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ENCODE/ Epigenómica
Proyecto ENCODE: (^) Distintos tipos de genes (^) Elementos regulatorios y epigenómica (^) Elementos repetidos Microbioma PGH: <2% del genoma codifica para proteínas ENCyclopedia Of DNA Elementes Objetivo: delinear todos los elementos funcionales codificados en el genoma humano. Elemento funcional: Segmento discreto (que se donde empieza y donde termina) del genoma que codifica para un producto definido (se transcribe a proteína o RNA no codificante) o muestra una firma bioquímica reproducible (reacción química constante ej: unión a proteínas o una estructura de la cromatina específica) ENCODE: estudiar dentro del genoma de referencia firmas bioquímicas (se repiten). Regiones de unión de factores de trancripción, la maquinaria transcripcional, y otras proteínas. o 87% secuencias especificas a factores de transcripción (TFSS). o 8,1% secuencias para DNA binding proteins. Sitios hipersensibles a ADNasa (DSH), y regiones con disminución de nucleosomas. o 2.890.000 DSH (sello de regiones reguladores de ADN) Regiones de modificación de histonas o Altamente variable según tipos de células. Metilación de ADN o En citosina, (dinucleótidos CpG), Represión (Epigenética o impronta) o Más metilación de DNA= cromatina menos accesible. o 96% de CpG: metilación diferencial según tipo celular Regiones del cromosoma que interactúan o Acetilación de histonas El 75% del genoma se transcribe (pero solo el 2% de traduce) ELEMENTOS FUNCIONALES Se puede transcribir en productos funcionales = GENES (GENCODE) CODIFICANTES
Mensajeros
DE RNA (no mensajero) miRNA snRNA (small nuclear splisosoma) rRNA tRNA snoRNA (procesamiento del RNA ribososmal) piRNA lncRNA (long no coding RNA )
ELEMENTOS CON FIRMA BIQUÍMICA
Composición química particular y repetitiva. Los estudia la Epigenómica. UNION DE PROTEINAS REGULADORES : secuencia de ADN intergénicas que interactúan con proteínas que tiene un efecto sobre los genes (^) Promotor (^) Enhacer (^) Silencers HIPERSENCIBILIDAD DNAsa Sitios eucromatizados que son más accesible para las DNAasa. (Si obtengo muchos fragmento es eu , si obtengo pocos fragmento es heterocromatina) Sitios accesibles para que se peguen proteínas por lo tanto también son de UNIÓN DE PROTEINAS REGULADORES. GENCODE:
20.697 genes codifican proteínas (media: 6,3transcripciones por splicing
alternativo por locus). 2,94% del genoma o 1,22 para el exoma.
11.2224 pseudogenes, (863 transcritos asociados con cromatina activa).
62% del genoma produce moléculas de ARN de secuencia larga (>200 nucleótidos).
7.053 RNA pequeños: 85% RNA pequeño nuclear (snRNA, ARN pequeño nuclear,
SNRNAs), micro ARN (miRNA) y ARN de transferencia (RNAt)
RNA LARGO
Ribosomal Mensajero Largo no codificante 21mil genes 3, 200 millones de pb SECUENCIAS REPETIDAS TANDEM Satelites Minisatelites Microsatelites (STR short tandem repeat) DISPERSOS LINES (Long interspace nuclear elementes) L1 se copia y salta L2 salta sin copiarse SINES (Short interspace nuclear elemnetes ) LTR /HERV
Pregunta tipo examen S e hizo un microarreglo y se observo Gen x esta sobrexpesando en el caso de enfermedad, sin embargo, al buscar la proteína en las células enfermas no están. El RNA mensajeros esta degradando por un miRNA. miRNAs y cancer
Parar sobrexpresión Que el gen no se traduce lo suficiente o epignetica pero tengo poco premiRNA Se transcribe correctamente pero existe una mutación (fase s ) y drosha ya no puede cortar. Que el miRNA se quede atrapado en el núcleo No sea reconocida por RISC Dicer no lo reconoce. No hay miRNA que pueda regular y genes de cancer. miRNA artificiales tienen que meterse al núcleo a través de proteínas (oligonucleotidos reversos) toxicidad porque ataca a muchos mensajeros. Aplicaciones: Micro arreglos de miRNA. Firmas moleculares en distintos tipos de cancer Subexpresión Asociados a tumorogenesis Sobreexpresion de miRNA Eucromatina Transcribe mucho Afinidad por drosha Se escapan más rápido del núcleo son más afines a risc o dicer Mensajeros de proteína antitumoral se pueden degradar. P De moléculas de adhesión. Hay inclusive miRNA de resistencia a quimioterapias. RNA de retrovirus al tumor para activar al sistema inmune.
Diagnóstico Pronóstico Respuesta a tratamiento Dianas terapéuticas Discovery set y varios que no tienen la enfermedad. RNA sec o miceoarreglos Buscar forma molecular Lo valido con un segundo grupo y solamente rtqpcr Pronóstico de repuesta a tx Lisis celular y tumor preclínico Firma molecular para encontrarla necesito de microarreglos (NGS) para miRNAs Para validar necesito un qRtPCR con un gen housekeeping. Si unos genes (menos de 100) de miRNA no es suficiente como marcador puedo hacer un microarreglo predeterminado (mas de 100). Se buscan los miRNA en el plasma y no se degradan porque salen en exosomas provenientes de células lisadas. (Recordar los miRNA's son especificos de cada tejido) MIROCULOS PCR anidada En cada poso pongo primers para miRNA específicos sacados de la literatura. Coloca la molécula de Sybergreen Si hay fluorescencia esta presente la enfermedad. lncRNA (RNA no codificante de cadena larga) Aproximadamente 13,000- 15,000 genes. Alrededor de 200 nt. Se transcribe, pero no se traduce. Reguladores de expresión. o Es complementario a genes dentro del ADN y se hibrida, así evitando su transcripción. Son reguladores transcripcionales (porque se da antes de que se transcriba). o Por otro lado, pueden pegarse cerca del promotor. Este Rna tiene afinidad por factores de transcripción por lo que induce la traducción del gen. Patrones de lncRNA pueden ser biomarcadores de una enfermedad, pero se degradan rápidamente.
Nota: Cromatografía de afinidad Esferas con poli T complementario a la poli A para atrapar los RNAm. Cromatografía de exclusión Filtran por tamaño los RNAs ENCODE y genes de RNA (Resultados) Más de 7000 genes para RNAs pequeños. 700 de miRNA 6,300 para: snRNA (small nuclear splisosoma) rRNA tRNA snoRNA (procesamiento del RNA ribososmal) piRNA Más de 15,000 para lncRNAs Al compara el patrón de miRNAs en tejidos enfermos que respondieron al tratamiento y que no respondieron al tratamiento. Se encontró que los que no responde hay un miRNA que esta subexpresado.
- ¿Cuál será el efecto a nivel de la cantidad de proteína? a.Proteína aumentada o sobre expresada. Sin embargo, al cuantificar la proteína en ambos tejidos no se encuentra diferencias significativas.
- Ese miRNA que falta en los tejidos no respondedores, ¿que puedo hacer? a.Nos sirve como biomarcador como pronostico al tx, pero no como diana terapeutica.
- Llega un px que tiene la enfermedad y, ¿quiero saber si le doy o no el tratamiento, que tecnica utilizó? a. Utilizó rtqPCR Pseudogenes
Existen tantos pseudognes como genes. Son restos evolutivos que aparecen por un error y permanecen. Estos errores pueden ser por virus, pero la gran mayoría son por duplicación del ADN. La mayoría son de DNA ribosomal. Acumulan mutaciones Pseudogenes duplicados: Tiene exones e intrones Error en la fase S Pseudogenes procesados o retropseudogenes: RNAm - retrotranascriptasa- cDNA- se pegó al genoma Solo exones Cola de poliAAA en una hebra y en la otra hebra cola de poliTTT *Sin embargo, existen genes duplicados como los citocromos que producen una metabolización de fármacos más pronta.
Utilidad Médica Gen PTEM produce una proteína tumor-supresor. Pseudogen PTEMP No UTR 3' Y 5' Si promotor Flanquean a los miRNAs para evitar inhibición de gen PTEM Marcadores de clasificación de subtipos de cáncer. Expresión de ciertos pseudogenes relacionada con pronostico.
Comparación de secuencias: Tx con enzima de restricción: Si la manera en corta la enzima cambia = no había metilación Secuenciación En un px con Leucemia se realizaron Microarrays y se encontró una expresión anormal de un gen, se comprueba con qRT-PCR. En la qRT-PCR se encuentra el resultado que esta subexpresado, ¿a que se se puede deber esto? Hipotesis: (^) Metilación del promotor (^) Gen heterocromatizado (^) lncRNA (^) Mutación en el gen codificante factores de transcripción (^) Transformación de gen a pseudogen.
Sin bisulfito: Cadena sintetizada: 5´CGACGACCTCGCCCGC 3´ Cadena Molde: 5´GCTGCTGGAGCGGGCG 3´ Con bisulfito Cambia en la cadena molde C por U y por lo tanto la sintetizada tendría un A en lugar de C. Cadena Molde: 5´GCTGCTGGAGCGGGCG 3´ Cadena sintetizada :5´CAACAACCTCACCCGAC 3´ Hipotesis (^) Metilación del promotor: es incorrecta porque hay cambio por el bisulfito. (^) lncRNA: microarreglo o qRT-PCR (^) Mutación en el gen codificante factores de transcripción: Sanger (^) Transformación de gen a pseudogen: Sanger Caso 2 : Primers modificados para hacer match con la secuencia añadida con uracilos producidos de la reacción con bisulfito (promotor de gen de insulina que haya cambiado ).
Determinar si el ADN esta en Heterocromatina: CHIP ( chromatin inmunoprecipitation) Anticuerpos contra histonas. Extracción de ADN incompleta, se mantienen sus proteinas.
- Hago Reads
- Incubar la cromatina con anticuerpos antihistonas (acetiladas y desacetiladas) Acetilidas:
- El anticuerpo anti-histonas acetiladas (eucromatina) se precipitan.
- El sobrenadante es ADN no acetilado (heterocromatina). Proceso inverso con anticurpos anti- desacetilo.
- Purifico el DNA que requiero (hetero o eucromatina) CHIP-seq NGS: secuencias asociadas a proteínas. Chip-Chip Microaareglo para cuantificar. cDNA marcado con flurocromo verde y lo hibrido en el microarreglo. Los pozos verdes estaban en eucromatina y los pozos que no brillan estaban en heterocromatina.
NOTA:
Metilación promotor: bisulfiyo; MeDIP (seq, chip) Heterocromatina (= histonas desacetiladas) : CHIP histonas, CHIP seq. lncRNA (microarreglos lcnRNA o RTqPCR) Mutación en un gen codificante o pseudogen (Sanger) Chip de proteínas
- Hago Reads
- Incubar la cromatina con anticuerpos
- El anticuerpo aanti-proteina especifica se precipitan.
- El sobrenadante es ADN sin proteinas.
- Purifico el DNA que requiero CHIP-seq NGS: secuencias asociadas a proteínas. Chip-Chip Microaareglo para cuantificar. cDNA marcado con flurocromo verde y lo hibrido en el microarreglo. Los pozos verdes teina proteinas y los pozos que no brillan estaban en heterocromatina. Ejemplos de enfermedades relacionadas con epigenoma anormal. Syndrome ICF: (Immunodeficiency/ centromeric instability/ facial anomalies) mutaciones en el gen DNMT3B que codifica para una ADN metiltrnasfersa. Síndrome ATRX (alpha thalassemia/ metal retardation, X- link) el gen alterado codifica para una helicas encorgada del remodelado de la cromatina. Síndrom de Rubistein- Taybi: alteración del gen que codifica la proteína CBP con actividad acetiltransfersa. Díndrome de Rett: alteración en gen MeCP2 que codifica una prteína encargada de silenciar los genes metilados. En cáncer: Patrones anormales dde metilación (genes supresores de tumores metilados y oncogenes no metilados) ENCODE y sitios de unión a proteínas 20% del genoma sirve para unión a proteínas (histonas, factores de transcripción, proteínas aisladoras…) 1,2 millones de regiones de metilación diferencial
