónada femenina, el desarrollo embrionario de la gónada masculina, el testículo , inicia con la llegada de las CGP que se convertirán en espermatogonias y la gónada primitiva se convertirá en el testículo. A diferencia de la ovogénesis el proceso de espermatogénesis no inicia en etapa embrionaria sino hasta la pubertad, con la influencia de las gonadotropinas y se mantiene a lo largo de toda la vida del varón. En un inicio el testículo contiene cordones sexuales, que en la pubertad se trasforman en conductos que forman una luz interna a largo de ellos denominándose ahora como: conductos o túbulos seminíferos. En estos conductos se encuentran las espermatogonias y las células nodrizas o células de Sertoli y fuera de los conductos están las células intersticiales o de Leydig , las cuales, sintetizan Testosterona.
Las células de Sertoli se originan del epitelio testicular y tienen extensiones citoplasmáticas que permiten alojar a las espermatogonias y a todo su linaje celular, permitiendo que estas alcancen la madurez morfológica. Entre las funciones principales de las células de Sertoli son:
- Sostenimiento y nutrición de las espematogonias y a todo su linaje celular.
- Mantenimiento y coordinación de la espermatogénesis.
- Formar y mantener la barrera hematotesticular. 4. Fagocitar los cuerpos residuales de las células espermáticas. 5. Producción de hormonas (estrógenos e inhibina). 6. Secretar el factor inhibidor mulleriano (MIF) durante la etapa embrionaria. 7. Secretar la proteína transportadora de andrógenos (ABP).
En la pubertad por la influencia de la Gonadotropinas, la espermatogonia inicia la Meiosis I, y se convierte en un espermatocito primario , terminando la primera división meiótica y originando 2 espermatocitos secundarios. Después al término de la Meiosis II se obtendrán 4 espermátidas, la cuales tienen que pasar por un proceso de maduración morfológica llamada: espermiógenesis ó espermioteliósis para dar origen a los espermatozoides. Fig.5. Los cambios que ocurren en la espermiógenesis son:
Se da la compactación del núcleo y de su material genético (las histonas se cambian por protaminas). Se reorganiza el citoesqueleto. El complejo de Golgi, en el extremo apical forma al acrosoma y el centriolo distal en el extremo opuesto, forma al flagelo. Las mitocondrias se disponen en la porción más proximal del flagelo alrededor del cuello, formando la parte intermedia o vaina mitocondrial. Se elimina el exceso de citoplasma (cuerpo residual).
El ovocito se encuentra rodeado por su membrana, el espacio perivitelino, la zona pelúcida y la corona radiada.
Corona radiada: Células foliculares que rodean al ovocito, enlazadas entre sí por una matriz intercelular, compuesta de proteínas y abundantes puentes de ácido hialurónico. Zona Pelúcida: Es una matriz extracelular formada por glucoproteínas que rodea al ovocito y se encuentra entre la corona radiada y el espacio perivitelino. Las glucoproteínas que la componen son: ZP 1 , ZP 2 , ZP 3 , ZP 4.
Una vez que se encuentran ambos gametos, el espermatozoide debe atravesar las capas que rodean al ovocito para lograr fecundarlo. Para ello, el espermatozoide con movimientos propios y la liberación de la enzima hialuronidasa del acrosoma , le permite romper las uniones entre las células de la corona radiada para separarlas y transitar entre ellas hasta llegar a la zona pelúcida. Una vez logrado esto, deberá librar a la zona pelúcida para continuar su trayecto, para esto el espermatozoide requiere expresar en su membrana externa el receptor para ZP 3 , pues es esta glucoproteína de la zona pelúcida que actúa como su ligando permitiendo así la unión de ambos. Esta unión cuenta con alta especificidad para cada especie, por este motivo no es posible fecundar gametos de especies diferentes. La unión e interacción entre espermatozoide y la zona pelúcida desencadenará la reacción acrosómica. La reacción acrosómica consiste en la fusión de su membrana plasmática con la membrana externa del acrosoma, provocando que posterior a la reacción,
los puntos de fusión se rompan y se libere a través de ellos el contenido enzimático del acrosoma. Esto facilita el paso del espermatozoide por la zona pelúcida, evento favorecido por la acción de la acrosina. Al final de la reacción, la membrana acrosómica interna es ahora quien recubre la cabeza del espermatozoide, fusionándose en su base con el remanente de la membrana plasmática postacrosómica y formando el segmento subecuatorial. En cuanto el espermatozoide logra atravesar la zona pelúcida y cruzar el espacio perivitelino, sucede el contacto entre ambos gametos. La unión de los gametos ocurre entre la membrana plasmática del ovocito secundario y la membrana postacrosómica del espermatozoide esta mediada por proteínas y moléculas como las que presenta el espermatozoide en la región subecuatorial, fertilina y ciritestina , que se unen a la molécula integrina -6 y proteína CD9 ubicadas en la membrana del ovocito. Después de la unión entre los gametos, el contenido del espermatozoide (cabeza, pieza media y cola) se deposita en el interior del ovocito, en tanto que su membrana plasmática se integra a la membrana plasmática del ovocito para formar una membrana única. En este momento tienen lugar reacciones que impiden la entrada de más de un espermatozoide (polispermia ó poliespermia). Cuando se une el contenido genético de ambos gametos se origina una sola célula, el cigoto.
Bloqueos de la Polispermia
Cuando un espermatozoide ha fecundado ya al ovocito secundario, es necesario que ocurran mecanismos de bloqueo para evitar que otro u otros espermatozoides puedan ingresar al mismo. Los mecanismos esenciales son dos: el bloqueo rápido o cambio de polaridad de la membrana del ovocito y el bloqueo lento que incluye a la reacción cortical y la reacción de zona.
Bloqueo Rápido: Este sucede inmediatamente después de la fusión de los gametos, consiste en la despolarización de la membrana plasmática del ovocito pasando de un voltaje de -70 mV a +10 mV, la cual tarda en propagarse por toda ella de 1 - 3 segundos y su efecto dura aproximadamente 5 minutos. Este cambio de voltaje modifica a los receptores de espermatozoides en la membrana del ovocito, inactivándolos e impidiendo así la unión de más de un espermatozoide.
Bloqueo Lento: Consiste en el ingreso de iones calcio al interior del ovocito, de tal forma, que los gránulos corticales intracelulares ubicados en la cercanía de la membrana plasmática se fusionen con esta última, liberando su contenido enzimático hacia el espacio perivitelino ( reacción cortical ) para alcanzar a la zona pelúcida y actuar sobre ella, inhibiendo a los receptores ZP3, y provocando un cambio en la estructura de la misma endureciéndola ( reacción de zona ). Fig.6.
Mediante estos mecanismos se evita que más de un espermatozoide fecunde al ovocito. Sin embargo, puede suscitarse una dispermia , esto es la fecundación de
un ovocito por dos espermatozoides, situación que es incompatible con la vida.
Una vez que sucede la fecundación ocurren varios eventos como consecuencia de esta. Estos eventos son:
- Se reanuda el metabolismo y se termina la segunda división meiótica del ovocito.
- Se expulsa el segundo cuerpo polar.
- Se forman los pronúcleos masculino y femenino.
- Se restablece la diploidía celular.
Figura 6. Proceso de fecundación, desde el encuentro entre los gametos, la reacción acrosómica y la anfimixis. (Imagen propiedad del Departamento de Embriología FMBUAP).
Conforme avanza al interior del útero, el sincitiotrofoblasto va destruyendo glándulas y vasos sanguíneos formando espacios y lagunas que se llenan sangre materna y otros elementos proteicos, por otro lado, alrededor del citotrofoblasto, rodeado a su vez por el sincitiotrofoblasto, se observa un desarrollo proliferativo de células propias del trofoblasto para producir vellosidades coriónicas. Entre el 8º y el 10º día, el embrión en formación ha penetrado por completo el endometrio y se inicia la regeneración del tejido endometrial en la zona por la cual se implantó, esto a manera de restituir la continuidad del epitelio y mantener totalmente resguardado en su interior al embrión; dicho proceso culmina entre el 12º y 14º día aproximadamente.
Infertilidad y Esterilidad La infertilidad indica una dificultad para concebir o mantener un embarazo al término y no es siempre sinónimo de esterilidad, la cual es definida por la OMS como una enfermedad del sistema reproductivo, caracterizada por la incapacidad de lograr un embarazo clínico después de 12 meses o más de tener relaciones sexuales sin protección.
Existen una gran variedad de causas de esterilidad y pueden ser de factor femenino, masculino, o incluso por ambas partes. Es importante conocer cada una de las alteraciones que pueden estar implicadas en la imposibilidad de lograr la concepción.
Factor Masculino
Calidad espermática.
Como se vio anteriormente en la Práctica 3, las características macro y microscópicas del semen son realmente importantes durante el trayecto de los espermatozoides a través del tracto sexual femenino y sobre todo, para lograr la fertilización del ovocito, es por eso, que cualquier alteración en la calidad espermática puede traer complicaciones para lograr un embarazo. Es importante mencionar que existe un defecto espermático que consiste en la fragmentación del ADN, la cual es causada por edad paterna avanzada o factores externos como el tabaquismo, la radiación, las infecciones recurrentes, la quimioterapia, entre otras. La falta de integridad en el material genético puede representar una causa de esterilidad que no es evaluable durante la espermatobioscopía o seminograma,
Figura 7. A) la estructura del blastocisto inmerso aun en la zona pelúcida, B) muestra el inicio de la eclosión por el polo embrionario, C) se muestran los vestigios del ovocito secundario vacío, C) blastocisto eclosionado. (Imagen propiedad del Departamento de Embriología FMBUAP).
sino mediante un análisis de la estructura de cromatina específica (SCSA).
Factor Femenino
Factor hormonal-ovárico
Existen muchos factores capaces de alterar la ovulación, entre ellos, las anomalías en el eje hipotálamo-hipófisis- ovario representan al mayor grupo. A continuación se mencionan las enfermedades endócrinas más comunes que causan infertilidad: Hiperprolactinemia. Altas cantidades de la Prolactina (PRL) secretada por la adenohipófisis, altera la secreción pulsátil de la GnRH produciendo a su vez manifestaciones como: anovulación y amenorrea. Es importante valorar también la función tiroidea en estos casos, debido a que, la producción excesiva de PRL se asocia también al hipotiroidismo. Síndrome de ovario poliquístico. Este padecimiento es considerado como la causa más frecuente de anovulación por el desequilibrio hormonal que presenta. Se manifiesta como una amplia variedad de signos y síntomas asociados con la resistencia a la insulina, la obesidad, el acné y el hirsutismo. Hiperplasia suprarrenal tardía. Se presenta como un cuadro de hiperandrogenismo que se manifiesta con una pubarca prematura, la estatura baja, la oligomenorrea o la amenorrea, el hirsutismo y los trastornos de la fertilidad, sin embargo, algunas mujeres afectadas pueden lograr el embarazo sin necesidad de tratamiento farmacológico. Amenorrea hipotalámica. Esta se asocia al estrés en mujeres de bajo peso y representa una disminución en la secreción de la GnRH con la subsecuente
anovulación e irregularidades en el ciclo. Es común en atletas y pacientes con trastornos alimenticios. Falla ovárica prematura. Se define como el cese de la función ovárica antes de los 40 años. Se ha relacionado con un número deficiente de folículos y de origen autoinmune. En algunos casos existe recuperación de la fertilidad mediante terapia hormonal sustitutiva con estrógenos.
Defectos uterinos.
Existen diversas afecciones que pueden dificultar tanto la implantación del blastocisto como la permanencia del producto. Estas pueden ser congénitas o adquiridas y en su mayoría, se pueden tratar. Anomalías congénitas. Estas alteraciones pueden ser de varios tipos, tales como: el útero bicorne, el unicorne y el didelfo, así como la presencia de tabiques uterinos los cuales pueden representar un obstáculo para llevar a cabo el embarazo de manera satisfactoria. La mayor parte de estos defectos pueden resolverse mediante intervenciones quirúrgicas. Tumores. La neoformación benigna más común a este nivel son los leiomiomas, los cuales, según su localización y tamaño pueden ocupar y deformar la cavidad uterina interfiriendo así con la implantación. Pólipos. Esta afección es relativamente común en las mujeres infértiles. Se trata de proyecciones fibrosas de número y tamaño variable, las cuales producen sangrado uterino anormal como principal síntoma. Se ha demostrado que la extracción de pólipos incluso menores a 10 mm ha mejorado la tasa de fertilidad. Síndrome de Asherman. Esta patología se caracteriza por la formación de adherencias intrauterinas mejor
Inseminación artificial
Es un procedimiento relativamente sencillo y utilizado como primera instancia; los gametos masculinos son seleccionados con respecto a su movilidad y su morfología y son preparados para depositarse dentro del tracto reproductor femenino sin necesidad del coito. La forma de inseminación más utilizada es la intrauterina, aunque también es posible colocar la muestra a nivel de la vagina o el cérvix, intraperitoneal e intrafolicular. Este proceso puede realizarse durante ciclos ováricos naturales o mediante la estimulación ovárica controlada, lo que permite una mayor tasa de éxito, pero a su vez incrementa el riesgo de un embarazo múltiple. Según el origen de los espermatozoides, la muestra puede ser clasificada en homóloga o conyugal y heteróloga o del donante. El primer espécimen se maneja comúnmente en fresco, mientras que el del donante casi siempre es congelado. Este método se indica cuando existen impedimentos fisiológicos y anatómicos para lograr la fecundación, como las hipospadias, la eyaculación retrógrada, los trastornos neurológicos, las alteraciones del seminograma del lado masculino, así como, las anomalías cervicales o del moco, la disfunción ovulatoria, la endometriosis, entre otras alteraciones del lado femenino.
Fertilización in vitro
Este método tiene como objetivo lograr la fecundación del ovocito de forma extracorpórea para posteriormente, recolocar al embrión dentro del útero en espera de su correcta implantación. La efectividad del procedimiento depende
del éxito obtenido en las distintas fases del siguiente ciclo:
1. Hiperestimulación ovárica controlada Existen diferentes esquemas que dependen de la respuesta ovárica de la paciente. El manejo más común es mediante un agonista de la GnRH combinado con gonadotropinas como la FSH, los cuales previenen el pico de LH que condiciona la ovulación. 2. Obtención de ovocitos Se lleva a cabo por la aspiración folicular transvaginal guiada por ultrasonido. El momento ideal para realizarse es antes de la ovulación espontánea y es conveniente extraer de 10 a 20 ovocitos. En algunos casos, este proceso necesita un manejo laparoscópico. 3. Inseminación Los espermatozoides previamente capacitados son colocados en un medio adecuado, después se introduce el ovocito en espera de la fertilización espontanea, la cual ocurre en pocas horas. 4. Transferencia embrionaria Se realiza de 3-5 días posteriores a la fertilización, preferentemente en etapa de blastocito. El objetivo es depositar sin trauma, el número de embriones necesarios obtenidos mediante la fertilización in vitro , en el fondo del útero mediante la inserción de un catéter intravaginal guiado por ultrasonido. El número de embriones a transferir depende de distintos factores como la edad de la paciente y la calidad embrionaria, sin embargo, no debe excederse en número de tres, ya que siempre existe el riesgo de un embarazo múltiple. Entre los factores que pueden dificultar la implantación del blastocisto, se
encuentra la receptividad uterina, la calidad del embrión y la eficiencia del procedimiento. Las indicaciones para realizar este procedimiento son: la infertilidad por la edad materna avanzada, las alteraciones de las tubas uterinas, la obstrucción tubárica bilateral (OTB) y la endometriosis; por el lado paterno se encuentran: las alteraciones anatómicas ya mencionadas así como una disminución en el conteo espermático.
Inyección intracitoplasmática
Este procedimiento es el más utilizado para tratar la infertilidad por factor masculino (azoospermia, teratozoospermia, astenozoospermia) Consiste en inyectar un espermatozoide en el ovocito a través de la zona pelúcida y la membrana celular. La técnica de obtención de espermatozoides más utilizada es la aspiración percutánea, donde por medio de una aguja, se punciona sobre la cabeza del epidídimo o en el testículo. Este procedimiento debe ser realizado bajo anestesia por un urólogo especializado. Otras técnicas incluyen la extracción quirúrgica, donde se realiza una incisión escrotal y la disección del epidídimo para permitir la aspiración; este proceso se realiza únicamente cuando los otros métodos han fallado.
Se entregará a cada mesa un ovario ó testículo de rata.
Una vez realizado esto, colocar en la caja de Petri los gametos obtenidos y observar la interacción al microscopio.
- Revisa un artículo relacionado con el tema "Reproducción asistida " de no más de 5 años de antigüedad y realiza un ensayo de al menos 200 palabras. Deberá ser referenciado mediante formato APA.
- Realiza una descripción detallada de lo que observaste al microscopio
Disección de testículo y obtención de gametos Disección de ovario y obtención de gametos
Identificar el cuerpo del testículo, el epidídimo (cabeza, cuerpo y cola), el conducto deferente. Realizar un corte superficial longitudinal con bisturí en la cola del epidídimo asegurándose de haber seccionado un buen número de conductillos. (Utilizar la lupa en caso necesario) Inyectar 1 ml de sol. NaCl a través del conducto deferente en dirección a la cabeza del epidídimo, el fluido deberá salir a través de la zona que hemos seccionado anteriormente y deberá ser recolectado en un tubo de ensayo, vaso de precipitado o una caja Petri. En caso de que la solución no haya alcanzado la zona deseada, se deberá repetir el paso anterior pero en un sitio más proximal al epidídimo. Colocar en una laminilla 10μl de la muestra recolectada, poner cubreobjetos y observar al microscopio con el objetivo de 40x en búsqueda de los espermatozoides.
Se entregarán ovarios de rata en solución salina. En caso de existir exceso de tejido que nos impida identificar los folículos, se deberá desbridar cuidadosamente. Observar los folículos; en algunas ocasiones podemos encontrar el cuerpo lúteo. Los folículos aptos para ser aspirados serán extraído con ayuda de las agujas.
Procedimiento
Reporte
- Carlson BM. Embriología Humana y Biología del Desarrollo. 5ª ED. ELSEVIER;
- Capítulo 2: Transporte de los gametos y fecundación. pp. 24 - 35.
- Arteaga M, y García-Peláez I. Embriología humana y biología del desarrollo. Panamericana; 2013. Capítulo 6: Fertilización: el inicio de una nueva vida. pp. 69 - 78.
- Barbara L. Hoffman, MD, et al. (2012). Williams Ginecología. 2nd ed. México: Mc Graw Hill, pp.517-549.
- University of Alberta. (2014). Assisted Reproductive Technologies (ARTs). The Alberta Health Technologies
- Moran, C. (2006). Factor ovárico endócrino. Revista peruana de ginecología y obstetricia. 52(1):70-
- Valencia, I., Valencia, P., & Ordoñez, S. (2006). Evaluación actualizada y manejo práctico del factor cervical de infertilidad. Revista peruana de ginecología y obstetricia. 52(1):80- Kambly Ambe, A y col.(2012). Consenso Nacional Mexicano de Reproducción Asistida.
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Bibliografía
