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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MORELOS
INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS BÁSICAS Y APLICADAS
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA, UNAM
“ Identificación de genes relacionados a la respuesta
hidrotrópica en maíz mediante estudios de asociación del
genoma completo (Genome-Wide Association Studies,
GWAS) ”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
PRESENTA
BIÓL. JESÚS JONATHAN MARTÍNEZ GUADARRAMA
DIRECTOR DE TESIS
DRA. DELFEENA EAPEN
CUERNAVACA, MORELOS AGOSTO, 2019
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- Justificación 42
- Hipótesis 42
- Objetivos 43
6.1. Objetivo general 43 6.2. Objetivos específicos 43
- Materiales y métodos 44
7.1. Material vegetal 44
7.2. Fenotipificación y clasificación de la respuesta hidrotrópica de la raíz primaria de maíz 44
7.3. GWAS para la respuesta hidrotrópica de maíz 52
7.4. Extracción de RNA 54
7.5. Selección del gen de referencia 56
7.6. Diseño de cebadores o “primers” 56
7.7. Síntesis de cDNA y PCR tiempo final 60
- Resultados 61
8.1. Análisis de asociación del genoma completo o GWAS. 61
8.2. Anclaje de SNPs y búsqueda de información en bases de datos 67
8.3. El efecto fenotípico de los SNPs entre híbridos robustos y débiles 75
8.4. Identificación del gen MIZ 1 en el GWAS de hidrotropismo de la raíz primaria de maíz 81
8.5. SNPs/Genes candidatos asociados a la respuesta hidrotrópica de la raíz primaria de maíz 84 8.6. Expresión de los genes candidatos asociados a la respuesta hidrotrópica 88
8.7. Comparación del GWAS con el análisis de ligamiento de QTLs para respuesta hidrotrópica de la raíz primaria de maíz.
- Discusión 95
- Conclusiones 103
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- Perspectivas 104
- Literatura citada 105
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16. Electroforesis en gel de agarosa (1% p/v) para mostrar la integridad del RNA extraído de raíces. 55 17. Imagen de electroforesis en gel de agarosa (2% p/v) para los genes candidatos. 58 18. Gráfica tipo Manhattan plot resultado del segundo GWAS realizado con los resultados de la fenotipificación de 231 híbridos de maíz DTMA.
19. Acercamiento de la gráfica tipo Manhattan plot de los 100 SNPs con mayor asociación a la respuesta hidrotrópica. 65 20. Gráfico cuantil-cuantil (Q-Q plot) para los SNPs de la respuesta hidrotrópica. 66
21. Ubicación de los 100 SNPs de acuerdo a su posición génica. 68
22. Porcentaje de SNPs por cromosoma. 69
23. Intensidad (mapa de calor) del efecto fenotípico de los SNPs asociados a la respuesta hidrotrópica para la población de híbridos DTMA.
24. Mapa de calor del efecto fenotípico de SNPs asociados a la respuesta hidrotrópica en híbridos débiles y robustos. 80
25. Posición de los SNPs en genes homólogos a MIZ1 en el GWAS de la respuesta hidrotrópica de maíz. 83
26. Imagen del gel de electroforesis en agarosa (2% p/v) que muestra la expresión constitutiva del gen FPGS. 89
27. Imágenes de geles de electroforesis en agarosa (2% p/v) para los genes NRT1.1 , NPH3 y EGY3.^89 28. Imagen del gel de electroforesis en agarosa (2% p/v) para el gen DUF1005.^91 29. Acercamiento de la gráfica tipo Manhattan plot de los 100 SNPs con mayor asociación a la respuesta hidrotrópica. 86 30. Comparación de crecimiento de raíces a las 6 y 24 horas en el sistema experimental. 94
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Índice de tablas
Tabla Pág.
1. Principales países productores de maíz 11 2. Clasificación de la respuesta hidrotrópica de acuerdo al ángulo de curvatura
3. Resultados obtenidos de la fenotipificación de los híbridos de maíz DTMA
4. Concentración obtenida para cada una de las muestra en las dos extracciones de RNA
5. Características de los “primers” utilizados para los genes candidatos asociados a la respuesta hidrotrópica
6. Condiciones en las cuales los PCRs amplificaron las secuencias de interés
7. Resultados del primer análisis de asociación del genoma completo realizado con el programa Golden Helix
8. Resultados del segundo GWAS de la respuesta hidrotrópica de híbridos de maíz DTMA
9. Numeración utilizada en las figuras de efecto fenotípico 77 10. Genes homólogos a MIZ1 en maíz 82
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- Introducción
La planta de maíz es el producto de una interesante y compleja mezcla de tres factores: la naturaleza, la evolución y la intervención humana. El maíz destaca de entre todas las plantas ligadas a nuestras tradiciones y dieta diaria debido a su origen mexicano. En México podemos encontrar una enorme variedad de maíz, tanto en tamaño, forma del grano y color, basta con visitar los mercados locales para darnos cuenta que tan diverso es nuestro maíz.
Debido a esta variabilidad genética presente en el territorio nacional Mexicano, numerosas investigaciones y hallazgos arqueológicos coinciden en que su centro de origen tuvo lugar en el país y que se originó a partir del teocintle (García y Arnaiz, 2006). Su domesticación y posterior distribución de América hacia el resto del mundo constituyó un importante hecho para toda la humanidad, ya que en la actualidad el maíz es el principal grano producido a nivel mundial. La producción internacional más significativa de este cultivo tiene lugar en 10 países, siendo Estados Unidos es el principal productor, mientras que México se encuentra en octavo sitio (FIRA, 2016). El consumo de este grano en el territorio nacional es muy elevado en comparación con el de otros países, debido a que durante mucho tiempo ha sido la principal fuente de alimentación en la población, sin embargo la versatilidad del maíz va más allá de la alimentación, a este cultivo se la han dado muchos usos, como la generación de biocombustibles, la utilización de sus aceites para fabricar pinturas o como componente de cosméticos, entre otros usos (SE, 2012).
En años recientes azotadoras sequías han provocado el deterioro en las condiciones de vida de cientos de personas en el mundo. México no ha sido exento de este fenómeno, principalmente en la zona norte del país se han registrado las sequías más intensas en los últimos años (Contreras-Servín, 2005; SEMARNAT, 2014). La falta de agua ha provocado la pérdida de miles de hectáreas de diversos cultivos, entre los que destaca el maíz al ser uno de los cultivos con mayores afectaciones por sequía. Como consecuencia la producción de este grano ha
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disminuido y el precio del maíz ha aumentado significativamente debido a que se tiene que importar más maíz para cubrir la demanda de la población y el déficit que las sequías ocasionan (CONAGUA, 2012).
El agua es vital para la vida y la falta de este recurso en cultivos agrícolas trae consigo severas consecuencias que en muchas ocasiones son irreparables, una consecuencia de este déficit es el estrés hídrico, que puede llevar a la pérdida total de cultivos. La raíz es el órgano vegetal encargado de anclar a la planta en el suelo y absorber agua, por lo cual el estudio de este órgano es primordial, de hecho se considera que la próxima revolución verde se centrará en el estudio y mejoramiento del sistema radicular (Den Herder et al., 2010). Una de las características que han sido poco estudiadas es la detección de gradientes de humedad, un factor muy importante que determina en gran medida la dirección del crecimiento de la raíz, y que puede emplearse como un mecanismo de evasión a sequía. El crecimiento de los órganos vegetales en dirección a un estímulo es conocido como tropismo y de acuerdo a su origen se clasifica en:
Tigmotropismo: originado en respuesta al tacto. Por ejemplo, los sarcillos de enredaderas y plantas trepadoras.
Gravitropismo: crecimiento hacia el vector de la gravedad. Por ejemplo, la raíz primaria de la mayoría de las plantas terrestres son positivamente gravitrópicas.
Fototropismo: crecimiento en dirección a la luz. Por ejemplo la parte aérea de las plantas crecen en dirección de la luz.
Hidrotropismo: crecimiento en dirección al agua o en respuesta a un gradiente de humedad. Por ejemplo, las raíces son muy susceptibles al cambio de humedad del suelo y son positivamente hidrotrópicas (Taiz et al., 2015).
El estudio de la respuesta hidrotrópica puede contribuir a disminuir en gran medida el efecto del estrés por sequía ya que las raíces con mayor capacidad de detectar gradientes de humedad crecen hacia las zonas donde se encuentra este recurso. Sin embargo, el estudio de la respuesta hidrotrópica no ha sido muy popular como
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En nuestro grupo de trabajo se fenotipificó la respuesta hidrotrópica de 283 híbridos de maíz DTMA (Drought Tolerant Maize for Africa) generados por el Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT). La fenotipificación se llevó a cabo en un sistema experimental diseñado con un gradiente de humedad generado por una solución higroscópica y un hidroestimulante (Figura 12). En la fenotipificación se clasificó la respuesta hidrotrópica en base al ángulo de curvatura como Robusta (crecimiento en dirección al hidroestimulante, con ángulos > 40°) o Débil (alejándose de la fuente de humedad, con ángulos < 39°) [Eapen et al., 2017]. Los resultados obtenidos a partir de la fenotipificación de la respuesta hidrotrópica de los híbridos DTMA en conjunto con los SNPs (proporcionados por CIMMYT) fueron utilizados para realizar el análisis tipo GWAS de la respuesta hidrotrópica de la raíz primaria de maíz mostrado en la presente tesis.
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- Marco teórico
3.1. Maíz
El maíz es una planta que ha evolucionado en conjunto con el desarrollo de las civilizaciones mesoamericanas, su importancia radica en figurar como una de las principales fuentes de alimentación. Existe una íntima relación entre la cultura Mexicana y la historia del maíz (Sánchez-Lacy, 2006), este cultivo ocupaba un lugar preponderante en la época prehispánica, era motivo de veneraciones, representaciones, mitos y dioses vinculados a ella; inclusive algunas civilizaciones crearon esculturas y pinturas que el día de hoy nos recuerdan el impacto que el maíz causó en su vida, por ejemplo, para los Mayas, el maíz fue más que una fuente de alimentación, esta civilización consideraba que el maíz fue un regalo que los dioses le hicieron a la humanidad y que cultivarlo y cuidarlo era un deber sagrado. Lo tenían en tan alta estima que lo simbolizaban con piedras preciosas como el jade, incluso, según el libro Popol Vuh (1960), después de varios intentos fallidos con barro y madera, la esencia, cuerpo y alma del hombre maya fue creada a partir de masa de maíz; en pocas palabras, el maíz creó esta brillante civilización (Asturias, 2004). Existen códices donde se plasma al maíz con características animales y vegetales, tal vez en representación de su fertilidad y su íntima relación con la humanidad. En otras civilizaciones como la Mexica, la Tolteca y la Olmeca, existieron deidades que hacían referencia al maíz, como la diosa Xilonen y el dios Centéotl, a quienes se les reconoce como la diosa del maíz y el creador del maíz respectivamente (Pérez-Suárez, 2001). Simplemente el maíz formó parte importante de la cultura mexicana, tanto así, que hoy en día sigue siendo la base de la alimentación de los mexicanos.
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El sistema radicular del maíz se compone de varias clases de raíces: la raíz primaria, raíz seminal (que se origina en los primeros días de germinación como se ilustra en la Figura 2), está representada por un conjunto de una a cuatro raíces de origen embrionario, a partir de estas se desarrollan las raíces laterales de segundo y de tercer orden que constituyen prácticamente todo el sistema radicular y pueden llegar a alcanzar hasta dos metros de profundidad. Por encima del suelo se encuentran las raíces de sostén o soporte, las cuales se originan en los nudos del tallo (raíces coronarias) muy cerca de la superficie del suelo, éstas raíces le confieren a la planta estabilidad y disminuyen los problemas de acame (Lesur, 2005).
Figura 1. Esquema de la planta de maíz (Adaptado de http://www7.uc.cl/sw_educ/cultivos/cereales/maiz.htm).
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Figura 2. Imágenes del tipo de raíces en plántulas de maíz a los (a) 2 días, (b) 3 días, (c) 4 días, (d) 5 días y (e y f) 7 días después de la germinación. C) coleoptilo; CN) nodo del coleoptilo; CO) coleorriza; FL) primera hoja; M) mesocotilo; NR) raíz nodular; RP) raíz primaria; S) escutelo; SL) segunda hoja; SSR) raíz seminal escutelar (Tomado desde Singh et al., 2010).
La polinización del maíz se realiza con ayuda del viento (anemófila), los granos de polen pueden viajar de 100 a 1000m de distancia, el polen cae sobre los estilos, donde germina y avanza hasta llegar al ovario; cada ovario fecundado crece hasta transformarse en un grano de maíz, por lo tanto cada grano es un individuo con su propio material genético. En la mazorca cada grano o semilla es un fruto independiente llamado cariópside que está insertado en el raquis cilíndrico u olote; la cantidad de granos producidos por mazorca está limitada por el número de granos por hilera y de hileras por mazorca. Como cualquier otro cereal, las estructuras que constituyen el grano del maíz (pericarpio, endospermo y embrión) le confieren
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Tabla 1. Principales países productores de maíz en el periodo 2015/16 y una proyección a la producción del ciclo 2016/17 (las cantidades mostradas corresponden a millones de toneladas, cada periodo corresponde de Octubre de un año a Septiembre del año siguiente) [USDA, 2016].
País 2015/16 2016/ Estados unidos 345.5 382. China 224.6 216 Brasil 67 83. Unión europea 58.5 60. Argentina 28 36. Ucrania 23.3 26 India 21.8 24. México 25.8 24. Rusia 13.2 14 Sudáfrica 7.9 13 Otros países 143.6 144. Total Mundial 959.5 1,025.
3.1.3. Producción y consumo de maíz en México.
La República Mexicana produjo 25.8 millones de toneladas de maíz en el ciclo agrícola 2015/16 (USDA, 2016). Representa la principal fuente de alimentación para algunas familias mexicanas y es el único grano de importancia agrícola producido en todos los estados del país (al menos para autoabasto). El consumo per cápita del maíz en México oscila entre 123 kg anualmente, cifra muy elevada en comparación con el promedio de la población mundial de 16.8 kg (AgroDer, 2012). Debido al alto consumo, la producción de maíz en México no satisface la demanda exigida por la población, por lo que se tienen que importar entre 8 y 12 millones de toneladas de maíz cada año, convirtiendo al país en el segundo comprador más grande de maíz en el mundo (después de Japón), siendo Estados Unidos el principal proveedor de este grano (FIRA, 2016). Lo anterior ha convertido a México en uno de los principales mercados de maíz en el mundo, tanto por su producción como por su consumo.
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El consumo de este grano en el país está dividido por diversas variedades y razas, en las que destacan principalmente el maíz blanco y el amarillo (91 y 9% respectivamente). El maíz blanco es utilizado básicamente para consumo humano, tiene una gran versatilidad dentro de la gastronomía tradicional mexicana, prácticamente no hay día que los mexicanos no consumamos algún producto elaborado a base de este grano. Por su parte el maíz amarillo es utilizado principalmente para alimentación humana, alimentación animal y en el sector industrial (FIRA, 2016).
El precio del maíz se había mantenido constante hasta 2006, la tasa de aumento en los costos de dicho cultivo no era muy significativa, pero hasta dicha fecha el maíz empezó mostrar un incremento en su costo, el ascenso continuó hasta el año 2011 cuando el Departamento de Agricultura de Estados Unidos declaró que el maíz había alcanzado su máximo precio, de igual manera, en años posteriores el alza en precio del maíz ha ido incrementando (FIRA, 2016). Con el aumento en los costos internacionales del cultivo más importante para los mexicanos, la economía de muchas familias y en general del país se ha visto afectada (SE, 2012).
3.2. Sequía.
Una de las catástrofes capaz de modificar en gran escala el ambiente de una región es la sequía. Sus efectos más alarmantes y fatales se manifiestan en el deterioro de las condiciones de vida de los habitantes y en el daño a los ecosistemas naturales. La sequía es una condición normal y recurrente del clima que ocurre o puede ocurrir en todas las zonas climáticas, aunque sus características varían significativamente de una región a otra (Contreras-Servín, 2005).
La sequía específicamente puede definirse como un conjunto de condiciones ambientales atmosféricas de muy poca humedad que se extiende durante un periodo suficientemente prolongado para que la falta de lluvias cause un grave
