Introducción a genómica | Apuntes de Genómica

Karen Vielma J

Karen Vielma Crespo

3er Semestre (Enero-Mayo)

[email protected]

TEMA 1:LA ERA DE LAS CIENCIAS OMICAS

1990 - Nace el Proyecto Genoma Humano (PGH) público

Presupuesto: 3000 millones de U$S

Tiempo estimado: 15 años

Genoma fue secuenciado en sus 3.200 millones de nucleótidos

Esfuerzo internacional liderado por la organización del genoma humano (HUGO)

Director: James Watson y reemplazado por FRANCIS COLLLIS en 1993.

Participantes: EEUU, UK, Alemania, Francia, Japón, China Australia, Nueva Zelanda.

MÉTODO DE SANGER: Secuenciación jerárquica / cromosome walker: Tomaban pedazo de el

ultimo fragmento y lo usaban como primer para uno los fragmentos.

1995- Celera (iniciativa privada)

PGH- independiente

Director: Craig Venter

Técnica utilizada: whole genome shot gun (mucho más rápida pero un poco menos

precisa)

MÉTODO DE SANGER/ POR FUERZA O POR PERDIGONAZO/ SHOT GUN: él crea el programa

para ordenar el genoma. En cada fragmento solapa los fragmentos que tienen secuencias

idénticas.

• 3200 millones de pares de bases forman genes, repartidos entre los 23 pares de

cromosomas.

• 90% 2950 mpb eucromatina (menos compacta, en transcripción activa)

• 10% 250 mpb heterocromatina (poco activa, muy compacta)

Karen Vielma J

• 70% extragénicos (50% secuencias repetitivas, algunas dispersas y otra en tándem

• 30% asociado a genes

• (1-2%) 1.8% codifica para proteínas (exoma)

• El exoma es lo primero que se secuencia en un paciente por $$$$

• Pude secuenciarse exoma clínico: conjunto de exones que ya se sabe que están

asociados a una patología.

• Sólo 1,250 letras separan una persona de otra. = 99.9% del genoma es igual.

• 223 genes humanos que resultan similares a los genes bacterianos.

• Se identificaron variaciones en los genes que se conocen como polimorfismos

nucleótidos únicos (SNPs). (1% de la población)

• SNPs dependen de que la persona sea sensible o no a un determinado fármaco o la

predisposición a sufrir una determinada enfermedad.

• No tener más genes nos hace más complejos.

• Bases de datos públicas: NATIONAL CENTER BIOTECHNOLOGY INFORMATION (NCBI)

Proyectos derivados:

ENCODE: busca entender para que se su el 70% de extragénicos

HapMap: mapeo de los SNIPs

1,000 genomas: entender las variaciones entre individuos. (personas sanas)

100,000 genomas: Enfermedades raras y distintos tipos de cáncer (70,000 personas/

30,000 de cáncer)

In silico: en la computadora extragénicos

BIOINFORMÁTICA

Estudios interdisciplinares que requieres el uso o el desarrollo de diferentes técnicas que

incluyen informática, matemática a plicada, estadística, inteligencia artificial, química y

bioquímica para solucionar problemas, analizar datos, o simular sistemas o mecanismos,

todos ellos de índole biológico.

Transcriptómica (la ciencia de lo que parece que está ocurriendo)

Proteómica (la ciencia de lo que hace que ocurra)

Metabolómica (la ciencia de lo que ha ocurrido y está ocurriendo)

Epigenética (la ciencia de lo que a veces, no deja que ocurra)

Metagenómica (la ciencia de lo que nuestros microorganismos dejan que ocurra).

TRANSCIPTÓMICA

• Es el estudio del conjunto de ARN (ARNr, ARNt, ARNm, ARNi, miARN) que existe en una

célula, tejido u órgano (sistema).

• Los proteomas y los transcriptomas (muy variables): muestran que genes se esta

expresando en un momento dado.

• Transcriptomas de: células cancerosas (carcinogénesis) y de las células madre

(diferenciación celular)

• Transcriptóma es dinámico: depende del ambiente

• 100.000 transcriptomas por splicing alternativo.

PROTEÓMICA (Marc Wilkins en 1994)

Vista previa parcial del texto

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Karen Vielma Crespo 3er Semestre (Enero-Mayo) [email protected] TEMA 1:LA ERA DE LAS CIENCIAS OMICAS 1990 - Nace el Proyecto Genoma Humano (PGH) público Presupuesto: 3000 millones de U$S Tiempo estimado: 15 años Genoma fue secuenciado en sus 3.200 millones de nucleótidos Esfuerzo internacional liderado por la organización del genoma humano (HUGO) Director: James Watson y reemplazado por FRANCIS COLLLIS en 1993. Participantes: EEUU, UK, Alemania, Francia, Japón, China Australia, Nueva Zelanda. MÉTODO DE SANGER: Secuenciación jerárquica / cromosome walker: Tomaban pedazo de el ultimo fragmento y lo usaban como primer para uno los fragmentos. 1995 - Celera (iniciativa privada) PGH- independiente Director: Craig Venter Técnica utilizada: whole genome shot gun (mucho más rápida pero un poco menos precisa) MÉTODO DE SANGER/ POR FUERZA O POR PERDIGONAZO/ SHOT GUN: él crea el programa para ordenar el genoma. En cada fragmento solapa los fragmentos que tienen secuencias idénticas.

3200 millones de pares de bases forman genes, repartidos entre los 23 pares de cromosomas.
90% 2950 mpb eucromatina (menos compacta, en transcripción activa)
10% 250 mpb heterocromatina (poco activa, muy compacta)
- 70% extragénicos (50% secuencias repetitivas, algunas dispersas y otra en tándem
- 30% asociado a genes
- (1-2%) 1. 8 % codifica para proteínas (exoma)
- El exoma es lo primero que se secuencia en un paciente por $$$$
- Pude secuenciarse exoma clínico: conjunto de exones que ya se sabe que están asociados a una patología.
- Sólo 1,250 letras separan una persona de otra. = 99.9% del genoma es igual.
- 223 genes humanos que resultan similares a los genes bacterianos.
- Se identificaron variaciones en los genes que se conocen como polimorfismos nucleótidos únicos (SNPs). (1% de la población)
- SNPs dependen de que la persona sea sensible o no a un determinado fármaco o la predisposición a sufrir una determinada enfermedad.
- No tener más genes nos hace más complejos.
- Bases de datos públicas: NATIONAL CENTER BIOTECHNOLOGY INFORMATION (NCBI) Proyectos derivados: ENCODE : busca entender para que se su el 70% de extragénicos HapMap: mapeo de los SNIPs 1,000 genomas: entender las variaciones entre individuos. (personas sanas) 100,000 genomas: Enfermedades raras y distintos tipos de cáncer (70,000 personas/ 30,000 de cáncer) In silico: en la computadora extragénicos BIOINFORMÁTICA Estudios interdisciplinares que requieres el uso o el desarrollo de diferentes técnicas que incluyen informática, matemática aplicada, estadística, inteligencia artificial, química y bioquímica para solucionar problemas, analizar datos, o simular sistemas o mecanismos, todos ellos de índole biológico. Transcriptómica (la ciencia de lo que parece que está ocurriendo) Proteómica (la ciencia de lo que hace que ocurra) Metabolómica (la ciencia de lo que ha ocurrido y está ocurriendo) Epigenética (la ciencia de lo que a veces, no deja que ocurra) Metagenómica (la ciencia de lo que nuestros microorganismos dejan que ocurra). TRANSCIPTÓMICA
Es el estudio del conjunto de ARN (ARNr, ARNt, ARNm, ARNi, miARN) que existe en una célula, tejido u órgano (sistema).
Los proteomas y los transcriptomas (muy variables): muestran que genes se esta expresando en un momento dado.
Transcriptomas de: células cancerosas (carcinogénesis) y de las células madre (diferenciación celular)
Transcriptóma es^ dinámico:^ depende del ambiente
100.000 transcriptomas por splicing alternativo. PROTEÓMICA (Marc Wilkins en 1994)

Estudio a gran escala de las estructura y función de las proteínas. Proteínas: componentes principales de las rutas metabólicas de las células. Proteínas sufren modificaciones postraduccionales. Modificaciones postraduccionales afectan tanto en la forma como la función de una proteína. Aumenta las isoformas = numero de proteínas. Proteoma es dinámico Genoma Proteoma Invariable Cambia de una célula en otra célula Cambia según las interacciones bioquímicas con el genoma y el ambiente (tiempo) 25.000 genes Expresión genera al menos unas 500.000 proteínas. Mecanismos como el splicing (corte y empalme) alternativo y a modificaciones post-traduccionales Métodos:

Espectrometría de masas
Métodos de fraccionamiento y separación de péptidos y proteínas como el 2D-PAGE (electroforesis de poliacrilamida de dos dimensiones)
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Ramas:
La proteómica de expresión: abundancia relativa de las proteínas y de sus modificaciones postranscripcionales.
La proteómica estructural: caracterización de la estructura tridimensional de las proteínas.
La proteómica funcional: localización y distribución subcelular de proteínas y de las interacciones que se producen entre las proteínas y otras moléculas con el fin de determinar su función. Aplicaciones:
Identificación^ de nuevos^ marcadores para el diagnóstico de enfermedades
Identificación de nuevos fármacos
Determinación de mecanismos moleculares involucrados en la patogenia de enfermedades
Análisis de rutas de transducción de señales El estudio y comparación sistemáticos del proteoma en diferentes situaciones metabólicas y/o patológicas permite identificar biomarcadores. Biomarcadores : proteínas cuya presencia, ausencia o alteración se correlaciona con determinados estadios fisiológicos. Ej: Cáncer: antígeno CA15- 3 (para el cáncer de mama), a-fetoproteína L3 (AFP L3) y la carboxiprotrombina (para el carcinoma hepatocelular) antígeno prostático (PSA) (para el cáncer de próstata) Human Proteomics Initiative que comenzó en el año 2000 tiene como objetivo registrar todas las proteínas conocidas y describir todas sus funciones. EPIGENÓMICA La conexión entre el medio ambiente y la expresión de nuestros genes. Depende de la organización de la cromatina y de las modificaciones que sufren las histonas.
Metilación de citocinas
Acetilación de histonas
Metilación de histonas
Fosforilación de histonas Incluye todos los procesos que alteran la expresión de genes sin cambiar la secuencia del ADN, dichos cambios se van a transmitir a las células hijas. Enfermedades multifactoriales relación con la exigentica. Perfil epigenómico: respuestas a los mecanismos asociados con la enfermedad alternativas de tratamiento introducir la Epidemiología Epigenómica METABÓLOMICA
Cataloga y cuantifica a las moléculas pequeñas que se encuentran en los sistemas biológico.
Metabolismo: proceso de conversión de energía de los alimentos en energía mecánica o calor. Subproductos del metabolismo = Metabolitos (bajo peso molecular como lípidos, azúcares, aminoácidos y vitaminas)
El metaboloma es una colección de todos los metabolitos en una celda en un momento determinado en el tiempo.
Se enfoca en: diseño de perfiles metabólicos y metabolitos de rastro digital. Métodos:
Cromatogramas
métodos estadísticos
Resonancia magnética nuclear (RMN)
La espectrometría de masas (MS). Funciones: Se puede utilizar para averiguar por qué algunas personas son más susceptibles a daño hepático por parte de ciertos fármacos. (MEDICINA PERSONALIZADA) Proporcione biomarcadores para estudiar la exposición a enfermedades y toxinas. Correlacionar los perfiles de metabolitos de fluidos y órganos con patologías, constitución genética y dietas.

Elementos:

Primer
ADN molde
ADN polimerasa
dNTPs
ddNTPs (marcados radioactivamente) en un o Tubo 1 (ddATP) o (^) Tubo 2 (ddCTP) o (^) Tubo 3 (ddGTP) o (^) Tubo 4 (ddTTP) Preparo un gel de agarosa. Pongo una placa radioactiva. Se lee y se obtiene la cadena sintetizada (complementaria) del gel y la tengo que traducir para obtener la molde (original), Marcador agregado a las 10:55 en Audio 2 1986 Leroy Hood y Lloyd Smith SECUENCIACIÓN AUTOMATICA
A cada ddNTp se le asigna un grupo químico (Fluoróforos o^ fluocromos)^ que emite una fluorescencia al ser excitado por un laser.
98% de confiabilidad
Se le coloca en un gel/ capilar que reúne los fragmentos y los lee la computadora.
La proyección de electroferograma o cromatograma. Tubo de ensaye
Molde DNA
4 dNTP
4 ddNTP
DNA pol + cofactores
2 Primers Heterocigoto en Sanger: emite las dos ondas de color Ej: posición 18 5' TGTG C/G ACCG 3'

INDEL: no sabemos la cadena mutada. La condición de salud se asocia con normalidad y la enfermedad se asocia con una mutación.

SANGER: se utiliza cuando se exactamente donde esta la mutación SECUENCIACIÓN MASIVA DE GENOMA (NGS)

Pirosecuenciación
Fase sólida Illumina
Ion proton
Nanapore Otros métodos para estudiar el ADN
PCR
PCR cuantitativa en tiempo real Sin PCR ninguna maquina podría identificar señales tan leves se necesita amplificar. Kary Mullis: PCR (polimerase chain reaction) 1983 comienzo Science, 20 dec. 1985 1993 gano Premio Nobel. Secuenciar un genoma es imposible mejor selecciono lo que necesito. Tengo que saber que fragmento de genoma quiero y tengo que conocer la secuencia para diseñar primer. PCR- NORMAL Primers foward y revers. Necesito un par de primer por fragmento. Los primers se pegan del lado 3' de la cadena para que se sintetice 5' a 3'. A partir del segundo ciclo aparecen amplicones (ADN ya seleccionado). A partir del tercer ciclo los amplicones se hacen más abundante que el ADN original.

Punto critico el ciclo 18 porque tiene menos ADN.
Esa muestra la diluyo otra ves 1 en 10. cant ct 1 14 0,1 18 0,01 22 Su paciente tiene 17 de carga viral. => entonces tiene entre 0,1 y 0, 0 1 pico gramos acorde a la tabla. Cuantificación absoluta: obtener un valor especifico (resultado con unidades) después de la curva de calibración. Cuantificar ele número de copias de un gen. DNA final (producto)= depende el numero de ciclo (n) y DNA inicial (T) => P = (2 ^n) * T Ciclo/ DNA A 1virus / 1ml

B

2 virus / 1ml

C

5 virus / 1ml 0 1 2 5 1 2 4 10 2 4 8 20 3 8 16 40 4 16 32 80 5 32 64 160 Ej: Si para pasar el umbral es 16 cual es ciclo critico. Tabla: A: 4, B: 3, C: 2 Saca el DNA inicial del paciente A Formula: 16= (2^4) * T T= 16 / 16 T= 1 Para validar que sí amplifiqué el DNA que quería se utiliza ANÁLISIS DE Tm (melting temperature). Sigo calentando después de la PCR. Tm: es el punto de inflexión en el cuál el 50% de fluorescencia inicial y que 50% del DNA no esta en doble cadena. Depende cuantos pares de citosinas y guaninas hay en el fragmento y como están distribuidas y que tan largo es el fragmento.

Punto de inflexión de Tm podemos saber si es heterocigoto y homocigoto por el número de picos (homocigoto 1 pico y heterocigoto 2 picos). Marcador agregado a las 48:48 en Audio 3 P/ 2^n= Cuantificación relativa: Video sobre PCR en tiempo real (= qPCR) usando sonda Taqman Quencher traga la luminiscencia del fluorocromo.

El amplicon se pega en medio de la secuencia que quiero amplificar.
La polimerasa sintetiza el DNA.
La Pol tiene función de la exonucelasa y rompe la sonda Taqman.
Se libera fluorescencia, lo que es indicador de traducción. No tengo que hacer Tm porque es más especifico.

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