Análisis
Aplicaron la sPMCA para la detección en vitro de PrPsc en leche de oveja
Obtuvieron leche fresca de ovejas individuales → 7 días después del parto
En la 48 h siguientes se almacenó a -80°C
Luego de descongelarla le agregarón EDTA, Nonidet P-40, y desoxicolato de sodio a concentraciones de 50 mM, 0.5% (vol/vol), y 0.5% wt/vol,
respectivamente
Muestras de 1ml se centrifugaron a 16,000 X g
Luego la enfriaron en hielo por 5 min para extraer el sobrenadante de leche clarificada
Dicho sobrenadante se diluyó 1 en 10 en sPMCA hasta un volumen de 100 ul
Muestras de 0.2 ml, contenidas en tubos de PCR, se sumergieron a un baño de agua ultrasónico
Luego se añadió agua hasta sumergir el cuerno del sonicador (Agua a 37°C & y sonicaciones cada 40 s a 200W)
Las sonicaciones se repitieron 1 vez cada 30min por 24h
Luego las muestras se diluyerón 1 en 3 en sPMCA hasta un volumen de 100 ul (para más rondas de sPMCA)
En total realizaron 576 sonicaciones en 12 días
Para luego analizar 10 ul de cada muestra mediante la técnica, transferencia Western usando geles BisTris
EXPERIMENTO
•PrPsc (prión) es el probable agente infeccioso → se distribuye por el sistema nervioso central (SNC) & tejidos linforreticulares (LRS)
•Ovejas infectadas con EEB muestran una distribución tisular de PrPsc similar a la del prurigo lumbar ovino
•Para la tembladera adaptada a roedores & la CWD, el agente infeccioso se detecta en las heces durante etapas clínica de la
enfermedad
•Evidencia demuestra que la leche es un vehículo para la transmisión de enfermedades priónicas
•Ovejas afectadas por tembladera, propagan PrPsc dentro del LRS de ovejas sanas a las que alimentan
•Bioensayo con ratones demostró infectividad por tembladera en la leche, meses antes de manifestación de signos clínicos. Estos
ratones contenían en su LRS cantidades considerables de PrPsc detectado inmunohistoquímicamente (IHC)
Antecedentes-investigaciones
la amplificación cíclica de
plegamiento incorrecto de proteínas
en series (sPMCA), técnica
PrPsc → prion, agente infeccioso
(PrPc es la proteína normal)
Enfermedades causadas por piones
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. →
en humanos
La tembladera, conocida como
scrapie o prurigo lumbar → afecta a
ovejas y cabras
emaciación crónica del cervine
(CWD) → en ciervos
La encefalopatía espongiforme
bovina (EEB)→ en ganado bovino
Basándonos en este artículo, podemos
concluir:
•El nombre de las enfermedades por
priones es específico para cada
especie no es lo mismo una CWD
(ciervos) que una EEB (ganado
bovino)
•Se da una infección directa por
priones durante el nacimiento del
cordero a partir de una oveja con
tembladera
•El prion se encuentra en fluidos,
como la leche por eso los corderos
pueden infectarse si la consumen de
una oveja infectada (también
presentes en sangre)
•Los tiempos de inoculación de un
PrPsc son de entre 21-39 meses
•Gracias a la técnica sPMCA, que
apoyada con la IHC permiten
detectar la presencia de PrPsc en la
leche incluso antes de que la oveja
presente síntomas de la enfermedad
•
Además, ningún animal afectado por la
tembladera presentó mastitis, lo que significa que
la acumulación de PrPsc en el tejido mamario no
es requisito para el paso de PrPsc a la leche
Mediante ensayos IHC post mordem
demostraron que animales expuestos a
tembladera secretan PrPsc en la leche aunque no
hayan sido confirmados como positivos para la
enfermedad
Sus evidencias sugirieron que el PrPsc se produce
en células epiteliales en tejido mamario y que su
secreción se da por exocitosis hacia la leche
Determinaron que animales infectados con
priones, albergan PrPsc en sangre por lo que su
leche también al combinarse con componente
sanguíneos
Concluyen que además de la transmisión lateral,
de oveja a cordero, estos son fuentes de
transmisión de tembladera durante los primeros
meses de vida
Tanto la leche como productos lácteos, no
transmiten la tembladera a humanos o al menos
no hay evidencia de ello
Mencionan que la distribución de PrPsc no
detectable por IHC en la EEB bovina es de
importancia para futuras investigaciones por la
importancia de la leche bovina en la dieta
humana
Hallazgos
Todos los animales con tembladera fueron introducidos en el rebaño Ripley
Ryder informó que todos los animales desarrollaron tembladera con tiempos de incubación 21-28 meses (genotipo; PrPsc VRQ / VRQ) y 28-39
meses (genotipo; ARQ / VRQ)
El 77% de los animales ARQ / VRQ tenían prurigo lumbar asintomático 24-30 meses después de que se introdujeron, lo detectaron por análisis IHC
También detectaron PrPsc en la leche del 92 % de animales afectados & un 78% en ovejas normales expuestas a tembladera
Tras más análisis de muestras positivas y negativas simultáneamente durante el procedimiento de sPMCA notaron que el PrPsc amplificado a
partir de muestras de animales expuestos a tembladera no era de manera espontánea ni a contaminación cruzada durante el procedimiento
Los investigadores mencionan que los priones se derramaron en la leche de animales clínicamente sanos con múltiples genotipos de PrPsc, siendo
el ARQ / VRQ quien presenta un nivel alto de infectividad de la enfermedad
Bibliografía
Conclusiones del grupo
(1)PRIÓN: UN AGENTE INFECCIOSO QUE CAUSA
CONMOCIÓN EN LA COMUNIDAD CIENTÍFICA. Scielo. 2017
Aug; 41(1).
(2)Código Sanitario para los Animales Terrestres. OIE.
[Online].; 2019 [cited 202 11 19. Available from:
https://www.oie.int/fileadmin/home/esp/health_standard
s/tahc/current/chapitre_scrapie.pdf.
(3)OSCAR FLORES-HERRERA FMYJPP. EL PLEGAMIENTO DE
LOS PRIONES*. REB. 2019 Jan; 22(1).
(4)B. C. Maddison 1CABHCRLATLTSJB. Prions Are Secreted
in Milk from Clinically Normal Scrapie-Exposed Sheep.
JOURNAL OF VIROLOGY. 2019 August; 83(16).
LOS PRIONES SE SECRETAN EN LA LECHE DE OVEJAS CLÍNICAMENTE NORMALES
EXPUESTAS A LA TEMBLADERA
Grupo 1
Integrantes
Lizbeth Vicente
Alejandro Toaza
Alisson Bermeo
Janela Campaña
Daniela Ortiz
José Espinoza
Curso: 3°“B”
