Prepara tus exámenes y mejora tus resultados gracias a la gran cantidad de recursos disponibles en Docsity
Gana puntos ayudando a otros estudiantes o consíguelos activando un Plan Premium
Prepara tus exámenes
Prepara tus exámenes y mejora tus resultados gracias a la gran cantidad de recursos disponibles en Docsity
Prepara tus exámenes con los documentos que comparten otros estudiantes como tú en Docsity
Encuentra los documentos específicos para los exámenes de tu universidad
Estudia con lecciones y exámenes resueltos basados en los programas académicos de las mejores universidades
Responde a preguntas de exámenes reales y pon a prueba tu preparación
Consigue puntos base para descargar
Gana puntos ayudando a otros estudiantes o consíguelos activando un Plan Premium
Comunidad
Pide ayuda a la comunidad y resuelve tus dudas de estudio
Ebooks gratuitos
Descarga nuestras guías gratuitas sobre técnicas de estudio, métodos para controlar la ansiedad y consejos para la tesis preparadas por los tutores de Docsity
Este documento aborda el tema de la distribución de snps (polimorfismos de un único nucleótido) en el genoma humano, sus características y métodos de genotipado. Se incluyen detalles sobre la identificación, análisis y detección de snps, así como sus aplicaciones en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades, personalización de tratamientos farmacológicos y predicción de respuesta individual a fármacos.
Tipo: Apuntes
1 / 21
Esta página no es visible en la vista previa
¡No te pierdas las partes importantes!
TEMA 4a. DETECCIÓ D’SNPs
Enric Fernández Mail: [email protected] Despatx: C3-029 (Dilluns 11-13h)
4.Detecció d’SNPs 5.Hibridacions específiques d’al·lel i microarrays 6.Detecció de noves mutacions en gens d’interès
Polimorfismes:
VNTR (STR) RFLP
Delecions Insercions
Reordenaments cromosòmics
RFLP: Restriction fragment length polymorphisms •Variacions de seqüències de dianes especifiques •Baixa freqüència •Distribució no homogènia •Baix número d’al·lels
VNTR (minisatel·lits): Variable number tandem repeats •Repetició en tàndem de seqüències de unes desenes de bp. •106 predits a tot el genoma humà. •Distribuïts de forma discreta, a llocs concrets del genoma. •Utilitzats per proves forenses.
STR (microsatel·lits): Short tandem repeats •Repeticions en tàndem de 2-5 bp. •Alta freqüència (descrits alguns milers). •Distribució homogènia en tot el genoma •Presenten un gran número d’al·lels amb freqüències similars •Alta heterozigosi
Polimorfismes d’un únic nucleòtid (SNPs) •Els polimorfismes més freqüents del DNA són els SNPs (polimorfisme d’un únic nucleòtid) GTGGACGTGCTT[G/C]TCGATTTACCTAG •1 SNP cada 200-300bp •Baixa tassa de mutació: 10-8-10- •Típicament bial·lèlics (es poden trobar en freqüències properes al 50%) •Distribuïts per tot el genoma –Regions codificants –Regions no codificants
•Molts d’SNPs se troben associats a variacions fenotípiques –Predisposició a malalties –Susceptibilitat a factors ambientals –Resposta a fàrmacs –Caracterització genètica
Ús d’encebadors específics:
Algunes modificacions en les PCR especifiques d’al·lel
ARMS multiplex (pacients de fibrosi quística)
Multiplex ARMS test to detect 12 cystic fibrosis mutations Set A amplifies DNA containing the 1717-G>A, G542X, W1282X, N1303K, F508del or 3849 +10kbC>T mutations Set B amplifies DNA containing the 621+1G>T, R553X, G551D, R117H, R1162X or R334W mutations and the normal alleleof F508del. Each product is a different size, so the nature of any mutation is revealed by the position of the band in the gel. Each tubealso amplifies two control sequences. Normal alleles of mutations other than F508del are not tested for. Sample 1: heterozygousfor F508del sample 3 is a compound heterozygote F508del / 1717-1 G>A sample 7 includes G542X (homozygousor heterozygous).
MSP (PCR específica de metilació)
Anàlisi de les corbes de fusió amb SYBR Green I
Anàlisi de les corbes de fusió d’alta resolución (HRM)
forward primer ; AAC TTG GCT TTA ATG GAC CTC CA reverse primer ; ACA TTC ATC CTT ACA TGG CAC CA amplicon sequence ; AAC TTGGCT TTA ATGGAC CTC CAA TTT TGA GTG TGC ACA AGC TAT [W]GA ACA CCA CGTAAG ACA TAA AAC GGC CAC ATA TGG TGC CATGTA AGG ATG AAT GT, where W is the IUPAC code for an A to T substitució.
Sondes d’hibridació (posibilitat de distingir diferents SNPs en la mateixa reacció, cada una tindrà una Tm diferent) Anàlisi de les corbes de fusió (melting)
La pendent de la corba de fusió ens indica la facilitat d’hibridació del DNA. La funció no depèn directament de la temperatura.
Detecció de mutacions en NAT
Polimorfisme:-acetiltransferasa 2
sonda y la sonda incorrecta destabilisationof
TaqMan SNP genotyping:
No digereix:
Digereixllum:
Molecular Beacons:
És una sonda que conté SNP en forma de loop (target=DNA problema) Comprobem si la complementarietat amb el DNA és suficient per trencar el pont format en la molècula Beacon (entre l’extrem 3’ i 5’). Si és completament complementari es trenca el pontseparats el quencher i la molècula emisorasenyal. Les sondes que no s’uneixen (homozigot) no donen senyal. Això es fa en fase d’hibridació (la TaqMan s’usa en fase d’elongació.
Scorpion primers: Es basa en la autocomplementarietat. El primer té la seqüència del DNA que polimeritzem de nou, incluint l’SNP i un fluorocrom. A part, dissenyem una seqüència complementària a la seqüència extra del primer amb l’al·lel contrari i amb fluorocrom.
Aplicacions de la PCR a temps real:
▲ Determinació de la identitat en loci HLA altament polimòrfics
▲ Seguiment posterior al transplantament d’òrgans.
▲ Seguiment del quimerisme després del HSCT
▲ (^) Control de restes de la malaltia després del HSCT
▲ Genotipatge (discriminació al·lèlica)
Diferents estratègies amb diferents combinacions:
▲ Discriminació
▲ (^) Detecció/identificació
▲ Format
Discriminació dels al·lels d’un SNP:
Diferents estratègies amb diferents combinacions
BeadArray technology Arrays d’alta densitat amb sondes d’oligonucleòtids adherís en superficie: (a)Sentrix Array Matrix 96/384/1536 pouets (b) Sentrix BeadChip 16
Microarrays and fluorescence detection
Miniseqüenciació:
Elements necessaris per a la piroseqüenciació
S’afegeix a la reacció el primer dels desoxinucleotids trifosfat (dNTP). La polimerasa de DNA catalitza l’icorporació del desoxirribonucleotid al DNA si és complementari a la cadena motlle. Cada incorporació va acompanyada de l’alliberament d’un pirofosfat (PPi) en quantitat equimolar a la quantitat de nucleotid incorporat.
Exemple de pirograma:
L’altura dels pics ens indiquen quantes bases iguals seguides hi ha. Si hi ha un SNP, la intensitat del pic será intermitja. Els pics petits son bacground. En aquest exemple no hi ha SNPs.
amb el DNA diana.
un “nick” entre ells.
increment lineal dels productes de lligació. Lligació de dos oligonucleòtids adjacents per aparellament perfecte. L’extrem 3’ de l’oligo ha de coincidir amb a posició d’SNP. Generem 2 sondes per aquest oligo (A i T). Per detectar aquest sistema, podem usar la TaqMan, la PCR específica d’al·lel, sondes d’hibridació (FRET), ...
dels productes de lligació pot ser exponencial.
següent ronda de lligació.
a l’oligo comú.
posterior detecció per fluorescència.
polimòrfics.
reconeixen seqüències adjacents en el DNA diana.
específics.
si hi ha lligació --> circular si no hi ha lligació --> lineal: no amplificarà perquè la polimerasa no pot fer la volta sencera, amplifica linealment però no exponencialment. Assaig “invader”: usa l’efecte que té la unió específica en l’estructura secundària.
Base: reconeixement d’una estructura específica que digereix una endonucleasa: “clavasa”. Es requereixen dos oligonucleòtids:
▲ Avantatges de l’assaig invader:
