manual prácticas, Ejercicios de Biología

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Prácticas Prácticas

1º curso Gra 1º curso Gra dd o deo de

Biolo Biolo gg íaía USCUSC

Curso 20 14 - 2015

Coordinador : Óscar J. Cordero

1. MANEJO DE REACTIVOS,

APARATOS BÁSICOS,

PREPARACIÓN DE

SOLUCIONES, Y

BIENESTAR ANIMAL

(código calendario de prácticas: FA)

SOLUCIONES,…

INSTRUMENTOS BÁSICOS DE MEDIDA

BALANZAS DE LABORATORIO Y PIPETAS

1. Objetivo

1.1 Consideraciones prácticas y manejo de una balanza de precisión de calibración externa.

1. 2 Consideraciones prácticas y manejo de pipetas. Pipetas automáticas, fijas y variables. Pipetas repetitivas

2. Introducción

La fisiología y otras ramas de la biología son ciencias cuantitativas que requieren de un sistema de medición estandarizado (SI: sistema internacional de unidades) e instrumentos de medición precisa. 2.1 Balanzas de laboratorio Uno de los instrumentos de medida más usados en el laboratorio es la balanza, utilizada para medir cantidades pequeñas de masa. La masa, propiedad característica de los cuerpos, es la cantidad de materia de una sustancia o material. Concepto diferente al de peso: fuerza de la atracción gravitatoria que la Tierra ejerce sobre la materia. La balanza compara la masa desconocida de una sustancia con la masa de un patrón o patrones de referencia (internos o externos), sometidas ambas a la misma aceleración debida a la gravedad. Al proceso de comparar masas se denomina pesada. El rasgo que define a las balanzas de laboratorio es el de la precisión junto al de alta resolución. Una vez calibradas, tienen también un alto grado de exactitud.

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Exactitud : grado de concordancia entre el valor real y el valor medido. Precisión : capacidad de dar el mismo resultado en mediciones diferentes realizadas en las mismas condiciones. Grado de concordancia o repetitividad de un resultado. Una balanza será precisa cuando diferentes medidas de una misma magnitud sean muy parecidas. Una medida común de la variabilidad es la desviación estándar de las mediciones. Resolución: incremento de peso más pequeño que permite diferenciar una medida de otra Legibilidad: división más pequeña en la pantalla de la balanza 2 .1.1 Tipos de balanzas Las balanzas de laboratorio varían en su capacidad máxima de carga y en su legibilidad, y se clasifican como

1. Microbalanzas: capacidad de 0,5-3 g; legibilidad de 0 , 001 mg
2. Balanzas semimicro: capacidad 30 - 150 g, según la casa comercial, y legibilidad de 0 , 01 mg
3. Balanzas analíticas: 60 - 250 g y legibilidad de 0, 1 mg
4. Balanzas de precisión: capacidad de carga de 80 - 600 g; legibilidad 0, 001 g- 0,1 g Microbalanza Balanza analítica Balanzas de precisión Algunas balanzas, del tipo 2-4, tienen capacidad y legibilidad dual: pueden aumentar su capacidad disminuyendo su legibilidad o disminuir su capacidad y aumentar su legibilidad.

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2 .2 Pipetas En el laboratorio, la medición precisa del volumen es tan importante como la medición precisa de la masa. La medición fiable del volumen se realiza con una pipeta, una bureta o un matraz aforado. Las pipetas permiten la transferencia de volúmenes medidos exactamente de un recipiente a otro. 2 .2.1 Tipos de pipetas de uso común en el laboratorio

1. Aforadas : transfieren un sólo volumen fijo, las hay desde 0.5 a 200 mL
2. Graduadas : transferencia de 0.1 a 50 mL Ambas se llenan hasta la marca de calibración. La superficie alta de un líquido contenido en un tubo estrecho presenta una marcada curvatura o menisco. Es una práctica común usar la parte inferior del menisco de los líquidos acuosos como el punto de referencia en la calibración y empleo de las pipetas. El llenado de las pipetas nunca se debe de hacer aspirando con la boca. Existen accesorios auxiliares para macropipeteado que facilitan la operación de carga y descarga. La transferencia se realiza apoyando la pipeta en el borde del recipiente recibidor y nunca se sopla el líquido residual. Aspirador Macro de Brand Pipeta aforada Aspiradores de seguridad Pipeta graduada^ Dentalab

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Ejercicio 2. Manejo de aspiradores de seguridad de pipetas de la casa Dentalab.

1. Aspiración: Gire la rueda hacia arriba y aspire, sin producir burbujas, hasta situarse un poco por encima de la marca de calibración. Desplace lentamente la rueda en sentido contrario para el ajuste de la pipeta. Preste atención al menisco.
2. Vaciado: Presionar la palanca una vez que la pipeta esté dentro del tubo o recipiente recibidor.
3. Pipetas automáticas: micropipetas y macropipetas a) Micropipetas: transferencia de volúmenes de microlitros de líquido

• monocanal de volumen fijo: único volumen de transferencia, existen distintas pipetas que cubren el intervalo entre 1 L y 100 0 L
• monocanal de volumen variable: elección del volumen de transferencia mediante desplazamiento de un micrómetro de ajuste localizado en la parte delantera o superior del dispositivo. Poseen un indicador del volumen seleccionado Con un número reducido de aparatos se cubre el intervalo entre 0,1 L y 10 00 L
• multicanal: igual que la anterior pero dispensando 4, 8 ó 12 veces simultáneamente el mismo volumen. Intervalo entre 0,5-300 L Monocanal fija y variable Multicanal y variable Micrómetro Indicador de volumen

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Ejercicio 4. C omprobación del pipeteo por medida gravimétrica (balanza Denver Maxx).

1. Utilice una pipeta de 1 mL fija o variable 2. Utilizar como líquido de transferencia agua destilada 3. Situar un vaso de precipitados de 25 mL sobre la balanza y ajustarla a cero 4. Pipetear en el vaso un mililitro 5. Anote su masa 6. Vuelva a tarar la balanza y añada 1 mL más 7. Anote su masa 8. Repita la operación hasta completar 5 muestras 9. Cambie la pipeta con un compañero e inicie el proceso desde el punto 3 - 8 El uso de pipetas automáticas exige una comprobación regular de la exactitud y precisión de las mismas Exactitud: indicada por E = diferencia entre el valor medio y el valor nominal referida al valor nominal en % El control de la exactitud se realiza mediante control gravimétrico y aplicando un factor de corrección Z Z = 1,0032 L/mg si el control se realiza a una temperatura de 21,5 ºC a una presión atmosférica de 1013 mbar y con agua destilada Precisión: indicada por el coeficiente de variación y definido éste como la desviación estandard en %, referida al valor medio. Ejercicio 5. Simulación del control de la exactitud de la pipeta automática de 1 mL, utilizando los datos obtenidos en el ejercicio 4

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4. Pipetas automáticas repetitivas En el laboratorio se dispone también de pipetas automáticas repetitivas para la dosificación en serie o para situaciones que requieren transferencia repetida de un volumen particular Ejercicio 6 : Manejo de una pipeta repetitiva Permite dosificar repetitivamente un volumen determinado con una sola carga El número de repeticiones depende del volumen seleccionado en el mando deslizante de ajuste y del combitip corespondiente (ver tabla 1) Mando selector de volumen Palanca de dosificación Palanca de bloqueo y de llenado combinados Tabla 1

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Conector Cable Cabezal Orificio de relleno Electrolito interno: HCl 0,1M saturado con AgCl Membrana de vidrio: sensible a H 3 O+ Elemento de referencia: cristales de AgCl encapsulados y con barrera a iones Ag+ Diafragma: punto de unión entre electrolito y muestra. De cerámica porosa, que permite un pequeño flujo de electrolito hacia el exterior estableciendose el circuito eléctrico para medición Electrolito de referencia: (KCl 3M) puente salino entre el electrodo y el exterior. Impide que los componentes de la disolución objeto de medida se mezclen con los del electrodo de referencia. Tipos de elementos de referencia Electrodo con sensor de temperatura Tipos de electrodos Para micromuestras De penetración De superficie Para emulsiones

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3. Consideraciones prácticas 1. Si el electrodo de pH es rellenable, verificar el nivel de electrolito de referencia. Éste debe llegar cerca del orificio de llenado, asegurando un buen flujo de electrolito a través del diafragma. 2. Verificar la ausencia de burbujas de aire en la zona de la membrana, si se observa alguna sacudir el electrodo cuidadosamente 3. Limpiar el electrodo con agua destilada. No secar con un paño, utilizar un papel sin pelusa, aplicándolo suavemente para evitar cargas electrostáticas, y retirar el exceso de agua 4. Si las mediciones se realizan a temperatura ambiente sumergir el electrodo hasta cubrir como mínimo el diafragma 5. Si las mediciones se realizan a temperatura distinta de la ambiente sumergir el electrodo hasta cubrir el sensor de temperatura y el elemento de referencia. 4. Calibración 1. Se recomienda una calibración diaria antes de proceder a las mediciones. Si se realizan muchas es aconsejable repetir la calibración cada 2 ó 3 horas, para compensar la posible deriva del electrodo (potencial de asimetría) o una pérdida de sensibilidad del mismo (pendiente)

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DISOLUCIONES Y CONCENTRACIONES

DISOLUCIONES STOCK, DISOLUCIONES DE TRABAJO, DISOLUCIONES TAMPÓN

1. Objetivo

1.1 Consideraciones prácticas y preparación de disoluciones usadas en la experimentación 1.2 Preparación de una disolución tampón y medida del pH

2. Introducción

La experimentación biológica utiliza técnicas de laboratorio que pueden ser de observación, analíticas y /o bioensayo. El bioensayo puede realizarse in vivo , utilizando organismos intactos, o in vitro, utilizando órganos, tejidos o suspensiones de células aisladas. El bioensayo es una técnica muy utilizada en Fisiología Animal. Los estudios requieren habitualmente el uso de disoluciones cuya concentración iónica y osmolaridad mantengan la integridad y funcionalidad celular, y en los in vitro , además, que la disolución esté tamponada. Es decir, que contenga un sistema tampón o buffer para amortiguar las variaciones de pH que pudieran producirse a lo largo de un trabajo experimental, al igual que hace el plasma.

3. Disoluciones y concentraciones En el laboratorio la concentración de las disoluciones se expresa de dos formas: concentración molar o concentración porcentual. Concentración molar , es el nº de moles de una especie contenida en un litro (1L) de disolución. Unidad de concentración molar = molaridad (M), dimensiones mol.L-^1 o mmoles.mL-^1 de disolución. 1 mmol = 10-^3 mol Concentración porcentual (partes por cien): tres formas de expresarla a) tanto por ciento en peso (p/p): peso del soluto. peso de la disolución -^1. 100

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b) tanto por ciento en volumen (v/v): volumen del soluto. volumen de disolución-^1. 100 c) tanto por ciento en peso/volumen: peso del soluto (g). volumen de la disolución (mL)-^1. Ejercicio 1. - Preparar 100 mL de NaCl 154 mM

- Preparar una disolución de NaCl 0.9% (p/v) ¿Qué observación destacaría?.............................................................................

4. Disoluciones madre y disoluciones de trabajo

En el laboratorio, es habitual preparar las disoluciones de trabajo a partir de disoluciones concentradas, a las que se les llama disoluciones madre o disoluciones stock. Las disoluciones stock, además de proporcionar rapidez, disminuyen los posibles errores que se producirían durante continuas pesadas de los componentes de las disoluciones de trabajo. Para preparar disoluciones diluidas a partir de las concentradas se utiliza la siguiente ecuación, la cual se basa en que el nº de moles de soluto de la disolución diluida es igual al de moles en el reactivo concentrado.

Vconcentrada. Moles/L concentrada = Vdiluida. Moles/Ldiluida, , es decir

V 1 .C 1 = V 2 .C 2

Volumen en litros y concentración molar en moles/L O volumen en mL y concentración molar en mmoles/mL Ejercicio 2. Tomando como disolución stock la de NaCl 1 M, calcular el volumen que habría que tomar para preparar 10 mL de NaCl 150 mM